稀土铥元素掺杂的蓝色上转化纳米基因载体的制备方法及应用
【专利摘要】本发明涉及稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的制备方法及应用。包括：1)稀土铥元素掺杂的蓝色稀土上转换纳米颗粒的制备：蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制备，制得的直径为20～50纳米；2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒；3)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺。本发明实时跟踪外源基因的稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体的基因纳米载体的基因转染效率为40～70％，细胞存活率为80％～95％。本载体还可以通过在980纳米近红外光的照射，检测蓝色上转换的位置来实时跟踪基因所到达的目的位置。
【专利说明】
稀土铥元素掺杂的蓝色上转化纳米基因载体的制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种可实时跟踪外源基因的稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]基因转染是一种非常常规的生物和医药技术，但是通常的基因转染用的试剂是相对分子质量为25，000的聚醚酰亚胺(PEI)，虽然该PEI比相对分子质量为600的PEI的转染效率高，但是其细胞毒性也比相对分子质量为600的PEI大得多，因此将相对分子质量为600的PEI连接至一纳米微球上便可以成功制备出一种转染效率高，细胞毒性低的新型基因转染载体。
[0003]此外，用常规的基因转染试剂进行转染细胞时，很难方便的示踪基因载体的具体位置，也就无法判定目标细胞是否有外源基因的的进入。稀土上转换发光材料是一种在近红外光激发下能发出可见光的新型发光材料，其中近红外光只引起很小的光损伤并且在组织中有很高的光子渗透性。因此稀土上转换纳米发光材料在医学和生物学中的应用相对于其他材料，具有极大的优越性。而氯化铥掺杂的上转化纳米材料，能够在980纳米近红外光的照射下发射出蓝紫光较强的。于是将铥元素掺杂蓝色上转换材料制作成为一种基因载体，就可以实现实时跟踪外源基因以及靶细胞的功能。因此，研制出一种具有转染效率高，细胞毒性小，并且可以实时跟踪外源基因的纳米载体等优势的新型基因纳米载体具有重大的意义，在生物技术和医药技术领域具有重要的科研和临床应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明涉及一种可实时跟踪外源基因的稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体的制备方法及应用。
[0005]本发明的稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的特征:其直径为30?60纳米，制备的基因纳米载体的基因转染效率为40?70%，细胞存活率为80%?95%。此外，本载体还可以通过在980纳米近红外光的照射，检测蓝色上转换的位置来实时跟踪基因所到达的目的位置。
[0006]本发明的技术方案包括:
[0007]I)稀土铥元素掺杂的蓝色稀土上转换纳米颗粒的制备:蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制备，制得的直径为20?50纳米；
[0008]2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒；
[0009]3)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺。
[0010]所述的步骤I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米载体颗粒的制备方法步骤如下:
[0011]I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制得:将450毫克YCl3.6H2O，200毫克YbCl3.6H2O和I毫克?3毫克TmCl3.6出0溶解至I?2毫升去离子水中，于300?400转/分钟磁力搅拌条件下，加热至100?120°C直至稀土盐完全溶液变成白色固体；
[0012]2)待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至50?60°C，加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯，并升温至120?140°C使盐溶液完全溶解；
[0013]3)冷却至50?60°C，加入溶有50?60毫克氢氧化钠和100?150毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液;升温至110?120°c，采用油栗抽真空30?40分钟；
[0014]4)通入氩气，升温到310?320°C，在300?400转/分钟磁力条件下，搅拌反应50?60分钟；
[0015]5)待反应结束后加入丙酮离心纯化，得到蓝色上转换纳米颗粒。
[0016]所述的步骤2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒，具体步骤如下:
[0017]I)取蓝色上转换纳米颗粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以90?10W的功率超声混匀；
[0018]2)称取150?200毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯，以90?10W的功率超声混匀；
[0019]3)将上述步骤2)中的溶液加入I)中，于300?400转/分钟，100?110°C磁力搅拌条件下反应5?6小时；
[0020]4)待反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心8?10分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，即制得水溶性的蓝色上转换纳米颗粒；
[0021]所述的步骤3)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下:
[0022]I)将水溶性蓝色上转换纳米颗粒溶解至2?3毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入75?100微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于15?20 °C加热，300?400转/分钟磁力条件下，搅拌反应10?12小时，然后以12,000?13，000转/分钟，离心8?10分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的蓝色上转换纳米颗粒；
[0023]2)将上述沉淀全部加入去离子水中，并按照质量份数比碳二亚胺:N-羟基琥珀酰亚胺=0.5:0.5?I，继续搅拌3?4小时后离心纯化，制得吸附DNA的蓝色上转换基因纳米载体。
[0024]稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体应用转染外源绿色荧光蛋白质粒DNA至He I a细胞。
[0025]具体应用方法是:
[0026]I)蓝色上转换基因纳米载体吸附质粒DNA:将蓝色上转换基因纳米载体溶解至100?150微升的无菌去离子水中；取一无菌的1.5毫升的离心管，加入80?100微升的OPT1-MEM无血清培养基和0.3?0.6微克的绿色荧光蛋白质粒DNA并充分混匀，再加入与质粒DNA的质量体积比为1:1?2的蓝色上转换基因纳米载体，并混匀后静止30?40分钟；
[0027]2)将蓝色上转换基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述含有外源基因质粒DAN和蓝色上转换基因纳米载体的复合物全部加入至一24孔板或48孔板的海拉细胞中，再于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养3?4小时后吸取培养液，并加入200?300毫升的新鲜完全培养液;培养18?20小时后于荧光显微镜观察并计算转染效率。
[0028]实时跟踪外源基因的稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体的基因纳米载体的基因转染效率为40?70%，细胞存活率为80%?95%。
[0029]本载体还可以通过在980纳米近红外光的照射，检测蓝色上转换的位置来实时跟踪基因所到达的目的位置。
[0030]本发明的优势在于:I)制备的基因纳米载体的基因转染效率为40?70%，细胞存活率为80 %?95 %。2)可以通过在980纳米近红外光的照射，检测蓝色上转换的位置来实时跟踪基因所到达的目的位置。
【附图说明】
[0031]图1:用溶胶凝胶法制备的介孔稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的透射电子显微镜照片(形貌分析)。
[0032]图2:将稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染绿色荧光蛋白(GFP)基因至人宫颈癌细胞(Hela细胞)后的转染结果。
【具体实施方式】
[0033]下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0034]一种稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的制备方法;其特征步骤如下:
[0035]I)蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制得:将450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCb.6H2O和I毫克?3毫克TmCh.6H2O溶解至I?2毫升去离子水中，于300?400转/分钟磁力搅拌条件下，加热至100?120°C直至稀土盐完全溶液变成白色固体。
[0036]2)待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至50?60°C以，用移液管加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯，并升温至120?140°C使盐溶液完全溶解。
[0037]3)冷却至50?60 °C以下，加入溶有50?60毫克氢氧化钠、100?150毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液;调节温度并升温至110?120°c，采用油栗抽真空30?40分钟。
[0038]4)通入氩气，迅速升温到310?320°C，维持在300?400转/分钟磁力条件下，搅拌反应50?60分钟。
[0039]5)待反应结束后加入丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理，以备后用。
[0040]采用配体交换法制备水溶性羧基化蓝色上转换纳米颗粒，具体步骤如下:
[0041]I)取权利要求1中制得的蓝色上转换纳米颗粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以90?100W的功率超声混匀。
[0042]2)称取150?200毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯，以90?10W的功率超声混匀。
[0043]3)将上述步骤2)中的溶液加入I)中，于300?400转/分钟，100?110°C磁力搅拌条件下反应5?6小时。
[0044]4)待反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心8?10分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，即制得水溶性的蓝色上转换纳米颗粒。
[0045]水溶性蓝色上转换纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺:
[0046]I)将权利要求2中制得的水溶性蓝色上转换纳米颗粒溶解至2?3毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入75?100微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于15?20°C加热，300?400转/分钟磁力条件下，搅拌反应10?12小时，然后以12,000?13，000转/分钟，离心8?10分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的蓝色上转换纳米颗粒。
[0047]2)将上述沉淀全部加入至加2?3毫升的去离子水中，并按照质量份数比碳二亚胺:N-羟基琥珀酰亚胺=0.5:0.5?I，继续搅拌3?4小时后离心纯化，即制得可以吸附DNA的蓝色上转换基因纳米载体。
[0048]蓝色上转换基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA至Hela细胞应用。
[0049]I)蓝色上转换基因纳米载体吸附质粒DNA:将权利要求4所述中制得的蓝色上转换基因纳米载体溶解至100?150微升的无菌去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入80?100微升的OPT1-MEM无血清培养基和0.3?0.6微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入与质粒DNA的质量体积比为1:1?2的蓝色上转换基因纳米载体，并混匀后静止30?40分钟。
[0050]2)将蓝色上转换基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述含有外源基因质粒DAN和蓝色上转换基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中，再于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养3?4小时后吸取培养液，并加入200?300毫升的新鲜完全培养液。培养18?20小时后于荧光显微镜观察并计算转染效率。
[0051 ] 实施例1:
[0052]稀土铥元素掺杂的蓝色稀土上转换基因纳米载体的制备方法，具体步骤如下:
[0053]I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制得:将450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCl3.6H20和I毫克TmCl3.6H20溶解至I毫升去离子水中，于300转/分钟磁力搅拌条件下，加热至100°C直至稀土盐完全溶液变成白色固体。待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至80°C以下，用移液管加入2毫升油酸及5毫升十八烯，并升温至150°C使盐溶液完全溶解。冷却至60°C以下，加入溶有50毫克氢氧化钠、100毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液；调节温度并升温至120°C，采用油栗抽真空10分钟。通入氩气，迅速升温到280°C，维持在100转/分钟磁力条件下，搅拌反应0.5小时。待反应结束后加入丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理，以备后用。
[0054]2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒:取上述步骤制得的蓝色上转换纳米颗粒2毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以50W的功率超声混匀。再称取50毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯，以50W的功率超声混匀。将上述两种溶液混匀，于100转/分钟，100°C磁力搅拌条件下反应2小时。待反应结束后，以11，000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀I遍，即制得水溶性的蓝色上转换纳米颗粒。
[0055]3)水溶性稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI):将上述步骤制得的水溶性蓝色上转换纳米颗粒溶解至2毫升的去离子水中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入50微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于20°C加热，100转/分钟磁力条件下，搅拌反应6小时。待反应结束后，以11，000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀I遍，即制得可以吸附DNA的蓝色上转换基因纳米载体。
[0056]实施例2:
[0057]稀土铥元素掺杂的蓝色稀土上转换基因纳米载体的制备方法，具体步骤如下:
[0058]I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制得:将450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCl3.6H20和2毫克TmCl3.6H20溶解至1.5毫升去离子水中，于350转/分钟磁力搅拌条件下，加热至110Γ直至稀土盐完全溶液变成白色固体。待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至80°C以下，用移液管加入5毫升油酸及10毫升十八烯，并升温至160°C使盐溶液完全溶解。冷却至60 °C以下，加入溶有75毫克氢氧化钠、200毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液;调节温度并升温至120°C，采用油栗抽真空30分钟。通入氩气，迅速升温到300°C，维持在300转/分钟磁力条件下，搅拌反应0.75小时。待反应结束后加入丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理，以备后用。
[0059]2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒:取上述步骤制得的蓝色上转换纳米颗粒8毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以80W的功率超声混匀。再称取100毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯，以80W的功率超声混匀。将上述两种溶液混匀，于300转/分钟，120°C磁力搅拌条件下反应4小时。待反应结束后，以10，000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，即制得水溶性的蓝色上转换纳米颗粒。
[0060]3)水溶性稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI):将上述步骤制得的水溶性蓝色上转换纳米颗粒溶解至3毫升的去离子水中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入100微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于30°C加热，300转/分钟磁力条件下，搅拌反应9小时。待反应结束后，以10，000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，即制得可以吸附DNA的蓝色上转换基因纳米载体。
[0061 ] 实施例3:
[0062]稀土铥元素掺杂的蓝色稀土上转换基因纳米载体的制备方法，具体步骤如下:
[0063]I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制得:将450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCl3.6H20和3毫克TmCl3.6H20溶解至I?2毫升去离子水中，于400转/分钟磁力搅拌条件下，加热至120°C直至稀土盐完全溶液变成白色固体。待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至80°C以下，用移液管加入10毫升油酸及30毫升十八烯，并升温至180°C使盐溶液完全溶解。冷却至60°C以下，加入溶有100毫克氢氧化钠、300毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液;调节温度并升温至120°C，采用油栗抽真空40分钟。通入氩气，迅速升温到320°C，维持在500转/分钟磁力条件下，搅拌反应I小时。待反应结束后加入丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理，以备后用。
[0064]2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒:取上述步骤制得的蓝色上转换纳米颗粒10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以100W的功率超声混匀。再称取200毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯，以100W的功率超声混匀。将上述两种溶液混匀，于500转/分钟，150°C磁力搅拌条件下反应6小时。待反应结束后，以11，000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，即制得水溶性的蓝色上转换纳米颗粒。
[0065]3)水溶性稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI):将上述步骤制得的水溶性蓝色上转换纳米颗粒溶解至5毫升的去离子水中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入200微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于80°C加热，500转/分钟磁力条件下，搅拌反应12小时。待反应结束后，以9，000转/分钟，离心5分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，即制得可以吸附DNA的蓝色上转换基因纳米载体。
[0066]实施例4:
[0067]稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA至He Ia细胞，具体步骤如下:
[0068]I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体吸附质粒DNA:将权利要求3所述中制得的蓝色上转换基因纳米载体溶解至100微升的无菌去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入50微升无血清培养基OPT1-MEM和0.3微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入I微升装蓝色上转换基因纳米载体，并混匀后静止10分钟。
[0069]2)将稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述含有外源基因质粒DAN和蓝色上转换基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)细胞中，再于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养4小时后吸取培养液，并加入200毫升的新鲜完全培养液。培养48小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率，基因表达效率如图2所示。
[0070]实施例5:
[0071]稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA至He Ia细胞，具体步骤如下:
[0072]I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体吸附质粒DNA:将权利要求3所述中制得的蓝色上转换基因纳米载体溶解至100?500微升的无菌去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入100微升无血清培养基OPT1-MEM和0.1微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入I?5微升装蓝色上转换基因纳米载体，并混匀后静止20分钟。
[0073]2)将稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述含有外源基因质粒DAN和蓝色上转换基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)细胞中，再于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养6小时后吸取培养液，并加入300毫升的新鲜完全培养液。培养48小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率，基因表达效率如图2所示。
[0074]实施例6:
[0075]稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA至He Ia细胞，具体步骤如下:
[0076]I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体吸附质粒DNA:将权利要求3所述中制得的蓝色上转换基因纳米载体溶解至500微升的无菌去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入200微升无血清培养基OPT1-MEM和3微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入I?5微升装蓝色上转换基因纳米载体，并混匀后静止30分钟。
[0077]2)将稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述含有外源基因质粒DAN和蓝色上转换基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)细胞中，再于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养8小时后吸取培养液，并加入500毫升的新鲜完全培养液。培养48小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率，基因表达效率如图2所示。
[0078]实施例7:
[0079]形态观察、粒径及其分布测定。取介孔蓝色上转换纳米基因载体溶液经离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到介孔蓝色上转换纳米基因载体呈均匀规则的球形粒子，其直径在20?50nm范围内可控。所制得的纳米载体如图1所示。
[0080]本发明公开和提出的稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的制备方法及应用，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1.一种稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的制备方法;其特征是步骤如下: 1)稀土铥元素掺杂的蓝色稀土上转换纳米颗粒的制备:蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制备，制得的直径为20?50纳米； 2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒； 3)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺。2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤I)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米载体颗粒的制备方法步骤如下: 1)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒采用溶剂热法制得:将450毫克YCl3.6H20,200毫克YbCl3.6H20和I毫克?3毫克TmCl3.6H20溶解至I?2毫升去离子水中，于300?400转/分钟磁力搅拌条件下，加热至100?120°C直至稀土盐完全溶液变成白色固体； 2)待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至50?60°C，加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯，并升温至120?140°C使盐溶液完全溶解； 3)冷却至50?60°C，加入溶有50?60毫克氢氧化钠和100?150毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液;升温至110?120°C，采用油栗抽真空30?40分钟； 4)通入氩气，升温到310?320°C，在300?400转/分钟磁力条件下，搅拌反应50?60分钟； 5)待反应结束后加入丙酮离心纯化，得到蓝色上转换纳米颗粒。3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒，具体步骤如下: 1)取蓝色上转换纳米颗粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以90?10W的功率超声混匀； 2)称取150?200毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯，以90?100W的功率超声混匀； 3)将上述步骤2)中的溶液加入I)中，于300?400转/分钟，100?110°C磁力搅拌条件下反应5?6小时； 4)待反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心8?10分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，即制得水溶性的蓝色上转换纳米颗粒。4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤3)稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米颗粒表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下: 1)将水溶性蓝色上转换纳米颗粒溶解至2?3毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入75?100微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于15?20°C加热，300?400转/分钟磁力条件下，搅拌反应10?12小时，然后以12，000?13，000转/分钟，离心8?10分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的蓝色上转换纳米颗粒； 2)将上述沉淀全部加入去离子水中，并按照质量份数比碳二亚胺:N-羟基琥珀酰亚胺= 0.5:0.5?I，继续搅拌3?4小时后离心纯化，制得吸附DNA的蓝色上转换基因纳米载体。5.稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体应用转染外源绿色荧光蛋白质粒DNA至Hela细胞。6.如权利要求5所述的应用，其特征是: I)蓝色上转换基因纳米载体吸附质粒DNA:将蓝色上转换基因纳米载体溶解至100?150微升的无菌去离子水中；取一无菌的1.5毫升的离心管，加入80?100微升的OPT1-MEM无血清培养基和0.3?0.6微克的绿色荧光蛋白质粒DNA并充分混匀，再加入与质粒DNA的质量体积比为1:1?2的蓝色上转换基因纳米载体，并混匀后静止30?40分钟； 2)将蓝色上转换基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述含有外源基因质粒DAN和蓝色上转换基因纳米载体的复合物全部加入至一24孔板或48孔板的海拉细胞中，再于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养3?4小时后吸取培养液，并加入200?300毫升的新鲜完全培养液;培养18?20小时后于荧光显微镜观察并计算转染效率。7.稀土铥元素掺杂的蓝色上转换基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白质粒DNA至Hela细胞的转染效率为:40?70 %。
【文档编号】C12N15/85GK105861549SQ201610209491
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】常津, 郑斌, 王汉杰, 谌红彬, 潘慧卓
【申请人】天津大学