一种基于miRNA491调节DAT基因表达的方法
【专利摘要】本发明涉及一种调节细胞中的多巴胺转运体基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：提高所述细胞中的微小RNA?491(miRNA?491)(SEQ ID NO:1)量从而下调所述DAT基因的表达；或降低所述细胞中的miRNA?491量，从而上调所述DAT基因的表达。miRNA?491在制备调节人细胞摄取多巴胺的药物中的用途。一种用于调节人细胞摄取多巴胺的组合物，其包含miRNA?491或其抑制剂，以及药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中的一种或多种。
【专利说明】
一种基于mi RNA491调节DAT基因表达的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学和医药领域。更特别地，涉及调节多巴胺转运体(DAT)的基 因表达的微小RNA(miRNA)。
【背景技术】
[0002] 多巴胺是中枢神经系统最重要的神经递质之一，通过激活多巴胺受体，参与运动 调节、情感、认知、药物成瘾、神经内分泌调节等生命活动。再摄取是神经递质通过突触前膜 从突触间隙消除的正常机制，精神活性物质作用的一个重要机制是阻断神经递质从突触前 膜释放后的再摄取。阻断再摄取，神经递质的正常效应被放大。多巴胺转运体介导的细胞膜 钠依赖性再摄取过程实现多巴胺信号的终断，这对神经细胞多巴胺稳态的维持发挥着至关 重要的作用。DAT基因3 ' UTR含有3至11个拷贝的可变数目串联重复序列(VNTR)，VNTR拷贝数 的变化与特发性癫痫、注意力缺陷多动障碍、酒精和可卡因依赖、帕金森病易感性以及抵抗 尼古丁依赖的保护作用等关系密切。
[0003] miRNA是一类高度保守的单链非编码小RNA，由约20-22个单核苷酸组成，广泛存在 于真核生物中，参与转录后水平或翻译水平的调控。miRNA在真核生物基因调控中起着重要 作用，广泛参与细胞增殖、分化、发育、代谢、凋亡以及其他多种生命活动。miRNA具有高度保 守性、时序性和组织特异性等特征，通过与靶基因不完全互补结合，一种miRNA可调节多种 靶基因表达。目前，已在人体内发现数百种miRNA并已知其序列。
[0004] 本发明正是通过寻找参与神经细胞摄取多巴胺的基因调控通路中的miRNA，并调 节神经细胞中这样的miRNA的量来实现调节神经细胞对多巴胺的摄取进而调节神经细胞中 的多巴胺的量。
【发明内容】
[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006] -种调节细胞中的多巴胺转运体(DAT)基因表达的方法，其特征在于，包括提高所 述细胞中的微小RNA-491 (miRNA-491)(SEQ ID NO: 1)含量从而下调所述DAT基因的表达;或 降低所述细胞中mi RNA-491的量，从而上调所述DAT基因的表达。通过调控细胞中的DAT基因 表达，可调节细胞对多巴胺的摄取。
[0007] 进一步地，提高所述细胞中的miRNA-491的量可通过将miRNA-491模拟物（SEQ ID NO: 2)转染至所述细胞中来进行；降低所述细胞中的miRNA-491的量可通过将miRNA-491抑 制剂(SEQ ID NO:3)转染至所述细胞中来进行。
[0008] 进一步地，所述细胞可为人神经细胞。
[0009] 本发明还提供了 miRNA-491在制备降低人细胞摄取多巴胺的药物中的用途，所述 miRNA-491可体现为miRNA-491模拟物，或miRNA-491基因与强启动子构建成的遗传构建体。
[0010] 本发明还提供了miRNA-491抑制剂在制备增加人细胞摄取多巴胺的药物中的用 途，所述miRNA-491抑制剂可体现为miRNA-491反义序列，或miRNA-491反义序列基因与强启 动子构建成的遗传构建体。
[0011]本发明还提供了一种用于调节人细胞摄取多巴胺的量的组合物，其包含miRNA-491或其抑制剂，并且还包含药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中的一种或多种。
【附图说明】
[0012] 图1为PsiCHECK2质粒图谱，DAT基因的3'UTR VNTR序列顺着转录方向插在多克隆 位点Xho I与Not I之间；
[0013] 图2为表征转染了带有DAT基因 3'UTR VNTR序列psiCHECK2质粒并且分别转染了 miRNA-491模拟物(miR-491)、miRNA_491 抑制剂(anti-miR-491)或对照miRNA(ctl-miR)的 细胞中的相对荧光素酶活性的柱状图；
[0014] 图 3 为表征分别转染了miRNA-491 模拟物(miR-491 )、miRNA-491 抑制剂(anti-miR-491) 或对照 miRNA(ctl-miR) 的细胞中相对 mRNA 活性的柱状图；
[0015] 图 4 为分别转染了miRNA-491 模拟物(miR-491 )、miRNA-491 抑制剂（anti-miR-491) 和对照m i RNA (c 11 -m i R)的细胞的总蛋白以抗DAT抗体为一抗做的we s t ern印迹；
[0016] 图 5 为表征分别转染了miRNA-491 模拟物(miR-491 )、miRNA-491 抑制剂(anti-miR-491) 和对照 miRNA(ctl-miR) 的细胞中相对多巴胺水平的柱状图。
[0017] 在以上附图的柱状图中，*p〈0 · 05，#p〈0 · 01，*#p〈0 · 001。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0019] 在本发明中，发明人使用miRanda(http://www.microrna.org)得至丨」关于人类、果 蝇和斑马鱼基因组的miRNA靶基因的预测信息以及miRNA在不同组织的表达谱，使用 TargetScan(http://www. targetscan · org)基于革EmRNA序列的进化保守等特征预测动物的 miRNA靶基因，出乎意料地发现，DAT基因的3 ' UTR的VNTR中存在miRNA-491可能的作用靶点。 在这基础上，通过荧光素酶表达活性分析、mRNA及蛋白质水平分析、功能水平分析，最终证 实可通过调节细胞中miRNA-491的量来调节DAT基因的表达，进而控制细胞内的多巴胺浓 度。
[0020] miRNA模拟物是一种合成的双链寡核糖核苷酸，其中一条链为具有相应miRNA的序 列的链，另一条链反向互补链，并且，在具有相应miRNA序列的链上具有末端修饰的核苷酸 类似物。当将miRNA模拟物转染至细胞中后，反向互补链立刻被细胞内环境中存在的RNA酶 降解，而具有miRNA序列的链因为这样的修饰而保持长时间不被降解，由此增大了 miRNA的 半衰期，提高了 miRNA的有效浓度。
[0021] miRNA抑制剂与miRNA模拟物正好相反，其在反向互补链上具有末端修饰的核苷酸 类似物。将miRNA模拟物转染至细胞中后，具有miRNA序列的链立刻被细胞内环境中存在的 RNA酶降解，而反向互补链因为这样的修饰而保持长时间不被降解，由此增大了反向互补链 的半衰期，提高了反向互补链的有效浓度。反向互补链结合细胞中相应的内源miRNA，使其 不能发挥功能，从而降低了miRNA的有效浓度。
[0022] 在本文以及所附权利要求书和序列表中，针对miRNA-491模拟物和miRNA-491抑制 剂所示出的序列都为其有效序列，即，在转染至细胞中后未被分解的那条链的序列。
[0023] 在本发明中，通过将miRNA-491模拟物或miRNA-491抑制剂转染至细胞中，以提高 或降低细胞中的miRNA-491的量，由此来下调或上调DAT基因的表达，从而影响细胞对多巴 胺的摄取。
[0024] miRNA模拟物和抑制剂在许多生化试剂公司有售，或可提供序列让生化公司合成， 例如天根生化科技公司、广州市锐博生物科技有限公司等。本发明实施例中使用的miRNA-491 模拟物和抑制剂购 自广州市锐博生物科技有限公司。
[0025]材料与方法
[0026]以下方法是实验的一般方法，在具体实验过程中可进行一些必要的修改。
[0027] 1.细胞培养
[0028]将SK-N-SH神经母细胞瘤(得自美国模式培养物集存库，ATCC HTB-Il)接种于添加 了 10%胎牛血清和0. lg/L的丙酮酸钠的MEM培养基中，在37°C和5%CO2下培养。
[0029] 2.质粒构建和转染
[0030] 使用细胞基因组为模板，通过PCR扩增得到DAT基因的3'UTR VNTR(SEQ ID N0:4) 的片段（约2kb)，将该片段插入psiCHECK2质粒（Pr〇mega，MadiS〇n，WI，USA)(图1)荧光素酶 报告基因 hRluc上游的多克隆位点XhoI与NotI之间。按照制造商的说明书，使用 Lipof ectamine 2000 (Invitrogen，Carlsbad，CA ,USA)试剂将带有DAT基因的3 ' UTR VNTR的 序列的质粒转染到SK-N-SH神经母细胞瘤中。
[0031] 3 .miRNA-491模拟物或抑制剂的转染
[0032] miRNA-491模拟物和抑制剂购自广州市锐博生物科技有限公司。根据制造商的说 明书，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen)将miRNA-491模拟物或抑制剂转染至 上述具有psiCHECK2质粒的SK-N-SH神经母细胞瘤中。转染方法如下：
[0033] 1)转染前一天用不含抗生素的生长培养基接种细胞，细胞密度5 X IO4Ail，100μ1/ 孔(以96孔板为例），使转染时的平坦单层细胞密度能够达到约70% ;
[0034] 2)按每孔10μ1的量用Opti-MEM减血清培养液稀释miRNA，使其在最终孵育时的工 作浓度为50-250nM;
[0035] 3)转染试剂Lipofectamine RNAiMAX使用前先轻轻混合，然后按每孔10μ1的量用 Opti-MEM减血清培养液稀释0.2μ1转染试剂，轻柔混合；
[0036] 4)将稀释好的转染试剂和miRNA混合在一起，总体积20μ1，轻柔混合，室温孵育10 至20分钟；
[0037] 5)向含有细胞和培养基的培养板中每孔加入20μ1混合物，轻轻摆动细胞培养板混 合均匀；
[0038] 6)恒温37°C的⑶2培养箱中孵育24至72小时后完成转染，收集细胞用于进一步分 析。
[0039] 实施例
[0040]实施例1.焚光素酶报告基因表达活性分析
[0041 ]使用Dual-luciferase Reporter Assay System(Promega，E1910)，根据制造商说 明书来分析其中转染了带有0六1'基因3'17^￥阶1?的？以〇^〇(2质粒并且分别转染了1^1?·-491模拟物、mi RNA-491抑制剂和阴性对照双链mi RNA (也购自广州市锐博生物科技有限公 司，转染方法与miRNA-491模拟物或抑制剂相同）的SK-N-SH神经母细胞瘤中的相对荧光素 酶活性。
[0042] 结果如图2所示，转染了miRNA-491模拟物的细胞(miR-491)中，荧光素酶活性是对 照（ctl-miR)中的50%左右(？〈0.01)，而转染了1^1?嫩-491抑制剂的细胞(31^丨11丨1?-491) 中，荧光素酶活性是对照(ctl-miR)中的1.1倍左右(p〈0.05)。该结果说明miRNA-491模拟物 通过DAT基因3'UTR VNTR抑制荧光素酶的表达;并且miRNA-491抑制剂促进该酶的表达。
[0043] 实施例2.mRNA水平分析
[0044] 使用荧光素酶报告基因表达质粒转染SK-N-SH细胞，孵育5小时，然后分别用 miRNA-491模拟物或抑制剂转染，孵育48小时。转染后培养24小时，然后通过使用SV Total RNAIsolation System(Promega)提取RNAJij^GoScript Reverse Transcription System 将尺财反转录成〇0财，所得的〇0嫩稀释10倍，进行实时定量？0?，0?乂961^31-1:;[1116 35^七6111 (Bio-Rad, California, USA)，使用SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA，Dalian，China)，用 GAPDH作为内标，分析mRNA表达水平。
[0045] 结果如图3所示，转染了miRNA-491模拟物的细胞(miR-491)中，DAT基因 mRNA表达 水平是对照（ctl-miR)中的30%左右(p〈0.001)，而转染了miRNA-491抑制剂的细胞(anti-miR-491)中，mRNA表达水平是对照（ctl-miR)中的约1.8倍左右（p〈0.01)。该结果说明 miRNA-491模拟物降低该mRNA的活性;并且miRNA-491抑制剂提高该mRNA的表达。
[0046] 实施例3. DAT蛋白表达水平分析
[0047] 培养24小时后，用RIPA细胞裂解液（25mM Tris-HCl，150mM 恥(：1，1%陬-40，1%脱 氧胆酸钠，0.1 % SDS，pH 7.6)处理细胞样品，进行12 %的SDS-PAGE电泳，
[0048] 然后进行western印迹，将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜(Mi llipore ,Bedford，MA) 上，封闭。一抗使用鼠抗人 DAT 抗体（I: I 000-1:2 000, Abeam ,USA，Product code:ab5990， ablll468)，二抗使用山羊抗鼠（1:1，000;Cell Signaling Technology Inc. ,Beverly, Massachusetts ,USA)。等体积混合 Luminol 和 Peroxide 试剂（Thermo Fisher Scientific) 配制发光液，向转印有蛋白质的一面P V D F膜上滴加发光液，凝胶成像仪C h e m i D o c M P Imaging System(Bi〇-Rad,Hercules ,CA,USA)中曝光显色。
[0049] 结果如图4所示，与转染了对照miRNA的细胞相比，转染了miRNA-491的细胞中，DAT 蛋白量降低，并且转染了miRNA-491抑制剂的细胞中，DAT蛋白量升高。该结果说明，miRNA-491 模拟物降低 DAT 蛋白 的表达，并且 miRNA 抑制剂提高 DAT 蛋白的表达。
[0050] 实施例4.多巴胺浓度的分析
[0051 ] 将细胞涂布于24孔培养皿(200，000细胞/孔），用miRNA-491模拟物、miRNA-491抑 制剂和阴性对照双链miRNA进行转染，孵育48小时。然后将细胞与5μg/ml盐酸多巴胺孵育5 小时，使用多巴胺ELISA试剂盒（Elabscience ,Wuhan,Hubei ,China,Product code:E-EL-0046c)测定细胞内多巴胺浓度。
[0052] 结果如图5所示，转染了miRNA-491模拟物的细胞(miR-491)中，多巴胺是对照 (ctl-miR)中的 50%左右(ρ〈0·001)，而转染了miRNA-491 抑制剂的细胞(anti-miR-491)中， 多巴胺略高于对照（ctl-miR)，但是没有统计学显著性。该结果说明miRNA-491模拟使神经 细胞SK-N-SH中的多巴胺浓度降低;而miRNA-491抑制剂对多巴胺浓度影响不大。
[0053]通过以上实施例，证明了miRNA-491模拟物的转染能够降低细胞对多巴胺的摄取， 因此miRNA-491模拟物可用于降低人细胞摄取多巴胺，并且可用于制备降低人细胞摄取多 巴胺的药物；同时证明了miRNA-491抑制剂的转染能够增加细胞对多巴胺的摄取，因此 miRNA-491抑制剂可用于增加人细胞摄取多巴胺，并且可用于制备降低人细胞摄取多巴胺 的药物。
[0054]本发明还设想了用于降低人细胞摄取多巴胺的组合物，其包含miRNA模拟物，并且 还可包含药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或佐剂。
[0055]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 <110>北京大学深圳医院；深圳北京大学香港科技大学医学中心 <120> 一种基于miRNA49〖调节DAT基因表达的方法 <160> 4 <170> PatentIji version 3,5 <210 1 <211> 22 <212> RNA <213> 智人
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[0059] acccaggtgt tgtccgtgtc tgttgaccaa tctctattca gcatcgtgtg ggtccctaag 960 cacaataaaa gacatccaca atggaaaaac Tgc 993
【主权项】
1. 一种调节细胞中的多巴胺转运体基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤:提高 所述细胞中的miRNA-491的量从而下调所述多巴胺转运体基因的表达;或降低所述细胞中 的miRNA-491量，从而上调所述多巴胺转运体基因的表达，所述miRNA-491的序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提高所述细胞中的miRNA-491的量通 过将miRNA-491模拟物转染至所述细胞中来进行，所述miRNA-491模拟物的序列如SEQ ID NO: 2所示。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低所述细胞中的miRNA-491的量通 过将miRNA-491抑制剂转染至所述细胞中来进行，所述miRNA-491的序列如SEQ ID NO:3所 不。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为人神经细胞。 5. miRNA-491及其抑制剂在制备调节人细胞摄取多巴胺的药物的应用。6. -种用于调节人神经细胞摄取多巴胺的组合物，其特征在于，包含miRNA-491或其抑 制剂，以及药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中的一种或多种。
【文档编号】C12N15/63GK105861532SQ201610219113
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】陈芸, 陆林, 贾晓健, 王峰, 韩盈, 刘俐, 石宇, 孙德胜, 张蒂荣, 李明华, 刘汉清, 胡阿珍, 吴决连
【申请人】北京大学深圳医院, 深圳北京大学香港科技大学医学中心