一种白桦转基因方法
【专利摘要】一种白桦转基因方法，它属于植物基因工程领域。它要解决白桦转基因效率低、脱菌困难和周期长的问题。方法：一、选白桦种子，冲泡后挑选充分吸胀并沉瓶底、萌发结束的成熟种子用于转基因受体；二、消毒；三、制备用于种子受体侵染的工程菌液；四、纵切种子，浸染；五、液体愈伤诱导培养基中进行共培养；六、通过愈伤培养、分化培养、继代培养和生根培养，获得转基因株系，即完成。本发明无需进行白桦外植体的培养，缩短了转基因周期；采用液体共培养方式，除去了重复多次的脱菌步骤，提高了白桦转基因效率；转化效率高，周期短，解决了白桦转基因效率低，脱菌难，转化周期长的问题。白桦转基因株系移栽成活率高，操作简单，易于掌握。
【专利说明】
一种白桦转基因方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种农杆菌介导的白桦萌发种子为受体 的高效、快速的转基因方法。
【背景技术】
[0002] 白桦(Betula platyphylla Suk.)是东北地区珍贵阔叶树种之一，但由于白桦育 种周期长，遗传改良进程缓慢，传统的白桦育种技术不能按照育种目标设计改造性状，满足 日益增长的社会需求。因此，开展白桦基因工程育种研究势在必行。
[0003] 目前，采用农杆菌介导法已获得了抗虫、抗旱耐盐的转基因白桦，但遗传转化效率 低，根癌农杆菌介导的白桦叶盘转化法转化周期长，涉及转化外植体的培养以及转化叶片 重复的脱菌等环节。以往叶盘法白桦转基因周期长的原因之一是以组培生根苗的叶片为受 体，从白桦组培继代苗至培养为适宜转基因状态的生根苗所需时间约85d左右，取其叶片作 为受体被农杆菌侵染后，粘附大量农杆菌，需要连续7d的每天用无菌纸擦拭脱菌3次，在这 种被农杆菌粘附的叶片组织细胞中很难获得重组抗性细胞。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决白桦转基因效率低、脱菌困难和周期长的问题，而提供 一种白桦转基因方法。
[0005] -种白桦转基因方法按以下步骤实现：
[0006] -、下午7时，选取发芽率达70%以上的白桦种子装入烧杯中，杯口盖2层纱布并用 皮套扎紧，置于水槽中用流水冲40_45h，然后挑选充分吸胀并沉瓶底、萌发结束的成熟白桦 种子用于转基因受体；
[0007] 二、将步骤一中挑选的种子置于无菌培养皿中，在超净工作台中，加入50ml体积浓 度为75%的酒精浸泡30s，弃酒精，然后加入50ml质量浓度为30%的双氧水消毒15min，弃双 氧水，再用无菌水洗种子3次，置于有无菌水中的平皿中备用；
[0008] 三、在进行步骤二的前一天的2 1时，取储存于-8 0 °C的农杆菌工程菌 pProBpIAAlO: :LUC，接种于30ml附加相应抗生素的LB培养液中，在28°C，180rpm/min恒温摇 床上过夜培养，第二天上午9时取上述过夜培养物按2%的比例转入新鲜的无抗生素的LB培 养液中，继续培养至〇D_值为0.4-0.6，获得用于白桦种子受体侵染的工程菌液；
[0009] 四、13时-15时，在超净工作台中将30个步骤二中消毒的种子依次从正中间纵切， 得到白桦种子受体，然后加入200μ1步骤三中制备的工程菌液浸泡30s，同时用无菌刀片摘 除种皮，获得浸染后的纵切种子；
[0010]五、将浸染后的纵切种子转接于50ml三角瓶中，每瓶接种30个并加入1.5-2ml的液 体愈伤诱导培养基，置于小摇床上，在23°C-27°C，50rpm/min条件下避光共培养48h，共培养 期间按时更换7次液体愈伤诱导培养基；
[0011]六、共培养48h后转接至含选择剂、抑菌剂的愈伤诱导固体平板培养基上，在23Γ- 27°C，4000-5000Lux，光照/黑暗为16h/8h条件下进行选择培养，15d后陆续在切口处可见绿 色抗性愈伤组织形成，将绿色抗性愈伤组织切下转接到含选择剂、抑菌剂的分化培养基中， 15d后陆续产生抗性不定芽，将抗性不定芽转接到含选择剂、抑菌剂的继代培养基中，待抗 性不定芽长到Icm时，转接到生根培养基上进行生根培养，IO-Hd长出不定根，获得转基因 株系，即完成白枠转基因。
[0012] 本发明选择发芽率高达70%以上、种子活力很强、充分吸胀且萌发结束的白桦种 子为转基因受体，种子具有较强的分化能力，无需进行白桦外植体的培养，节省了时间及人 力，缩短了转基因周期；
[0013] 本发明采用液体共培养方式进行成熟白桦种子受体与工程菌的共培养，使转基因 过程除去了重复多次的脱菌步骤，并且不断更换适宜体积的液体共培养基保证农杆菌旺盛 的代谢能力，能够及时清除农杆菌有害代谢产物，保持农杆菌较强的侵染种子的能力，有利 于T-DNA片段的转移及整合的机率，大大提高了白桦转基因效率；
[0014] 在适宜体积的液体培养基中缓慢摇动培养，即保证种子能够接触空气，又能够接 触液体培养基，保证农杆菌始终处于呼吸代谢的旺盛时期，有利于获得抗性愈伤组织。使得 脱菌次数由20-25次降为0次，转化效率高达7.5%，较原来的效率1 %提高了6.5倍;仅用15-20d就可以获得白桦抗性愈伤，抗性愈伤得到时间（原来30d)缩短了 10-15d;转基因周期为 20d，较叶盘转化法（120d)缩短了 IOOcU有效缩短转化周期，解决了白桦转基因效率低，脱菌 难，转化周期长的问题。
[0015] 本发明中白桦转基因株系移栽成活率达99%-100%，产生的后代遗传稳定性好， 大大缩短白桦转基因周期。
[0016] 本发明操作简单，易于掌握，省时省力，可显著提高白桦的遗传转化效率，有效缩 短白桦转化周期，特别适用于白桦的遗传转化。
【附图说明】
[0017]图1为实施例中吸胀萌发结束的白桦种子；
[0018] 图2为实施例中纵切的白桦种子；
[0019] 图3为实施例中转基因白桦受体的选择培养；
[0020] 图4为实施例中获得的转基因抗性愈伤组织；
[0021] 图5为实施例中愈伤组织形成的抗性不定芽；
[0022] 图6为实施例获得的转基因株系生根苗；
[0023] 图7为实施例移栽至室外的转基因苗木。
【具体实施方式】
[0024] 本发明技术方案不局限于以下所列举的【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】之 间的任意组合。
【具体实施方式】 [0025] 一:本实施方式一种白桦转基因方法按以下步骤实现：
[0026] 一、下午7时，选取发芽率达70%以上的白桦种子装入烧杯中，杯口盖2层纱布并用 皮套扎紧，置于水槽中用流水冲40_45h，然后挑选充分吸胀并沉瓶底、萌发结束的成熟白桦 种子用于转基因受体；
[0027]二、将步骤一中挑选的种子置于无菌培养皿中，在超净工作台中，加入50ml体积浓 度为75%的酒精浸泡30s，弃酒精，然后加入50ml质量浓度为30%的双氧水消毒15min，弃双 氧水，再用无菌水洗种子3次，置于有无菌水中的平皿中备用；
[0028]三、在进行步骤二的前一天的2 1时，取储存于-8 0 °C的农杆菌工程菌 pProBpIAAlO: :LUC，接种于30ml附加相应抗生素的LB培养液中，在28°C，180rpm/min恒温摇 床上过夜培养，第二天上午9时取上述过夜培养物按2%的比例转入新鲜的无抗生素的LB培 养液中，继续培养至OD 6qq值为0.4-0.6，获得用于白桦种子受体侵染的工程菌液；
[0029]四、13时-15时，在超净工作台中将30个步骤二中消毒的种子依次从正中间纵切， 得到白桦种子受体，然后加入200μ1步骤三中制备的工程菌液浸泡30s，同时用无菌刀片摘 除种皮，获得浸染后的纵切种子；
[0030] 五、将浸染后的纵切种子转接于50ml三角瓶中，每瓶接种30个并加入1.5-2ml的液 体愈伤诱导培养基，置于小摇床上，在23°C-27°C，50rpm/min条件下避光共培养48h，共培养 期间按时更换7次液体愈伤诱导培养基；
[0031] 六、共培养48h后转接至含选择剂、抑菌剂的愈伤诱导固体平板培养基上，在23°(：-27°C，4000-5000Lux，光照/黑暗为16h/8h条件下进行选择培养，15d后陆续在切口处可见绿 色抗性愈伤组织形成，将绿色抗性愈伤组织切下转接到含选择剂、抑菌剂的分化培养基中， 15d后陆续产生抗性不定芽，将抗性不定芽转接到含选择剂、抑菌剂的继代培养基中，待抗 性不定芽长到Icm时，转接到生根培养基上进行生根培养，IO-Hd长出不定根，获得转基因 株系，即完成白枠转基因。
[0032] 本实施方式步骤三中农杆菌工程菌pProBpIAAlO: :LUC购买自东北林业大学林木 遗传育种实验室;本领域技术人员也可通过现有常规方法自行制备。
[0033]本实施方式步骤五中避光共培养是采用锡箱纸包裹三角瓶进行避光。
[0034] 本实施方式步骤五中小摇床为SCIL0GEX，SK-0180-E。
[0035] 本实施方式步骤五中共培养期间按时更换7次液体愈伤诱导培养基，更换时序如 表1所示。
[0036] 表1液体共培养期间更换液体培养基时序
【具体实施方式】 [0039] 二:本实施方式与一的不同是，步骤一中萌发结束的 标志是指胚根穿透胚周围的组织。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0040] 三:本实施方式与一的不同是，步骤一中置于水槽中 用流水冲43h。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0041] 四：本实施方式与一的不同是，步骤三中附加相应抗 生素的LB培养液：10g/L胰蛋白胨+5g//L酵母提取物+10g/L氯化钠+50mg/L利福平+50mg/L潮 霉素 ，pH 7.4。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0042] 五:本实施方式与一的不同是，步骤三中继续培养至 OD6(K)值为0.5。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0043] 六:本实施方式与一的不同是，步骤五中液体愈伤诱 导培养基：液体WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3。其它步骤及参数与具体实 施方式一相同。
【具体实施方式】 [0044] 七:本实施方式与一的不同是，步骤五中将浸染后的 纵切种子转接于50ml三角瓶中，每瓶接种30个并加入1.8ml的液体愈伤诱导培养基，置于小 摇床上，在23°C_27°C，50rpm/min条件下避光共培养48h。其它步骤及参数与 一相同。
【具体实施方式】 [0045] 八:本实施方式与一的不同是，步骤五中按时更换7次 液体愈伤诱导培养基，是在超净台中用无菌枪头吸出陈旧的培养基，再加入1.5-2ml新的愈 伤诱导培养基。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0046] 九:本实施方式与一的不同是，步骤六中含选择剂、抑 菌剂的愈伤诱导固体平板培养基：WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3+50mg/L 潮霉素+200mg/L头孢霉素。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0047] 十：本实施方式与一的不同是，步骤六中在25°C， 4500LUX，光照/黑暗为16h/8h条件下进行选择培养。其它步骤及参数与一相 同。
【具体实施方式】 [0048] ^^一:本实施方式与一的不同是，步骤六中含选择剂、 抑菌剂的分化培养基:'?^+0.8-1.011^/16-84+0.0211^/1祖4+0.511^/1643+5011^/1潮霉素 +200mg/L头孢霉素。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0049] 十二:本实施方式与一的不同是，步骤六中含选择剂、 抑菌剂的继代培养基:WPM+0.8-1. Omg/L 6-BA+50mg/L潮霉素 +200mg/L头孢霉素。其它步骤 及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0050] 十三:本实施方式与一的不同是，步骤六中生根培养 基为:WPM+0.2-0.4mg/L IBA。其它步骤及参数与一相同。
[0051 ]通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0052] 实施例
[0053] 一种白桦转基因方法按以下步骤实现：
[0054] 一、下午7时，选取发芽率为70 %的白桦种子装入烧杯中，杯口盖2层纱布并用皮套 扎紧，置于水槽中用流水冲40h，然后挑选充分吸胀并沉瓶底、胚根穿透胚周围的组织的成 熟白桦种子用于转基因受体；
[0055]二、将步骤一中挑选的种子置于无菌培养皿中，在超净工作台中，加入50ml体积浓 度为75%的酒精浸泡30s，弃酒精，然后加入50ml质量浓度为30%的双氧水消毒15min，弃双 氧水，再用无菌水洗种子3次，置于有无菌水中的平皿中备用；
[0056]三、在进行步骤二的前一天的2 1时，取储存于-8 0 °C的农杆菌工程菌 pProBpIAAlO: :LUC，接种于30ml附加相应抗生素的LB培养液中，在28°C，180rpm/min恒温摇 床上过夜培养，第二天上午9时取上述过夜培养物按2%的比例转入新鲜的无抗生素的LB培 养液中，继续培养至〇D_值为0.5，获得用于白桦种子受体侵染的工程菌液；
[0057]四、13时-15时，在超净工作台中将30个步骤二中消毒的种子依次从正中间纵切 (见图2)，得到白桦种子受体，然后加入200μ1步骤三中制备的工程菌液浸泡30s，同时用无 菌刀片摘除种皮，重复操作1次，获得120个浸染后的纵切种子；
[0058]五、将浸染后的纵切种子转接于50ml三角瓶中，每瓶接种30个并加入1.5ml的液体 愈伤诱导培养基，共接种4瓶，置于小摇床上，在25°C，50rpm/min条件下避光共培养48h，共 培养期间按时更换7次液体愈伤诱导培养基；
[0059]六、共培养48h后转接至含选择剂、抑菌剂的愈伤诱导固体平板培养基上，在25°C， 4500LUX，光照/黑暗为16h/8h条件下进行选择培养(见图3)，15d后陆续在切口处可见绿色 抗性愈伤组织形成(见图4)，将绿色抗性愈伤组织切下转接到含选择剂、抑菌剂的分化培养 基中，15d后陆续产生抗性不定芽(见图5)，将抗性不定芽转接到含选择剂、抑菌剂的继代培 养基中，待抗性不定芽长到Icm时，转接到生根培养基上进行生根培养，12d长出不定根(见 图6 )，获得转基因株系，即完成白桦转基因方法。
[0060]本实施例步骤一中要选取萌发结束的成熟白桦种子用于转基因受体，萌发结束的 标志是胚根穿透胚周围的组织(见图1)。
[0061 ] 本实施例步骤三中农杆菌工程菌PProBpIAAlO: :LUC购买自东北林业大学林木遗 传育种实验室。
[0062]本实施例步骤五中避光共培养是采用锡箱纸包裹三角瓶进行避光。
[0063] 本实施例步骤五中小摇床为SCIL0GEX，SK-0180-E。
[0064] 本实施例步骤五中共培养期间按时更换7次液体愈伤诱导培养基，更换时序如表2 所示。
[0065] 表 2
[0068] 本实施例步骤三中附加相应抗生素的LB培养液：10g/L胰蛋白胨+5g/L酵母提取物 +l〇g/L氯化钠 +50mg/L利福平+50mg/L潮霉素，pH 7·4。
[0069] 本实施例步骤五中液体愈伤诱导培养基：液体WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ 0.5mg/L GA30
[0070] 本实施例步骤六中含选择剂、抑菌剂的愈伤诱导固体平板培养基:WPM+2 . Omg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3+50mg/L潮霉素 +200mg/L头孢霉素。
[0071] 本实施例步骤六中含选择剂、抑菌剂的分化培养基:WPM+1.Omg/L 6-BA+0.02mg/L ΝΑΑ+0 · 5mg/L GA3+50mg/L潮霉素 +200mg/L头孢霉素。
[0072] 本实施例步骤六中含选择剂、抑菌剂的继代培养基:WPM+1 .Omg/L 6-BA+50mg/L潮 霉素 +200mg/L头孢霉素。
[0073] 本实施例步骤六中生根培养基为:WPM+0.4mg/L IBA。
[0074] 通过本实施例进行白桦转ProBpIAAlO: :LUC基因，选择发芽率高达70%、种子活力 很强、充分吸胀且萌发结束的成熟白桦种子为外植体，种子具有较强的分化能力，无需进行 白桦外植体的培养;液体共培养也使转基因过程除去重复多次的脱菌步骤。且不断更换适 宜体积的液体共培养基保证农杆菌旺盛的代谢能力，能够及时清除农杆菌有害代谢产物， 保持农杆菌较强的侵染种子的能力，有利于T-DNA片段的转移;适宜的体积能够保证种子能 够接触空气，处于呼吸代谢的旺盛时期，有利于获得抗性愈伤组织。并使得脱菌次数由20-25次降为0次，共获得9个转ProBpIAAlO: :LUC基因株系（120个受体），转化效率高达7.5%， 较原来的效率1%提高了6.5倍;仅用15-20d就可以获得白桦抗性愈伤，抗性愈伤得到时间 (原来30d)缩短了 10-15d;转基因周期为20d，较叶盘转化法（120d)缩短了 IOOcU有效缩短转 化周期，克服了本领域认为白桦转基因效率低，脱菌难，转化周期长的偏见。
[0075] 本实施例中白桦转基因株系移栽(见图7)至室外成活率达100%。
[0076]本实施例方法操作简单，易于掌握，省时省力，可显著提高白桦的遗传转化效率， 有效缩短白桦转化周期，特别适用于白桦的遗传转化。
【主权项】
1. 一种白桦转基因方法，其特征在于它按以下步骤实现： 一、 下午7时，选取发芽率达70%以上的白桦种子装入烧杯中，杯口盖2层纱布并用皮套 扎紧，置于水槽中用流水冲40_45h，然后挑选充分吸胀并沉瓶底、萌发结束的成熟白桦种子 用于转基因受体； 二、 将步骤一中挑选的种子置于无菌培养皿中，在超净工作台中，加入50ml体积浓度为 75 %的酒精浸泡30s，弃酒精，然后加入50ml质量浓度为30 %的双氧水消毒15min，弃双氧 水，再用无菌水洗种子3次，置于有无菌水中的平皿中备用； 三、 在进行步骤二的前一天的21时，取储存于-80°C的农杆菌工程菌pProBpIAAlO:: LUC，接种于30ml附加相应抗生素的LB培养液中，在28°C，180rpm/min恒温摇床上过夜培养， 第二天上午9时取上述过夜培养物按2%的比例转入新鲜的无抗生素的LB培养液中，继续培 养至OD600值为0.4-0.6，获得用于白桦种子受体侵染的工程菌液； 四、 13时-15时，在超净工作台中将30个步骤二中消毒的种子依次从正中间纵切，得到 白桦种子受体，然后加入200μ1步骤三中制备的工程菌液浸泡30s，同时用无菌刀片摘除种 皮，获得浸染后的纵切种子； 五、 将浸染后的纵切种子转接于50ml三角瓶中，每瓶接种30个并加入1.5-2ml的液体愈 伤诱导培养基，置于小摇床上，在23°C_27°C，50rpm/min条件下避光共培养48h，共培养期间 按时更换7次液体愈伤诱导培养基； 六、 共培养48h后转接至含选择剂、抑菌剂的愈伤诱导固体平板培养基上，在23Γ-27 °C，4000-5000Lux，光照/黑暗为16h/8h条件下进行选择培养，15d后陆续在切口处可见绿色 抗性愈伤组织形成，将绿色抗性愈伤组织切下转接到含选择剂、抑菌剂的分化培养基中， 15d后陆续产生抗性不定芽，将抗性不定芽转接到含选择剂、抑菌剂的继代培养基中，待抗 性不定芽长到lcm时，转接到生根培养基上进行生根培养，10-14d长出不定根，获得转基因 株系，即完成白枠转基因。2. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤一中萌发结束的标志 是指胚根穿透胚周围的组织。3. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤三中附加相应抗生素 的LB培养液：10g/L胰蛋白胨+5g//L酵母提取物+10g/L氯化钠+50m g//L利福平+50mg//L潮霉 素 ，pH 7.4〇4. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤三中继续培养至OD600 值为0.5。5. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤五中液体愈伤诱导培 养基：液体WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3。6. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤五中按时更换7次液体 愈伤诱导培养基，是在超净台中用无菌枪头吸出陈旧的培养基，再加入1.5-2ml新的愈伤诱 导培养基。7. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤六中含选择剂、抑菌剂 的愈伤诱导固体平板培养基:WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3+50mg/L潮霉 素+200mg/L头孢霉素。8. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤六中含选择剂、抑菌剂 的分化培养基：WPM+0.8-1. Omg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA3+50mg/L潮霉素+ 200mg/L头孢霉素。9. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤六中含选择剂、抑菌剂 的继代培养基:WPM+0.8-1. Omg/L 6-BA+50mg/L潮霉素 +200mg/L头孢霉素。10. 根据权利要求1所述的一种白桦转基因方法，其特征在于步骤六中生根培养基为： WPM+0.2-0.4mg/L IBA。
【文档编号】C12N15/82GK105861542SQ201610487650
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】徐文娣, 姜静, 刘桂丰, 王楚, 韩锐
【申请人】东北林业大学