从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法

文档序号:10506007
从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法
【专利摘要】本发明公开了从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,步骤如下:(1)将活化的枯草芽孢杆菌接种于普通马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,摇床培养3d,将培养液离心,取上清液,得到枯草芽孢杆菌发酵液;(2)将枯草芽孢杆菌发酵液离心取上清,调节pH为2.5?3.0,4℃放置过夜;(3)发酵液离心,沉淀用甲醇萃取2?3h;(4)将浓缩后的甲醇萃取液上葡聚糖凝胶G?100分离,得到对桑椹致腐真菌抑制率高且成分单一的抑菌物质。该方法工艺简便,易于工业化规模生产。
【专利说明】
从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种活性物质的分离方法,具体地讲是涉及一种提取枯草芽孢杆菌中抗真菌活性物质--泛革素(F engycins)的方法。
【背景技术】
[0002]枯草芽胞杆菌产生的拮抗物质主要有抗生素、抗菌蛋白及挥发性抗菌物质等,其中脂肽抗生素是一个较大的类群,具有抗性强,耐高温,耐酸碱的特点,对蛋白酶也有很好的抗性。脂肽抗生素能够广谱抑制植物病原菌,同时具有低毒性并且能够被微生物降解,具备开发为环保型生物源农药的条件。
[0003]生防芽孢杆菌脂肽抗生素包括三大类群:表面活性素类(surfactins)、伊枯草菌素类(iturins)和泛革素类(fengycins)。泛革素类的分子量为1500左右,由10个氨基酸和长度为14-18个的碳链的脂肪酸相连。作为防治效果较好的枯草芽孢杆菌,可以代替一些农药或添加剂的使用,更符合现代安全、高效、绿色环保的理念。对其活性成分的高效提取,可以让枯草芽孢杆菌更好的发挥作用。脂肽类抗生素的分离纯化主要是依据其理化性质,通常需要沉淀、萃取、层析、高效液相色谱等步骤。沉淀目的是将脂肽抗生素从细菌发酵液中沉淀下来O沉淀方法有多种,如硫酸钱(80% )沉淀、MnCl2(7OmmoI/L)沉淀、浓盐酸(12moI/L)沉淀等。对于含有多种脂肽抗生素的样品可以利用液质联用(LC-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)、源后衰变结合基质辅助激光解吸飞行时间质谱(PSD-MALD1-T0F-MS)等技术进行分析。谭广秀等(2012)在《蚕业科学》报道从桑枝组织中分离出有抑菌作用的枯草芽孢杆菌ME,对大肠杆菌(Escherichia col i )、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蕈状芽抱杆菌(Bacillus mycoides)和白僵菌(Beauveria bassiana)的体外抑制率分别为59.92%、75.70%,51.60%,87.25%和69.81%。进一步实验表明,在平板抑菌实验中,该枯草芽孢杆菌ME菌悬液对桑椹致腐菌中核盘菌属(Sc IerotiniaSc Ierot1rum ,GA)和链格孢属(Alternariasp,GE)抑制率可以达到77.88%和80.61%。在桑椹采后保鲜中,采用该枯草芽孢杆菌细胞悬液或发酵液处理后,可以降低桑椹的发霉腐败。徐杨等(2009)在《中国生物防治》上报道海洋枯草芽孢杆菌3512A分泌抗真菌脂肽。目前,相关发明专利有:枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备(ZL201010577733.3),产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物及其农药制剂应用(ZL201 3104666 2 5.2),枯草芽孢杆菌抗菌肽及其分离纯化方法、应用(ZL20 14 107060 1 3.0),一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法(ZL200710012540.1)等等。但现有对枯草芽孢杆菌脂肽类物质提取的方法均存在操作复杂,对设备要求高,适用于制备少量脂肽类物质,不适合大规模生产等问题。

【发明内容】

:
[0004]本发明的目的是提供一种从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,快速,且所得脂肽类物质为泛革素(Fengycin)同系物,对桑椹致腐真菌抑制率高。
[0005]为了达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:
[0006]从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抑制桑椹致腐真菌的脂肽类物质的方法,包括以下步骤:
[0007](I)枯草芽孢杆菌发酵液制备:将活化的枯草芽孢杆菌接种于普通马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中,28°C摇床培养3d,将培养液离心得发酵上清液;
[0008](2)枯草芽孢杆菌发酵液中脂肽类物质的分离:取上述发酵液用盐酸调节pH为2.5-3.0,4°C冷藏过夜,10000r/min离心15min。用发酵液体积I 的有机试剂萃取沉淀2-3h,1000r/min离心取上清,即得到脂肽类粗提物甲醇溶液;
[0009]所采用的盐酸摩尔浓度是6M;
[0010]所述的有机试剂为甲醇;
[0011](3)枯草芽孢杆菌发酵液中脂肽类物质的纯化:将上述脂肽类粗提物溶液浓缩至原体积的1/8,浓缩液经葡聚糖凝胶G-100分子筛层析,以甲醇为洗脱液,按流速lml/min洗脱,体积是上样量的20-30倍,收集脂肽类物质洗脱液。
[0012]经验证,所得洗脱液主要为泛革素类物质,其对菌核盘菌属(SclerotiniaSclerot1rum,GA)和链格抱属的(Alternariasp,GE)具有良好的抑菌作用。
[0013]本发明采用的原料是枯草芽孢杆菌发酵液,不受时间、地域限制;采用葡聚糖凝胶G-100分子从枯草芽孢杆菌中分离出Fengycins,安全无毒,易于降解,对桑椹致腐真菌有较强的抑制作用。
【附图说明】
[0014]图1.实施例1中第10,11,I 2管收集洗脱液对桑椹致腐真菌核盘菌属(ScIerotiniaScIerot1rum,GA,图1A,平板背面)和链格抱属(Alternariasp ,GE,图 1B,平板背面)抑菌实验结果图。
[0015]图2.纯化后脂肽类抑菌物质基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)分析图谱。
【具体实施方式】
[0016]以下将结合附图和实施例具体说明本发明的技术方案。
[0017]实施例1
[0018]枯草芽孢杆菌ME-2产抗真菌物质的分离、纯化的方法,步骤如下:
[0019]步骤1.枯草芽孢杆菌发酵液制备:将活化的枯草芽孢杆菌用接种环挑取2环于灭过菌的300ml锥形瓶中,培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),28°C,250rpm转速摇床培养3d,将培养液3500r/min离心5min得发酵上清液。
[0020]所述PDA培养基含20%马铃薯滤液(马铃薯去皮、切块,煮沸,煮到熟而不烂,8层纱布过滤)、2 %琼脂、2 %葡萄糖,自然pH下,121°C高温灭菌30min。
[0021]步骤2.枯草芽孢杆菌发酵液中脂肽类物质的提取:取2000ml上述发酵液,用6MHCl调节pH为2.5-3.0,4°C冰箱放置过夜,10000r/min离心15min。用10_20ml甲醇萃取沉淀2-3h,1000r/min离心取上清,即得到脂肽类粗提物甲醇溶液约15ml。
[0022]步骤3.枯草芽孢杆菌发酵液中脂肽类物质的纯化:将脂肽类粗提物甲醇溶液用EYELA N-1OOO型号旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/8,浓缩液经葡聚糖凝胶G-1OO分子筛层析,用甲醇溶液洗脱,洗脱流速为lml/min,收集对真菌有较好抑制作用的洗脱液(验证第10,11,12管)。
[0023]分子筛层析选用葡聚糖凝胶G-100,根据分子的大小分离样品收集液。过程如下:
(I)树脂的活化:称取适量的葡聚糖凝胶G-100,加入10-20倍的蒸馏水,在沸水浴中保持2-3h,并间歇搅拌。(2)装柱:装柱过程保证无气泡产生,凝胶均匀无间隙。上样:将脂肽类粗提物甲醇溶液旋转蒸发至2-3ml上葡聚糖凝胶柱子。洗脱:用甲醇,按流速lml/min洗脱。收集:每5min收集一管。
[0024]步骤4.分离纯化物质的特征性质分析:
[0025]紫外光谱:将分离纯化收集的样品进行紫外扫描,检测分离物质的吸收波长。
[0026]红外光谱分析:将部分样品浓缩,50 °C烘干,取Img样品与200mg的KBr混合研磨,压片,红外检测,分析分离物质中所含有的原子基团。
[0027]高效液相色谱检测:根据紫外扫描的结果,选用特征吸收波长,高效液相色谱检测分离物质的吸收峰,收集对桑椹致腐真菌抑制率较高的组分。柱子:Waters液相色谱柱SymmetryShieIdRPl8,波长= 254nm,流动相为水:甲醇=20:80,流速为0.8mL/min。
[0028]质谱分析:分析枯草芽孢杆菌中抑制桑椹致腐真菌物质的组分,确定具体单一物质。
[0029]实验例2分离物质的抑菌实验
[0030]将TOA培养基平板上培养5d的菌核盘菌属(SclerotiniaSclerot1rum,GA)和链格孢属的(Alternariasp,GE),用灭过菌的打孔器打出直径为5mm的均勾圆形菌块。在新的PDA培养基平板中间放上制备的GA、GE菌块,再在距中心2.5cm的四角放置四个灭菌的牛津杯。吸取200μ1各洗脱管中的洗脱液,加入到牛津杯中。将平板置于28°C培养4d,通过观察菌丝生长至各牛津杯的情况,判断各洗脱管的抑菌活性。结果显示,第10管对GA、GE抑制效果最佳,如图1所示。
[0031 ]实验例3纯化后抑菌脂肽类物质的组分分析与鉴定
[0032]吸取ΙΟΟμΙ第10号洗脱管中的洗脱液,浓缩至5μ1。采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)分析纯化后的抑菌物质。
[0033]说明:脂肽类抗生素根据其结构上的差异分为Surfactin、Iturin,FengycinA或B等三大家族和一些结构未知的环肽抗生素。
[0034]Surfactin是目前认为较好的生物表面活性素,有很强的抗病毒、细菌作用。Itur in家族的抗菌脂肽由七肽与8—氨基脂肪酸链通过酰胺键相连而成,主要分为Itur inA、B、C、D,Iturin对酵母菌和真菌有很强的抑制作用,而对细菌的抑菌活性是微弱的。Fengycin家族由β-羟基脂肪酸链(C14 一 C18)和10个氨基酸残基的小肽组成的双亲分子,对丝状真菌有很好的抑制作用,而对酵母和细菌无效。由图2可以看出该分离纯化物质主要为分子量在1435.5359道尔顿,1449.5511道尔顿,1463.5605道尔顿,1477.5714道尔顿等相差一个亚基的Fengycin A同系物,以及分子量为1491.5809道尔顿,1505.5884道尔顿,1519.5939道尔顿的Fengycin B同系物。说明该抑菌物质主要为有抑制真菌作用的泛革素类物质。
【主权项】
1.从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)枯草芽孢杆菌发酵液制备:将活化的枯草芽孢杆菌接种于普通马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,28 °C摇床培养72h,将培养液离心取上清液,得到枯草芽孢杆菌发酵液; (2)枯草芽孢杆菌发酵液中脂肽类物质的分离:调节枯草芽孢杆菌发酵液的pH为2.5-3.0,4°C冷藏过夜,离心,用发酵液体积I 的有机试剂萃取沉淀2-3h,离心,取上清,即得到脂肽类粗提物甲醇溶液; (3)枯草芽孢杆菌发酵液中脂肽类物质的纯化:将上述脂肽类粗提物溶液浓缩至原体积的I /8,浓缩液经葡聚糖凝胶G-1OO分子筛层析,收集洗脱液,即得。2.根据权利要求1所述的从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,其特征在于,步骤(2)调节pH值所采用的是摩尔浓度为6M的盐酸。3.根据权利要求1所述的从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,其特征在于,步骤(2)所采用的有机试剂为甲醇。4.根据权利要求1所述的从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,其特征在于所述的抗真菌物质主要为泛革素类物质,对菌核盘菌属和链格孢属的具有抑菌作用。5.根据权利要求1所述的从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,其特征在于步骤(3)中,葡聚糖凝胶G-100分子筛层析采用甲醇为洗脱液,洗脱流速lml/min,体积是上样量的20-30倍。6.从枯草芽孢杆菌中分离、纯化抗真菌物质的方法,其特征在于,所述的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌ME-2(GenBank JQ900623)。
【文档编号】C12P21/00GK105861602SQ201610221915
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】桂仲争, 陈成, 贾俊强
【申请人】江苏科技大学
再多了解一些
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