hCD46转基因五指山猪的制备方法
【专利摘要】本发明涉及hCD46转基因五指山猪的制备方法。所制备的hCD46转基因五指山猪具有SEQ ID NO:1所示的hCD46转基因五指山猪的特异性序列。CGMCC1204220160225
【专利说明】
hCD46转基因五指山猪的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及利用hCD46转基因五指山猪的制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着基因工程技术的迅速发展，转基因动物的研究开发十分迅速，在农业领域设 及畜禽的性状改良，在医学领域设及各种动物模型的创建及应用，有的转基因动物已经育 成了品系。
[0003] 尽管人类同种器官移植手术已经取得非常大的成功，但是器官移植面临供体器官 来源短缺等难题，已经成为阻碍器官移植实施的主要原因。在美国，W屯、脏移植为例，每年 因为同种异体器官短缺导致95% W上屯、脏病患者由于没有得到及时的移植而失去生命;在 中国，每年仅肝功能衰竭患者达数十万之多，绝大多数因需要肝供体缺乏而死亡。
[0004] 异种器官移植，是指将某一种动物的组织器官移植给另一种动物。目前研究主要 是将经过人源化修饰的猪组织或者器官移植给非人灵长类，W最大化的减少激烈排斥性的 免疫反应为目标。研究的最终目的是，克服物种间的各种排斥反应，将猪组织或器官能够W 最小的排斥反应移植给人。
[0005] 用猪的组织和器官替代人的组织器官有比其它动物非常重要的优势：（1)猪与人 的器官大小非常相似，解剖生理化指标等很相近；（2)猪的血型抗原在结构上与人也十分相 近；（3)猪的代谢与人类也很相似，猪膜岛素与人膜岛素在一级结构上只有一种氨基酸上差 另IJ，而且移植人体内的猪细胞生产的膜岛素能够维持糖尿病的血糖稳定；（4)容易饲养，成 熟早，繁殖快。
[0006] 然而，异种器官移植非常需要跨越的一个障碍就是超急性排斥反应化AR)。目前的 研究表明，在猪体内转人补体调控蛋白化皿an complement regulatoiy protein,hCRPs)， 如CD46、CD55或CD59,能够极大的对补体激活的途径进行调节。在运些hCRPs之中，人膜辅助 因子蛋白hCD46能够同时在经典和旁路途径两条途径中发挥调控补体激活的功能。
[0007] 产生高水平表达人CD 46化CD 46)的转基因猪，其能抑制体外补体介导的免疫排 斥反应，能够有效提高异种移植供体的存活时间，对于异种器官移植的研究应用有非常广 阔的前景。目前，国际上多个医学研究中屯、及研究组通过转基因技术获得了该类型转基因 猪模型。
[000引中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的贺伸、潘登科等人通过构建hCD46微小基 因表达载体，随机转染作为供核细胞的原代五指山小型猪的耳成纤维细胞，将获得的阳性 克隆细胞进行体细胞核移植，并进行胚胎移植获得了 hCD46转基因五指山猪。他们的研究显 示，获得的hCD46转基因五指山猪能够保护hCD46宿主细胞对抗补体介导的细胞裂解(Shen He等，Journal of Animal and Veterinary Advances 13(10) :620-626,2014)。但是，并未 鉴定hCD46微小基因表达载体在五指山小型猪基因组中的特定插入位置。换句话说，并未建 立所获得的hCD46转基因五指山猪的精确检测方法。
[0009]目前，针对转基因动物的出现，世界各国都加强了对此类动物的检测研究，成立了 转基因动物专口的检测机构和公司，并制定了相应标准对相关转基因动物W及转基因动物 产品进行规范。随着异种移植医学的深入研究，亟待建立针对异种移植用商用化小型猪的 通用检测方法，并制定相应标准来规范医用转基因动物的管理。
[0010] PCR技术是转基因农作物检测中应用最为广泛的技术。在应用运种技术进行转基 因农作物定性检测时，根据其扩增的祀标区域和特异性将其分为4类：1)筛选检测，W转基 因通用的外源启动子和终止子为祀标区域;2)基因特异性检测，W特异的外源目的基因为 祀标区域;3)构建物特异性检测，W转基因元件之间的特异性构建物为祀标区域;4)转化体 特异性检测，W转化体特异性片段为祀标区域。运4类检测方法对转基因农作物的检测特异 性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因动植物检测特异性最高的检测方法， 也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，本发明基于第4类检测方法对hCD46转基因 五指山猪的精确检测。
【发明内容】
[0011] 第一方面，本发明提供了一种分离的多核巧酸，其序列由SEQ ID N0:1所示。本发 明的发明人对所获得的、具有保护hCD46宿主细胞对抗补体介导的细胞裂解的活性的hCD46 转基因五指山猪的基础上，通过与已公布的野生五指山猪全基因组序列（http:// giga化.0巧/dataset/100031)进行全基因组数据比对，寻找外源序列与基因组接合的转化 特异性区域，最终在重测序的基因组数据中检索到了994bp的SEQ ID NO: 1序列，通过比对 发现，其中5'端l-479bp为转化载体序列，3'端480-994bp为五指山猪基因组序列。
[001^ 因此，沈Q ID NO: 1序列是转化体特异性序列，即所获得的hCD46转基因五指山猪 运个转基因品种所唯一特有的序列，是外源基因与基因组接合区序列。运种唯一性是由外 源转化载体序列W及外源转化载体在宿主基因组中的特定插入位点决定的。
[OOU]第二方面，本发明提供了hCD46转基因五指山猪的体细胞，其包含SEQ ID NO. 1所 不的序列。
[0014] 第S方面，本发明提供了hCD46转基因五指山猪的耳成纤维细胞(WPF19-167-EF)， 2016年2月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、（China General Microbiological Qilture Collection Center,CGMCC)，保藏号为CGMCC12042。
[0015] 第四方面，本发明提供了用于检测hCD46转基因五指山猪的特异性引物对:正向引 物为Fl: 5 ' -GGACAAACCACAACTAGAATG-3 ' ；反向引物为Rl: 5 ' -CTTGTGAGGAAGGAGCCAGA-3 '。发 明人基于上述SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列的1-479位碱基序列设计了正向引物Fl: 5'-GGACAAACCACAACTAGAATG-3'，基于SEQ ID N0:1所示核巧酸序列的480-994位碱基序列设计 了反向引物Rl: 5 ' -CTTGTGAGGAAGGAGCCAGA-3 '。
[0016] 第五方面，本发明提供了用于检测转基因猪的方法，所述方法包括如下步骤：（1) 基于转基因猪与野生型猪的全基因组比对获得转基因猪的特异性序列，即外源基因与基因 组的接合区序列；（2)基于所获得的外源基因与基因组的接合区序列设计正向引物和反向 引物；（3)采用所设计的正向引物和反向引物，利用从待测样品提取的DNA作为模板进行PCR 扩增；W及(4)验证扩增片段的序列，当待测样品的基因组扩增产物出现与所述特异性序列 相对应的扩增片段时，说明待测样品即为相应转基因猪的样品。
[0017] 第六方面，本发明提供了用于检测hCD46转基因五指山猪的方法，所述方法包括如 下步骤：（1)基于hCD46转基因五指山猪与野生型五指山猪的全基因组比对获得hCD46转基 因五指山猪的特异性序列SEQ ID N0:1，即外源基因与基因组的接合区序列；（2)基于所获 得的外源基因与基因组的接合区序列设计正向引物和反向引物；（3)采用所设计的正向引 物和反向引物，利用从待测样品提取的DNA作为模板进行PCR扩增；W及(4)验证扩增片段的 序列，当待测样品的基因组扩增产物出现与所述特异性序列SEQID NO: 1相对应的扩增片段 时，说明待测样品即为hCD46转基因五指山猪的样品。
[0018] 需要注意的是，根据一段已知序列采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的 引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采 用哪一对特异性引物，不同的人根据SEQ ID NO: 1即本发明的检测方法中的设计思路可能 会设计出不同的引物对，但都是基于本发明提供了转化体特异性序列SEQ ID NO: 1所示的 序列运个前提，因此都在本发明的保护范围内。
[0019] 第屯方面，本发明提供了用于检测hCD46转基因五指山猪的方法，所述方法包括如 下步骤：（1)基于所获得的外源基因与基因组的接合区序列SEQ ID N0:1设计正向引物和反 向引物；（2)采用所设计的正向引物和反向引物，利用从待测样品提取的DNA作为模板进行 PCR扩增；W及(3)验证扩增片段的序列，当待测样品的基因组扩增产物出现与所述特异性 序列SEQ ID NO: 1相对应的扩增片段时，说明待测样品即为hCD46转基因五指山猪的样品。
[0020] 第八方面，本发明提供了用于检测hCD46转基因五指山猪的方法，所述方法包括如 下步骤：（1)采用所设计的正向引物Fl: 5 ' -GGACAAACCACAACTAGAATG-3 '和反向引物Rl: 5 ' -CTTGTGAGGAAGGAGCCAGA-3 '，利用从待测样品提取的DNA作为模板进行PCR扩增；W及（2)验 证扩增片段的序列，当待测样品的基因组扩增产物出现与所述特异性序列SEQ ID N0:1相 对应的扩增片段时，说明待测样品即为hCD46转基因五指山猪的样品。
[0021] 第九方面，本发明提供了制备具有特异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转基因五指山 猪的方法，所述方法包括如下步骤：（1)将野生型五指山猪卵母细胞中的核去除；（2)将保藏 于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、（China General Microbiological Culture Collection Center ,CGMCC)，保藏号为CGMCC12042的hCD46转基因五指山猪的耳成纤维细 胞WPF19-167-EF作为体细胞核移植的供核细胞；（3)将供核细胞注入去核卵母细胞的卵周 隙中获得重构卵，并对重构卵激活；（4)对体外获得的重构卵进行胚胎移植；（5)基于所获得 的外源基因与基因组的接合区序列SEQ ID NO: 1设计正向引物和反向引物；W及(6)采用所 设计的正向引物和反向引物，利用从待测样品提取的DNA作为模板进行PCR扩增进行具有特 异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转基因五指山猪的验证。
[0022] 第十方面，本发明提供了制备具有特异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转基因五指山 猪的方法，所述方法包括如下步骤：（1)将野生型五指山猪卵母细胞中的核去除；（2)将保藏 于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、（China General Microbiological Culture Collection Center ,CGMCC)，保藏号为CGMCC12042的hCD46转基因五指山猪的耳成纤维细 胞作为体细胞核移植的供核细胞；（3)将供核细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中获得重构 卵，并对重构卵激活；（4)对体外获得的重构卵进行胚胎移植；（5)采用所设计的正向引物 Fl: 5 ' -GGACAAACCACAACTAGAATG-3 ' 和反向引物Rl: 5 ' -CTTGTGAGGAAGGAGCCAGA-3 '，利用从 待测样品提取的DNA作为模板进行PCR扩增，进行具有特异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转基 因五指山猪的验证。
[0023] 除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术术语，具有与本发明所属技术领域 的普通专业人员通常理解的相同的意义。
[0024] 补体的激活主要有立条途径:经典途径(classical pathway)、甘露糖结合凝集素 途径(mannose-binding lectin pathway)、旁路途径(alternative pathway)。经典途径主 要是抗原抗体复合物诱导的补体激活;甘露糖结合凝集素途径(M化途径，MP)是甘露糖残基 结合MMi舌化血清中与其相关的蛋白酶(MASP)，后者经过一系列补体调控因子，最终形成攻 膜复合物，形成对细胞膜的攻击;旁路途径是C3在B因子和D因子作用下直接裂解并形成C3 转化酶(C3Mb)，之后裂解C3形成巧转化酶(C3bnBb)，并最终形成攻膜复合物。S条激活途 经在形成巧转化酶之后具有共同的作用通路。人CD46基因主要在有核细胞表面编码四种不 同的亚型，发挥着不同的生物学功能。其中BCl亚型作为补体激活因子主要表达于多管腔类 组织内皮或上皮细胞表面，在异种移植研究中发挥更加重要的作用。
[0025] CD46最早于1985年由Colet等发现。他们在进行亲和层析时发现了一种特异性结 合于C3b的膜蛋白。后来研究发现其对C3b和C4b的裂解具有非常重要的辅助作用，起初命名 为MCP。随着对MCP研究的深入，研究者们认为它是补体调节系的一种新的蛋白，随后将其更 名为CD46。1993年，Johnstone和Loveland等人对人体的CD46分布和表达量进行了分析。 CD46在人体内的分布甚广，包括各种不同的组织和细胞。在不同的组织器官和细胞中表达 量有所不同，其在多管腔组织和外分泌腺中表达最高。在T细胞、B细胞粒细胞、内皮细胞、表 皮细胞血小板、成纤维细胞、NK细胞、造血细胞系及星状胶质细胞等均有表达。而在睾丸组 织中未检测到表达。人CD46基因定位于1号染色体长臂32区，基因全部长度大于43化，含有 14个外显子和13个内含子，编码四种不同的亚型，发挥不同的功能。由于不同的细胞表面表 达的CD46亚型不同，因此可调节经典和旁路两条补体激活途径的C3转化酶形成。由于大多 数正常细胞表面都有高水平的CD46的表达，因此可保护正常细胞免遭自身补体介导的损 伤。
[0026] 五指山猪是我国海南省特有的地方性小型猪品种。该品种已在海南岛封闭近交了 几千年，其已获得高度稳定的遗传背景和基因纯合度[66]。
[0027] 体细胞克隆技术主要采用体细胞核移植的方法进行。进行体细胞核移植，第一步 是将原卵母细胞的细胞核内遗传物质去除。原卵母细胞中的核的去除，能够保证克隆胚胎 正常发育而不受原卵母细胞核遗传物质的影响。体细胞核移植的第二步是，将供核细胞注 入去核的卵母细胞内。随着体细胞核移植技术的成熟，已经有多种注核方式应用于实践。
[0028] 本发明的hCD46转基因五指山猪在通过临床实验检测后，未来将可能成为在医学 上异体器官移植用商业化繁殖的转基因猪品系。本发明获得了 hCD46转基因五指山猪的转 化体特异性序列SEQ ID N0:1，为特异性鉴定转hCD46基因五指山猪提供了便利。本发明的 鉴定方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用 价值。本发明的检测方法可W普及用于未来异种移植用商用化转基因猪的检测。
[0029] 经本发明制备具有特异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转基因五指山猪的方法获得 了 hCD46转基因五指山猪，hCD46基因在转基因猪体内不同组织中具有类似于人内源性CD46 的表达模式;通过流式对比分析，我们观察到获得的转基因猪的耳成纤维细胞具有和人耳 成纤维细胞相当的CD46的表达。通过体外血清补体介导的细胞裂解试验，显示所构建的 hCD46转基因五指山猪的耳成纤维细胞系能够有效抵抗人类补体介导的细胞毒性作用。因 此，可W预期hCD46转基因五指山猪能抑制补体介导的免疫排斥反应，能够有效提高异种移 植供体的存活时间。
【附图说明】
[0030] 图1:显示了沈Q ID NO: 1的核巧酸序列。
[0031] 图2显示了 hCD46转基因五指山猪的转化特异性序列的引物设计示意图。
[0032] 图3显示了 hCD46微小基因表达载体的构建图。
[0033] 图4显示了用巧光素异硫氯酸醋结合的抗-CD46小鼠单克隆抗体免疫染色的hCD46 阳性克隆。
[0034] 图5显示了对转基因猪的组织进行组织切片染色分析的结果，hCD46在转基因猪组 织中具有明显的染色，而在阴性对照个体相应组织中没有观察到明显染色。
[0035] 图6显示了对分娩的10头转基因小猪进行RT-PCR鉴定的结果。其中，M泳道显示： DNA Marker DL2000;泳道1-10显示:hCD46转基因五指山仔猪的RT-PCR结果；泳道-显示：受 体母猪野生型对照的RT-PCR结果。
[0036] 图7显示了 hCD46转基因五指山猪的转化体特异性序列的PCR检测结果。其中，M泳 道显示：DNA Marker DL2000;泳道1显示:hCD46转基因五指山猪的标准品；泳道2-4显示：3 个阳性检测样品；泳道5显示：阴性检测样品（野生型五指山猪）。
[0037] 图8显示了经流式细胞术证实了 CD46在转基因猪的耳成纤维细胞中的表达水平与 人阳性对照细胞相比能达到30%。
[003引图9显示了 hCD46对宿主细胞的抗补体裂解保护作用的结果。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。运些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等的分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring 化rbor Laboratoiy Press, 2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
[0040] 实施例1制备hCD46转基因五指山猪
[0041] 1.制备供核细胞系
[0042] 选择健康的，体型特征明显的野生型原代五指山WPF19小公猪作为克隆原代。采集 WPF19个体的耳组织进行供核耳成纤维细胞系的构建:将耳组织剪成约Imm3大小的组织小 块，用移液器转移到T25的培养瓶中，平铺于底部，并向瓶中加入约5mL含20%FBS的DMEM完 全培养基，放入标准培养箱中进行培养，每两天更换一次培养基，待成纤维细胞系长至汇合 达80%，获得用于传代和冻存的供核耳成纤维细胞。
[0043] 2.hCD46微小基因表达载体的构建
[0044] 参见图3,构建大约9.化b的hCD46微小基因表达载体。所构建的hCD46微小基因表 达载体包括636bp的启动子序列，第一外显子/内含子，第二外显子/内含子，W及部分第= 外显子(68bp)，序列全长6227bp;人工合成了第3~14外显子(无第7外显子，和14外显子的 73bp)、终止密码子后的14个(共908bp)碱基及SV40PA，共计合成1275bp;将基因抓捕序列同 人工合成序列通过共有的酶切位点Bgl II进行拼接，形成拼接载体地S-hCD46;将抗性基因 连接至载体地S-hCD46，构建地S-hCD46-puro。线性化后用于体外转染。
[0045] 3. hCD46微小基因载体转染供核细胞
[0046] 所制备的供核耳成纤维细胞用于转染。取2 X IO6的细胞用膜酶消化化DTA-膜酶； Si卵a-Al化ich, St 丄OUiS ,MO,USA)，用憐酸盐缓冲盐水（PBS;Gibco 6化,Gaithersburg, MD,USA)洗涂两次，然后将IX IO6等份样品的细胞悬浮在含有化g上述步骤2制备的线性化 质粒DNA的100化的电穿孔缓冲液化onzainc. ,Wa化ersville，MD，USA)中。利用AMAXA转染仪 (Lonza Inc.),按照T-016程序进行电穿孔。将细胞接种到25cm2的培养皿中培养4她，然后 转移至20个IOOcm 2的培养皿上用嚷岭霉素选择阳性hCD46细胞15天直至长出细胞克隆。待 细胞长满后，膜酶消化孔中的细胞并传1/2至另一 24孔中；待再次长满后一孔用于鉴定，另 一孔用于冻存备用。用与巧光素异硫氯酸醋结合的抗-CD46小鼠单克隆抗体(FITC;Sigma-Al化ich，SAB4700431)对成活的克隆进行染色，进行平均巧光强度(MFI)的流式细胞术分析 (参见图4)。
[0047] 4.体细胞核移植与培养
[004引利用显微操作装置(NIKON TE2000-U，日本产），对染色强烈的克隆进行体细胞核 移植(SCNT)。体视显微镜下挑取胞质致密、卵丘包裹3层W上的卵母细胞。在成熟培养液中 培养20h后，再把卵母细胞转移到无 hCG和PMSG的成熟液中继续培养20h。成熟培养结束之 后，在体视镜下用Img/血透明质酸酶吹打卵丘细胞，至卵丘细胞从卵母细胞上脱落，然后挑 选第一极体排出、卵黄膜完整、卵周隙清楚的成熟卵母细胞，培养液中备用。采用显微操作 仪下盲吸去核法去除卵母的细胞核，并采用电融合法进行重构胚的激活。
[0049] 5.重构胚的体外培养和胚胎移植
[0050] 在体外对获得的重构细胞进行培养，12小时后挑选成功发育到1-2细胞期并且形 态良好的重构胚进行胚胎移植。胚胎移植的受体为自然发情的初情期的大白母猪。胚胎移 植的方法是通过手术法将受体母猪的卵巢拉出，查看受体母猪的发情状况，W卵泡发育较 好，且即将排卵的母猪为受体进行移植。将输卵管轻轻拉出，将胚胎注入输卵管的深部，每 头受体移植200枚左右的胚胎，共计移植6头受体母猪，移植胚胎数共1260枚。
[0化1] 6.hCD46转基因五指山猪的出生和鉴定
[0052] 6头受体母猪中妊娠 5头，3头自然分娩的方式分娩，共获得11头猪仔。对出生后一 周之内的小猪采样耳组织，进行DNA水平聚合酶链反应(PCR)的鉴定分析。经PC閒角认已经整 合进基因组的个体，根据所构建的微小基因表达载体序列设计跨内含子人CD-46化CD46)特 异性引物：
[0053] PRl：CCTGTGAGGAGCCACCAACATTTG
[0054] PR2:GATCTGGTCCAGGTGCAGGATCAC
[0055] 经RT-PCR进行转基因猪mRNA水平的初步鉴定。RT-PCR鉴定结果如图6所示。11头猪 仔中鉴定出10头转基因小猪，结果参见下表1。
[0056] 表1转基因猪生产效率 Gpnc~7l
[005引待I月龄时，取经鉴定为阳性的转基因猪个体处死，采集屯、、脾、肺、肾、膜腺等组织 进行转人CD46基因蛋白水平表达的免疫组化切片分析，W阴性野生型五指山WPF19猪的相 应组织作为对照，一抗为:兔抗人CD46单克隆抗体(Abeam,美国；#AB108307);二抗为：生物 素化羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术公司），免疫组化染色结果参见图5,可W看出， hCD46在转基因猪组织中具有明显的染色，而在阴性对照个体相应组织中没有观察到明显 染色。
[0059] 7.转基因猪耳成纤维细胞系的建立W及流式分析hCD46的表达
[0060] 采集经鉴定为阳性转基因猪的耳组织建立成纤维细胞系，耳成纤维细胞系建系方 法参照上述供核细胞系的建系方法。细胞系经传代培养后，用FITC标记鼠源抗人CD46抗体 对所建立的耳成纤维细胞系进行染色，然后上机进行流式分析，流式细胞术的分析结果参 见图8。
[0061 ] 建成的耳成纤维细胞系WPF19-167-EF于2016年2月25日保藏于中国普通微生物菌 种保藏管理中屯、（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏号为CGMCCl2042。
[0062] 8. hCD46对宿主细胞的抗补体裂解保护作用
[0063] 将所建立的hCD46转基因耳成纤维细胞(WPF19-167-EF，保藏号为CGMCC12042)解 冻培养，细胞长满后精确计数，W等量细胞接种到24孔培养板中，阴性个体耳成纤维细胞作 为对照。向每个孔中加入化M的化Ice in-AM，放入培养箱中培养Ih。分别加入20 %的ABO血型 血清及FBS的培养基来处理细胞，每种血清3个孔，解育培养化。将所有细胞消化后吸出，用 流式细胞仪直接检测所解育的细胞巧光强度，分析细胞的裂解情况;统计分析采用SPSS版 本 19.0。
[0064] 结果显示：（1)经四种不同人血型血清处理的转基因耳成纤维细胞的死亡率均在 20% W下，而野生型耳成纤维细胞的死亡率在30%~80%之间，且分析同一种血型血清中 野生型耳成纤维细胞死亡率均显著性高于转基因耳成纤维细胞（图9A); (2)通过对同一细 胞系不同血型血清之间的分析，四种血型中B血型血清所处理的细胞死亡率明显低于其它 S种血型的死亡率（图9B); (4)通过两因素方差分析(表2)显示：细胞系和血型对细胞死亡 率都有极显著的影响，转基因处理对细胞的死亡率影响(F= 1024.580，P<0.0 Ol)明显大于 血型处理对死亡率的影响（F= 110.184P<0.001)，且两者之间存在明显交互作用（P< 0.001)。
[0065] 因此，可W看出从本发明的hCD46转基因猪制备的hCD46转基因猪耳成纤维细胞受 到了明显的保护作用。可W预期本发明制备的hCD46转基因五指山猪能抑制补体介导的免 疫排斥反应。
[0066] 实施例2 hCD46转基因五指山猪的精确检测
[0067] 1.获得hCD46转基因五指山猪特异性序列
[0068] 基于二代重测序方法获得了 hCD46转基因五指山猪的全基因组数据，将该数据与 已公布的野生型五指山猪全基因组序列化ttp: //giga化.o;rg/dataset/100031)进行全基 因组数据比对，寻找到了外源序列与基因组接合的转化特异性区域，最终在重测序的基因 组数据中检索到了SEQ ID NO: 1序列（参见图1)，通过比对发现，SEQ ID NO: 1序列的1-479bp为转化载体序列化CD46微小基因表达载体序列），480-994bp为五指山猪基因组序列 (参见图2)。即，该SEQ ID NO: 1序列为的本发明制备的hCD46转基因五指山猪的转化体特异 性序列，旨化CD46转基因五指山猪运个转基因品种所唯一拥有的序列。运种唯一性由外源转 化载体序列化CD46微小基因表达载体序列）W及外源转化载体在宿主基因组的特定插入位 置决定。
[0069] 2.基于所获得的hCD46转基因五指山猪特异性序列设计引物
[0070] 本发明获得的转化体特异性序列SEQ ID NO: 1的5'端l-479bp为转化载体序列 化CD46微小基因表达载体序列），3'端480-994bp为五指山猪基因组序列。基于SEQ ID N0:1 所示的该hCD46转基因五指山猪转化体特异性片段，由该特异性序列设计引物，正向引物的 设计基于在5'端l-479bp位置，反向引物的设计基于在3'端480-994bp位置(参见表2)。
[0071] 表2.hCD46转基因五指山猪的转化体特异性的PCR引物 「007)1
LUU/J」：^.利用太盤疋上化hUL)4(3巧巷因立巧山巧
[0074] 3.1实验材料
[0075] 动物材料
[0076] 实例1中获得的4头hCD46转基因五指山猪，W及1头野生型（阴性)五指山猪均来源 于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。
[0077] 酶与试剂
[0078] 分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker购自宝生物工程(大连） 有限公司大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。上述 转化体特异性的PCR引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。
[0079] 实验仪器
[0080] PCR扩增仪：Eppendorf Master巧cle gradient化ppendorf Co.)
[0081 ]核酸电泳仪:DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂）
[0082] DNA电泳分析系统:Kodak EDAS 290化Odak CO.)
[0083] 其它仪器包括:离屯、机，恒溫加热板，培养箱等。
[0084] 3.2实验方法和过程
[00化]3.2.1基因组DNA的提取与检测 [00化]基因组DNA的提取
[0087] 取五指山猪耳组织样品作为DNA提取的材料，依照柱式ZR Genomic DNA II Kit? 试剂盒(北京天漠科技开发有限公司）的操作手册，进行动物材料总DM的提取。
[0088] 基因组DNA的检测
[0089] 取扣I提取的DNA溶液，W0.8 %的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断 提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
[0090] 3.3鉴另化CD46转基因五指山猪的转化体特异性PCR方法
[0091] 采用引物F1/R1组合(参见表2的序列），检测来自中国农业科学院北京畜牧所的5 个五指山猪样品。
[0092] PCR的反应体系为：
[0093] 0.2扣L rTaq(5U/iiL)，化L IOXPCR Buffer(Mg2+Plus)，化L dNTP(各2.5mM)，引物 各化L(IOyM)，模板各化L(20ngAiL)，加灭菌蒸馈水补足体积至50化。
[0094] 扩增程序为：
[0095] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，59°C 退火 30sec，72°C 延伸 45sec，35 个循环;72 °C10min。
[0096] 检测来自中国农业科学院北京畜牧所的5个五指山猪样品，结果参见图7,第1-4泳 道对应于hCD46转基因五指山猪，第5泳道对应于野生型五指山猪。
[0097] 实验结果表明，检测的5个样品中的4个（图7中对应于第1~4号泳道的样品）能扩 增获得相同大小的片段，也就是说，hCD46转基因五指山猪能特异性扩增出834bp大小的产 物，图7中对应于第5号泳道的样品不能扩增得到相同大小的片段，因此，检测结果与已知样 品转基因情况相一致。
[0098] 扩增样品送中美泰和生物技术(北京)有限公司测序，经序列分析，结果表明，扩增 片段序列与序列SEQ ID NO: 1的第51-884位完全一致。检测结果表明本发明提供的PCR方法 能很好地鉴别五指山样品中是否含转hCD46基因五指山猪的样品。
[0099] 可W看出，采用表2所示的正反向引物(F1/R1)，对待测品的基因组进行PCR扩增， 是一种检测未知转基因五指山品系是否是转hCD46基因及其子代的有效手段。在检测中，由 于设计的正反向引物的正确祀标序列就是其设计所依据的转化体特异性序列，即SEQ ID NO: 1，即事先已经非常清楚引物在祀标序列上的识别位置和祀标序列片段长度，因此能够 预先计算出扩增产物应该大概为多长，当某个待测品的基因组扩增产物出现相应长度的扩 增片段时，说明该品系就是转hCD46基因五指山的品种或其子代。
[0100] 实施例3制备具有特异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转基因五指山猪
[0101] 参考实施例1的方法，通过如下步骤制备具有特异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转 基因五指山猪：（1)将野生型五指山猪卵母细胞中的核去除；（2)将保藏于中国普通微生物 菌种保藏管理中屯、（化ina General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏号为CGMCC12042的hCD46转基因五指山猪的耳成纤维细胞WPF19-167-EF作为 体细胞核移植的供核细胞；（3)将供核细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中获得重构卵，并对 重构卵激活；（4)对体外获得的重构卵进行胚胎移植；（5)基于所获得的外源基因与基因组 的接合区序列SEQ ID N0:1设计正向引物和反向引物；W及(6)采用所设计的正向引物和反 向引物，利用从待测样品提取的DNA作为模板进行PCR扩增进行具有特异性序列SEQ ID NO: 1的hCD46转基因五指山猪的验证。引物可W参考实施例2中的引物对：正向引物Fl: 5'-GGACAAACCACAACTAGAATG-3 ' 和反向引物Rl: 5 ' -CTTGTGAGGAAGGAGCCAGA-3 '。
【主权项】
1. 制备具有特异性序列SEQ ID NO: 1的h⑶46转基因五指山猪的方法，所述方法包括如 下步骤：（1)将野生型五指山猪卵母细胞中的核去除；（2)将保藏于中国普通微生物菌种保 藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保 藏号为CGMCC12042的hCD46转基因五指山猪的耳成纤维细胞WPF19-167-EF作为体细胞核移 植的供核细胞；（3)将供核细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中获得重构卵，并对重构卵激 活；（4)对体外获得的重构卵进行胚胎移植；（5)基于所获得的外源基因与基因组的接合区 序列SEQ ID N0:1设计正向引物和反向引物；以及(6)采用所设计的正向引物和反向引物， 利用从待测样品提取的DNA作为模板进行PCR扩增进行具有特异性序列SEQ ID NO: 1的 h⑶46转基因五指山猪的验证。2. 制备具有特异性序列SEQ ID NO: 1的h⑶46转基因五指山猪的方法，所述方法包括如 下步骤：（1)将野生型五指山猪卵母细胞中的核去除；（2)将保藏于中国普通微生物菌种保 藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保 藏号为CGMCC12042的hCD46转基因五指山猪的耳成纤维细胞WPF19-167-EF作为体细胞核移 植的供核细胞；（3)将供核细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中获得重构卵，并对重构卵激 活；（4)对体外获得的重构卵进行胚胎移植；（5)采用所设计的正向引物F1 :5'_ GGACAAACCACAACTAGAATG-3 ' 和反向引物R1:5 ' -CTTGTGAGGAAGGAGCCAGA-3 '，利用从待测样 品提取的DNA作为模板进行PCR扩增，进行具有特异性序列SEQ ID NO: 1的h⑶46转基因五指 山猪的验证。
【文档编号】A01K67/027GK105861562SQ201610258494
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】潘登科, 石宁宁, 冯冲, 龙川, 李西睿
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所