一种CpG ODNs的合成方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种CpG ODNs的合成方法与应用。本发明通过化学方法全序列合成得到形串联重复CpG序列的线性序列，接着用磷酸激酶或连接酶将线性序列连接成环形，得到环形模板；采用引物酶对环形模板等温扩增，得到CpG ODNs。本发明提供的合成方法不使用引物和内切酶，能一次性合成毫克级别的CpG ODNs，能用于规模化药用原料制备。
【专利说明】
一种CpG ODNs的合成方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种寡核苷酸的合成方法，特别涉及一种CpG ODNs的合成方法与应用。
【背景技术】
[0002]CpG ODNs序列指一系列非甲基化的CpG为核心的核苷酸序列，具有免疫刺激活性。
[0003]CpG ODN可抵御诸如疱疹、腹膜炎、肝炎、肾小球肾炎等多种疾病。鱼、鸟及哺乳类动物对细菌DNA具有识别和应答反应。数亿年来CpG的进化说明CpG介导的免疫活化作用对宿主提供保护作用。为研究这一假设，学者们在鼠体内注入细菌DNA或CpG ODN用于抵抗各种致病病原体。受试动物用致病病原体包括高剂量炭疽热病毒、李斯特菌属(Listeria)以及土拉菌病病毒、疱疹病毒，同时还包括黑热病、疟疾等寄生虫的侵袭。在感染上述病毒的几天内。CpG ODN免疫活性达到最高峰。在感染鼠体内接种CpG ODN可显著增强其细胞免疫和体液免疫，同时也可以有效提高感染大肠杆菌的猪的免疫保护及防御能力。新生鼠感染小球隐孢子虫致腹腔炎症后6d内，腹腔内注射CpG ODN或口服给药均可控制和减缓腹腔炎症，作者认为可能存在两种作用机制，一是CpG/TLR9相互作用和影响可释放各种炎症细胞因子激活免疫细胞，二是推测存在一种新的不依赖于TLRP的CpG抗感染作用机制。Kodama等在鼠的动物实验中也证实:经由鼠鼻部吸入给予CpG ODN可安全有效地治疗上呼吸道感染。另有研究表明:CpG ODN可减缓或预防病理性免疫刺激，包括自身免疫性疾病、如肾小球肾炎以及感染性休克等疾病;也可对金葡菌感染诱发大鼠乳腺炎的乳腺产生保护作用;持续14d注射CpG 0DN，可减轻Balb/c鼠的口蹄疫病症，有效控制其疾病的传播和蔓延。
[0004]CpG ODN抗感染免疫已在临床研究中应用。如将CpGODN作为佐剂利用双盲法应用于乙型肝炎疫苗Engerix B中，健康成人受试者在CpG ODN+疫苗联合应用组较单独用疫苗组IgG抗体应答产生更为迅速。在初次免疫及再次免疫后其平均抗体产生分别提高13?45倍。同单独应用Fluarix疫苗相比，应用加CpG ODN后的Fluarix流感疫苗，机体先天性抗体应答没有升高，但个体中流感病毒特异性抗体数量显著上升。这些研究均表明通过控制致病菌早期生长和繁殖速度，CpG治疗可提高宿主免疫能力，进而产生抑菌的获得性免疫应口 ο
[0005]CpG ONA可引起宿主免疫应答从而提高宿主抵御各种病原微生物感染的能力，对加速免疫反应诱导快速的抗感染免疫应答至关重要。未甲基化CpG基序具有引发先天性免疫系统应答的能力确保其对生物攻击提供防御反应，成功地执行了免疫策略中的“警铃”作用，易感染体的靶向介定可减少致病原传递的可能，进而增强对感染的共同防御。TLR9介导的CpG ODN引起的各项作用可能帮助我们对天然免疫系统更好地了解，并为感染性疾病的免疫治疗提供依据。
[0006]DNA序列大量合成可采用化学合成，但是化学法大量合成特定序列成本高昂；常见的寡聚核苷酸合成仅用于微量合成如微克级引物合成，用于检测目的；聚合酶链式反应合成双链DNA仅产生微克级的DNA，并且所用引物使成本增加，无法用于大量如毫克级以上DNA 合成。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种CpGODNs的合成方法。该方法采用环形DNA模板，噬菌体或其宿主菌解旋酶/引物酶合成引物，DNA聚合酶合成与模板对应的寡核苷酸链，从而完成CpG ODNs合成。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种CpGODNs的合成方法，包括如下步骤:
[0009](I)模板合成:
[0010]①设计环形串联重复CpG序列，化学方法全序列合成得到线性序列；
[0011 ]②用磷酸激酶或连接酶将步骤(I)的线性序列连接成环形，得到模板；
[0012](2)CpG ODNs合成:采用引物酶对步骤(I)得到的模板等温扩增，得到CpG ODNs。
[0013]步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列为依据使用目的不同设计不同的重复序列，重复的单元序列之间由2?6个随机碱基序列隔开。
[0014]步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列中每个重复单元的长度优选为20?10bp ；更优选为30?40bp。
[0015]步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列为DNA形式、RNA形式或DNA/RNA形式。
[0016]步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列优选为:
[0017]p-(5，-GffffTCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGATGGGGffff-3，)20。
[0018]P表示5，端为磷酸化基团;W为兼并碱基，为A或T; 20表示20个串联重复。
[0019]步骤(I)②中所述的连接的反应条件如下:
[0020]反应体系为:每50yL反应体系中:步骤(I)的线性序列50yg，MgCl2 6.6mM，DTT1mM,ATP 0.1111]\^40嫩连接酶51]4!1 7.6的Tris-HCl 50mM、水余量；
[0021]37°C反应20hrs后回收，得到环形模板。
[0022]步骤(2)中所述的等温扩增的反应体系为不含引物和内切酶的反应体系，优选如下:每25μ1含如下A组分和B组分:
[0023]A 组分:
[0024]ΡΗ 7.5的1^8-谷氨酸缓冲液201111，011' 6mM,MgCl2 9mM，谷氨酸钾50_500mM，每种dNTPs 100-2000μΜ, rATP/rGTP/rUTP/rCTP 30_1000yM，BSA 0.01-0.08mg/ml，单链DNA结合蛋白l_8mg，野生型T7DNA聚合酶0.04_4mg，缺乏3，-5，外切酶活性的T7DNA聚合酶0.4_40mg，解旋酶/引物酶0.4-4mg，核苷酸二磷酸激酶25-1000ng，焦磷酸酶15_15000ng，肌酸激酶75-1 OOOyg，肌酸磷酸盐I OmM;
[0025]B组分:0.1-1Oyg环形模板。
[0026]反应操作步骤如下:
[0027]I)去除反应体系中A组分的污染DNA;
[0028]2)接着加入B组分，37 °C反应30?1200min，然后终止反应；
[0029]3)分离纯化DNA。
[0030]步骤I)中所述去除反应体系中A组分的污染DNA可采用短波紫外线照射方法，照射能量为200yW/cm2、2min，可去除99%酶制剂来源污染;而酶活性下降不超过20 %。
[0031 ]步骤2)中所述的37 0C反应的时间优选为120min。
[0032]步骤2)中所述的终止反应的条件优选为65°C反应5?20min。
[0033]步骤3)中所述的分离纯化DNA的方式优选为通过酚抽提乙醇沉淀方法或阴离子交换层析分离纯化DNA。
[0034]所述的谷氨酸钾的终浓度优选为90?I 1mM;更优选为100mM。
[0035]所述的dNTPs的终浓度优选为500?700μΜ;更优选为600μΜ。
[0036]所述的rATP/rGTP/rUTP/rCTP的终浓度优选为400?600μΜ;更优选为500μΜ。
[0037]所述的BSA的终浓度优选为0.04?0.06mg/ml ；更优选为0.05mg/ml。
[0038]所述的单链DNA结合蛋白的终浓度优选为3?5mg;更优选为4mg。
[0039]所述的野生型T7DNA聚合酶的终浓度优选为0.04?0.05mg ；更优选为0.04mg。
[0040]所述的缺乏3’ -5 ’外切酶活性的T7DNA聚合酶的终浓度优选为0.4?0.5mg;更优选为0.4mg0
[0041 ] 所述的解旋酶/引物酶的终浓度优选为0.4?0.5mg ；更优选为0.4mg。
[0042 ]所述的核苷酸二磷酸激酶的终浓度优选为900?I OOOng ；更优选为Iyg。
[0043 ] 所述的焦磷酸酶的终浓度优选为14000?15000ng ；更优选为15yg。
[0044]所述的肌酸激酶的终浓度优选为700?800yg;更优选为750yg。
[0045]所述的肌酸磷酸盐优选为肌酸磷酸钠或肌酸磷酸钾。
[0046]所述的肌酸磷酸的终浓度优选为9?I OmM ；更优选为I OmM。
[0047]所述的环形模板的用量优选为lyg。
[0048]所述的单链DNA结合蛋白优选为T7单链DNA结合蛋白。
[0049]所述的解旋酶/引物酶优选为T7解旋酶/引物酶。
[0050]所述的野生型T7DNA聚合酶为相对于缺乏3，_5，外切酶活性的T7DNA聚合酶而言，野生型T7DNA聚合酶指的是未经任何改造的T7DNA聚合酶。
[0051 ]文中，含T7名称的物质指的是T7噬菌体来源的物质，如T7单链DNA结合蛋白为T7噬菌体来源的单链DNA结合蛋白等。
[0052]上述反应体系中的浓度为终浓度。
[0053]所述的CpGODNs的合成方法能一次性合成毫克级别的CpG ODNs，因此特别适合应用于大规模制备CpG ODNs，规模化制备药用原料。
[0054]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0055](I)本发明所提供的合成方法不使用引物和内切酶，原理是通过解旋酶/引物酶在DNA双链上合成小片段引物，由于引物末端有3，-OH结构，诱导DNA聚合酶延伸DNA单链，完成序列合成。
[0056](2)本发明提供的合成方法能一次性合成毫克级别的CpG ODNs，能用于规模化药用原料制备。
【附图说明】
[0057]图1是CpGODN对人外周单核细胞分泌细胞因子的刺激作用的检测结果图；其中，图A为IFN- γ因子的检测结果图，图B为IL-8因子的检测结果图。
【具体实施方式】
[0058]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0059]实施例1
[0060](I)CpG ODN模板合成设计DNA序列
[0061 ] p-(5’-GT/AT/ATCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGATGGGGT/AT/A-3’)20，以化学方法全序列合成，经测序鉴定后，按如下反应操作合成环形DNA:
[0062]每50yL反应体系中:含上述序列50yg，50mMTris-HCl,pH 7.6，6.6mM MgCl2,1mMDTT，0.1mM ATP，T4DNA 连接酶 5U(Weiss Unit)； 37 °C 20hrs。回收超螺旋连接产物。
[0063](2)合成反应
[0064]准备25mL反应体系:
[0065]Tris-谷氨酸缓冲液20mM、pH 7.5；
[0066]6mM DTT ；
[0067]9mM MgCl2;
[0068]10mM谷氨酸钾；
[0069]600μΜ 每种 dNTPs;
[0070]500μΜ rATP/rGTP/rUTP/rCTP；
[0071]0.05mg/ml BSA；
[0072]4mg T7单链DNA结合蛋白(按文献“Kim,Y.T.,Tabor,S.,Bortner ,C.,Griffith,J.D.and Richardson，C.C.(1992).Purificat1n and characterizat1n of thebacter1phage T7 gene 2.5 protein.A single-stranded DNA—bindingprotein.J.B1l.Chem.,267,15022-15031.，，制备)；
[0073]0.04mg野生型T7 DNA聚合酶(按文献“Hori，Κ.,Mark,D.F.and Richardson,C.C.(1979).Deoxyribonucleic acid polymerase of bacter1phage T7.Purificat1n andproperties of the phage-encoded subunit,the gene 5protein.J.B1l.Chem.,254,11591-11597/’ 制备)或(PR0MEGA);
[0074]0.4mg T7 DNA聚合酶(缺乏3’-5’ 外切酶活性)(按文献“Hori，K.，Mark，D.F.andRichardson,C.C.(1979).Deoxyribonucleic acid polymerase of bacter1phageT7.Characterizat1n of the exonuclease activities of the gene 5 protein andthe reconstituted polymerase.J.B1l.Chem., 254,11598-11604” 制备)；
[0075]0.4mg T7解旋酶/引物酶(按文献 “Matson，S.W.and Richardson ,C.C.(1983).DNA-dependent nucleoside 5’-triphosphatase activity of the gene 4 protein ofbacter1phage T7.J.B1l.Chem.，258，14009-14016.，，制备)；
[0076]Iyg核苷酸二磷酸激酶；
[0077]15yg焦磷酸酶；
[0078]750yg肌酸激酶；
[0079]1mM肌酸磷酸钠。
[0080]以上反应液装入石英管，短波UV照射2min(200yW/cm2)。
[0081 ] 加入Iyg环形DNA模板(S卩步骤(I)制备得到的超螺旋连接产物)，置37°C 120min。
[0082] 置65°C5min，以终止反应。
[0083](3)产物纯化
[0084]在步骤(2)得到的CpGODN合成产物中加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4°C下1200(^离心10分钟。
[0085]取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4°C下12000g离心10分钟。
[0086]取上层水相，加入相当于上层水相1/5体积的NaCl溶液(NaCl溶液的浓度为4mol/U，以及加入PEG6000，PEG6000的加入量按每1mL上层水相加入Ig PEG6000计算，冰上放置60分钟。
[0087]4°C下12000g离心15分钟，沉淀用5mL 70 %-20 V冰冷乙醇洗涤，4 °C下12000g离心5分钟。
[0088]真空抽干沉淀，溶于5ml TE或水中。
[0089](4)CpG ODNs含量检测方法:
[0090](a)取5μ1 CpG ODNs样品加水到Iml;打开紫外分光光度计电源；
[0091](b)用Iml水做空白；
[0092](C)把样品杯放在分光光度计比色槽上；
[0093](d)每μ?中CpG ODNs浓度(yg)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2，则原CpG ODNs样品浓度为2yg/yl。
[0094](e)实测检测3批结果为:I.28μδ/μ1、I.50μδ/μ1、I.25yg/yl。对应产率为6.4mg、7.5mg、6.0mg0
[0095](5) CpG ODN对PBMC细胞刺激效应
[0096]用淋巴细胞分离液分离来自广东省健康人外周血单核细胞(PBMC)，置24孔板培养，2 X 15细胞/孔，加入ImL含有5yg CpG ODN的培养基，对照组用培养基。培养16hrs后，收集上清，ELI SA方法(使用细胞因子分析试剂盒里)分析上清中的细胞因子(IFN- γ和IL-8)含量。
[0097]结果如图1所示，本发明制备的CpGODN具有良好的免疫刺激作用。
[0098]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种CpG ODNs的合成方法，其特征在于包括如下步骤: (1)环形模板合成: ①设计环形串联重复CpG序列，化学方法全序列合成得到线性序列； ②用磷酸激酶或连接酶将步骤(I)的线性序列连接成环形，得到环形模板； (2)CpGODNs合成:采用引物酶对步骤(I)得到的环形模板等温扩增，得到CpG ODNs。2.根据权利要求1所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于: 步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列为依据使用目的不同设计不同的重复序列，重复的单元序列之间由2?6个随机碱基序列隔开； 步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列为DNA形式、RNA形式或DNA/RNA形式。3.根据权利要求1所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于:步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列中每个重复单元的长度为20?lOObp。4.根据权利要求1所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于: 步骤(I)①中所述的环形串联重复CpG序列为: p-(5 ’-GffffTCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGATGGGGffff-3’)20; P表示5，端为磷酸化基团;W为兼并碱基，为A或T; 20表示20个串联重复。5.根据权利要求1所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于: 步骤(I)②中所述的连接的反应条件如下: 反应体系为:每50yL反应体系中:步骤(I)的线性序列50yg,MgCl2 6.6mM，DTT 1mM,ATP0.1111]\^40嫩连接酶51]4!1 7.6的Tris-HCl 50mM、水余量； 37 °C反应20hr s后回收，得到环形模板。6.根据权利要求1所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的等温扩增的反应体系为不含引物和内切酶的反应体系，如下:每25μ1含如下A组分和B组分: A组分: pH 7.5的1^8-谷氨酸缓冲液201111，011' 6mM,MgCl2 9mM，谷氨酸钾50_500mM，每种dNTPs100-2000μΜ，rATP/rGTP/rUTP/rCTP 30-1 ΟΟΟμΜ，BSA 0.01-0.08mg/ml，单链 DNA 结合蛋白 1-8mg，野生型T7DNA聚合酶0.04_4mg，缺乏3，-5，外切酶活性的T7DNA聚合酶0.4_40mg，解旋酶/引物酶0.4-4mg，核苷酸二磷酸激酶25-1000ng，焦磷酸酶15-15000n，肌酸激酶75-1000μg，肌酸磷酸盐I OmM; B组分:0.1-1Oyg环形模板； 反应操作步骤如下: 1)去除反应体系中A组分的污染DNA； 2)接着加入B组分，370C反应30?1200min，然后终止反应； 3)分离纯化DNA。7.根据权利要求6所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于: 步骤I)中所述去除反应体系中A组分的污染DNA为采用短波紫外线照射方法，照射能量为200yW/cm2、2min; 步骤2)中所述的37 °C反应的时间为120min; 步骤2)中所述的终止反应的条件为65°C反应5?20min; 步骤3)中所述的分离纯化DNA的方式为通过酚抽提乙醇沉淀方法或阴离子交换层析分离纯化DNA。8.根据权利要求6所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于: 所述的谷氨酸钾的终浓度为90?11OmM; 所述的dNTPs的终浓度为500?700μΜ; 所述的 rATP/rGTP/rUTP/rCTP 的终浓度为400 ?600μΜ; 所述的BSA的终浓度为0.04?0.06mg/ml ； 所述的单链DNA结合蛋白的终浓度为3?5mg; 所述的野生型T7 DNA聚合酶的终浓度为0.04?0.05mg； 所述的缺乏3 ’ -5 ’外切酶活性的T7DNA聚合酶的终浓度为0.4?0.5mg; 所述的解旋酶/引物酶的终浓度为0.4?0.5mg ； 所述的核苷酸二磷酸激酶的终浓度为900?100ng; 所述的焦磷酸酶的终浓度为14000?15000ng; 所述的肌酸激酶的终浓度为700?800yg ； 所述的肌酸磷酸的终浓度为9?1mM; 所述的环形模板的用量为lyg。9.根据权利要求6所述的CpGODNs的合成方法，其特征在于: 所述的单链DNA结合蛋白为T7单链DNA结合蛋白； 所述的解旋酶/引物酶为T7解旋酶/引物酶； 所述的肌酸磷酸盐为肌酸磷酸钠或肌酸磷酸钾。10.权利要求1?9任一项所述的CpGODNs的合成方法在规模化制备CpG ODNs中的应用。
【文档编号】C12P19/34GK105861599SQ201610240333
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月18日
【发明人】李军涛, 赵金红
【申请人】李军涛