以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法
【专利摘要】本发明涉及以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其为将含高拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107种子液接入7L发酵罐中，以3L培养基量为发酵体系，经初始甘油消耗期、分批甘油补料期及甲醇补加诱导期，共计发酵96h。本发明利用7升发酵罐对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂在无机培养基中进行高密度发酵培养表达进行初步探索，该研究成果将有力促进重组果胶甲酯酶抑制剂大规模工业化生产，从而促进该抑制剂在果蔬汁工业中的应用。CGMCC No.1197620160107
【专利说明】
从无机培养基高效表达獅猴桃果胶甲醋酶抑制剂的方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及W无机培养基高效表达雜猴桃果胶甲醋酶抑 制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 果蔬汁主要由浆液和浑浊态物质组成。浑浊态在果蔬汁的颜色、风味和质地等感 官品质方面发挥重要的作用。然而，果蔬汁在加工及储存过程中经常会发生浑浊态消失的 现象，运主要是由于果蔬汁内源果胶甲醋酶对果胶的脱甲醋化作用而产生的。为了避免果 蔬汁的浑浊态消失现象，则需抑制果胶甲醋酶的活性。工业上生产果蔬汁通常采用热加工 处理的方式纯化果胶甲醋酶的活性，但此方法极易影响果蔬汁的感官品质及营养成分。果 胶甲醋酶抑制剂(PEMI)可W有效抑制植物内源果胶甲醋酶的活性，为果蔬汁在加工中由于 脱甲醋化作用而产生浑浊态消失的现象提供了一个非常具有应用前景的解决方法。然而从 植物体内直接提取果胶甲醋酶抑制剂十分困难，并且提取量极低，目前只可W从雜猴桃果 实中获取果胶甲醋酶抑制剂。
[0003] 本实验室在上述研究背景下，利用己斯德毕赤酵母表达系统已高效表达出对果胶 甲醋酶有抑制活性的重组雜猴桃果胶甲醋酶抑制剂，但是只限于在摇瓶水平的小规模表 达，远远不能满足果蔬汁工业生产的需求。为了解决上述存在的问题，本发明利用7升发酵 罐对重组雜猴桃果胶甲醋酶抑制剂在无机培养基中进行高密度发酵培养表达进行初步探 索，该研究成果将有力促进重组果胶甲醋酶抑制剂大规模工业化生产，从而促进该抑制剂 在果蔬汁工业中的应用。
【发明内容】
[0004] 介于现有技术雜猴桃果胶甲醋酶抑制剂的表达只限于在摇瓶水平，远远不能满 足果蔬汁工业生产的需求，本发明的目的是提供W无机培养基高效表达雜猴桃果胶甲醋酶 抑制剂的方法。
[0005] 本发明提供W无机培养基高效表达雜猴桃果胶甲醋酶抑制剂的方法，其为将含高 拷贝重组质粒的己斯德毕赤酵母菌株GS115160107种子液接入化发酵罐中，W化培养基量 为发酵体系，经初始甘油消耗期、分批甘油补料期及甲醇补加诱导期，共计发酵96h。
[0006] 其中，所述己斯德毕赤酵母菌株GS115160107的保藏号为CGMCC 11976,分类名称 为己斯德毕赤酵母(PicMa pastoris)，保存单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中屯、，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年1月7日。该菌株的 基因型为arg4his4aoxl :ARG4,表型:Muts，His-，Arg+。
[0007] 其中，所述种子液为高拷贝重组质粒的己斯德毕赤酵母菌株GS115160107发酵至 ODsoo = 2-6所得，其具体制备方法为：将高拷贝重组质粒的己斯德毕赤酵母菌株 GS115160107接种到BMGY培养基上，28°C，摇床转速为220rpm发酵至0〇6日日=2-6,得到种子 液。
[0008] 其中，种子液的接种量为按照体积百分含量5-10%接入初始培养基（W接种完为 100%)。
[0009] 其中，所述发酵所用的初始培养基优选为BSM培养基。
[0010] 其中，发酵期间用质量百分含量85%的憐酸及氨水控制pH值为6.0。
[00川其中，发酵期间控审赂氧(DO化20% W上。
[0012] 其中，发酵期间培养基中的甘油耗尽，溶氧反弹后补加50% (甘油与水的体积比为 1:1)的含有微量元素为12ml/L的甘油。
[0013] 其中，发酵期间菌体量达到200g/L时，停止补加甘油，待甘油耗尽，补加含有微量 元素为12ml/L的甲醇诱导表达。
[0014] 其中，所述补加甲醇，开始流加速度为Iml/h/L，24h内逐渐增加到5ml A/L。
[0015] 本发明还提供所述W无机培养基高效表达雜猴桃果胶甲醋酶抑制剂的方法在果 蔬汁工业中的应用。
[0016] 本发明利用7升发酵罐对重组雜猴桃果胶甲醋酶抑制剂在无机培养基中进行高密 度发酵培养表达进行初步探索，该研究成果将有力促进重组果胶甲醋酶抑制剂大规模工业 化生产，从而促进该抑制剂在果蔬汁工业中的应用。
【附图说明】
[0017]图巧实施例1中BSA蛋白浓度标准曲线图。
[0018] 图2为实施例1中不同表达时间发酵上清液的电泳照片。其中，泳道1-9:诱导0、12、 24、36、48、60、72、84、9化时的发酵上清;1:彩色预染蛋白质分子量标准，从上到下分子量依 次为 170、130、95、72、55、43、34、26、17、10kDa。
【具体实施方式】
[0019] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020] 实施例1 [00別]1.材料
[0022] (1)菌株:重组己斯德毕赤酵母菌株GS115160107由本实验室构建，于甘油中-80°C 保存。所述己斯德毕赤酵母菌株GS115160107的保藏号为CGMCC 11976,保存单位为中国微 生物菌种保藏委员会普通微生物中屯、，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期 为2016年1月7日。该菌株的基因型为arg4his4aoxl: ARG4，表型:MutS ,His-，Arg+。
[0023] (2)化学试剂:蛋白质Marker购于天根生化科技(北京)有限公司；生物素、BSA标准 蛋白及考马斯亮蓝G250购自北京杨华志城科技有限公司；丙締酷胺、甲叉双丙締酷胺、无氨 基酵母氮源(YNB)为Amresco公司产品，购自北京经科宏达生物技术有限公司；其他试剂均 为国产分析纯。
[0024] 2.方法
[0025] (1)重组己斯德毕赤酵母菌株在化发酵罐中的诱导表达方法
[0026] A. WBMGY为培养基，28°C，摇床转速为22化pm，培养发酵种子液至ODsoo = 2-6。
[0027] B.在化发酵罐中加入化BSM培养基，pH电极校准后，进行罐体在位121°C灭菌，灭 菌结束待溫度降至30°C后，按照每升BSM培养基加4.35ml/h的标准加入过滤除菌的微量元 素(PTMl)，用质量百分含量25%的氨水调节pH至6.0,然后校准溶氧电极，最后按体积百分 含量5-10%的接种量将种子液接种至发酵罐内（W接种完为100% )，开始发酵，随着菌体的 生长，溶氧量(DO)将从100%逐渐下降，通过级联揽拌速度和通气量使DO维持在20% W上， 直到甘油耗尽，此为初始甘油消耗期。
[0028] C.初始甘油消耗期后进入分批甘油补料期，每次甘油耗尽，溶氧反弹后，补加50% 的(甘油W水按体积比1:1稀释)含有微量元素为12ml/L的甘油，甘油补加累、通气量与揽拌 级联，控制溶氧(DO)在20 % W上，溫度30°C，用氨水控制pH在6.0左右。
[0029] D.菌体量达到200g/L后，停止补加甘油，待甘油完全耗尽后，开始补加100% (纯甲 醇不W水稀释)含有微量元素为12ml/L的甲醇进行诱导表达，此为甲醇补加诱导期。待整体 发酵时间达到96小时时结束发酵。
[0030] E.发酵结束后，发酵菌液在12000rpm离屯、15min，得上清，进行IYicine-SDS-PAGE 检测。
[0031] (2)表达上清的Tricine-SDS-PAGE检测方法
[0032] A.制胶:分别制备体积百分比10%的分离胶和体积百分比4%的浓缩胶。
[0033] B.在1.5mL微离屯、管中，将60化上清液和60化2 X SDS样品缓冲液充分混合，在沸 水浴中煮7-9min。
[0034] C.用10化枪小屯、上样，尽量使样品在孔的底部成一薄层。样品上样量为30化，低分 子量蛋白质Marker上样量为如L。空置的加样孔，需加等体积的空白IX SDS样品缓冲液，W 防相邻泳道样品的扩散。
[0035] D. W80V恒压进行电泳，当样品进入浓缩胶后将电压升至120V。
[0036] E.待漠酪兰跑至胶的底部，取出凝胶，放在合适大小的容器中，用染色液覆盖凝 胶，缓慢摇动0.5-化。
[0037] F.将凝胶从染色液中取出，用自来水小屯、冲掉凝胶表面上的染色液，然后放入脱 色液中，W脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动过夜，其间更换脱色液3-4次，直至获得清晰的蓝色条 带及干净背景。
[0038] (3)发酵上清液中蛋白浓度的测定方法
[0039] A.标准曲线绘制
[0040] 取10支1.5ml离屯、管，按照表1加入各试剂：
[0041] 表1蛋白质浓度标准曲线的制备 「mw
[0043] 将上述各溶液混合均匀后，向各管中分别加入98化1考马斯亮蓝G250溶液，摇匀， 室溫反应2min，测定595nm处的吸光值，WBSA浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲 线。
[0044] B.样品中蛋白含量的测定
[0045] 另取一干净的离屯、管，加入样品溶液和980ul考马斯亮蓝G250溶液，摇匀，室 溫反应2min，测定595nm处的吸光值，由标准曲线即可得样品溶液中的蛋白含量。
[0046] 3.结果
[0047] (I)BSA蛋白浓度标准曲线如图1所示。
[0048] (2)不同表达时间发酵上清液的电泳结果如图2所示。由电泳图及结合所测的发酵 上清液总蛋白浓度可知，甲醇诱导表达60h时总蛋白浓度达到最高值900mg/L，随后蛋白浓 度开始下降，甲醇诱导表达4甜W后目的蛋白含量没有显著增加，应用Bandscan软件分析发 现，4化目的蛋白占总蛋白的比例约为7.7%，由此可计算出发酵罐高密度培养4她后重组果 胶甲醋酶抑制剂产量约为59.7mg/L。
【主权项】
1. 以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特征在于，其为将含高 拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107种子液接入7L发酵罐中，以3L培养基量 为发酵体系，经初始甘油消耗期、分批甘油补料期及甲醇补加诱导期，共计发酵96h;巴斯德 毕赤酵母菌株GS115160107的保藏号为CGMCC 11976。2. 如权利要求1所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，所述种子液为高拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107发酵至0D600 = 2-6所得。3. 如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，所述种子液的制备方法为:将高拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107 接种到BMGY培养基上，28 °C，摇床转速为220rpm发酵至0D600 = 2-6，得到种子液。4. 如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，种子液的接种量为按照体积百分含量5-10 %接入初始培养基。5. 如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，发酵期间用质量百分含量85 %的磷酸及氨水控制pH值为6.0。6. 如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，发酵期间控制溶氧在20 %以上。7. 如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，发酵期间培养基中的甘油耗尽，溶氧反弹后补加50%的含有微量元素为12ml/L的 甘油。8. 如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，发酵期间菌体量达到200g/L时，停止补加甘油，待甘油耗尽时补加100 %含有微量 元素为12ml/L的甲醇诱导表达。9. 如权利要求8所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法，其特 征在于，补加甲醇，开始流加速度为lml/h/L，最后增加到5ml/h/L。10. 权利要求1-9任一项所述以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法 在果蔬汁工业中的应用。
【文档编号】C12R1/84GK105861603SQ201610140721
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月11日
【发明人】梅晓宏, 柳倩, 韩诗雯, 陈西
【申请人】中国农业大学