一种成株期小麦纹枯病的鉴定评价方法
【专利摘要】本发明公开了一种成株期小麦纹枯病的鉴定评价方法，是在小麦拔节期将布满小麦纹枯病菌丝的牙签嵌入到基部第1～2叶鞘之间，弥雾器喷水保湿7d，在乳熟期调查统计纹枯病发病程度；计算病情指数，根据鉴定材料与对照品种的病情指数进行比较对鉴定材料进行抗纹枯病性评价。
【专利说明】-种成株期小麦纹枯病的鉴定评价方法 -、技术领域
[0001] 本发明设及农作物病害抗性鉴定方法，具体说是一种成株期小麦纹枯病抗性鉴定 方法，属于植物保护领域。 二、【背景技术】
[0002] 小麦纹枯病，又称小麦尖眼点病（wheat sharp eyespot)，是由丝核菌中 I^iizactonia cereal is或I^iizactonia SOIani所引起的一种±传真菌病害（陈延熙，1986; 夏正俊，1989 )，几乎遍及世界各小麦种植区。中国是小麦纹枯病发生和危害较为严重的国 家（陈炳章，1975)。近年来，由于耕作制度和气候的变化，加上感病品种大面积使用和纹枯 病菌累积，危害面积迅速扩大，1992年发病面积达3.6 X 106hm2，约占全国麦播面积的1/8， 2005年发病面积约为8.051 X 106hm2,占全国小麦种植面积的1/3W上(2005年中国农业年 鉴）。小麦纹枯病已成为当前影响我国小麦高产、稳产的主要病害之一。
[0003] 筛选纹枯病抗源，选育和使用抗纹枯病小麦新品种无疑是解决运一问题最有效、 最经济的途径。而简便有效的小麦纹枯病抗性鉴定技术体系的建立是开展上述研究的前提 与关键。研究表明，在小麦生育进程中纹枯病主要有两个发病时期，即苗期和拔节孕穗期， 其中W拔节孕穗期的纹枯病危害对小麦的产量影响最大。目前已有不同的学者申请获得了 有关小麦苗期纹枯病抗性鉴定评价方法的专利，但尚无小麦成株期纹枯病鉴定评价标准方 法的报道。小麦苗期鉴定通常在=叶期进行人工接种，根据幼苗长势在接种20d-30d后进行 病情调查的一种鉴定评价方法。该法虽然可W有效地对苗期小麦纹枯病抗性进行鉴定评 价，但由于小麦苗期与成株期的纹枯病抗性机制不同，其苗期抗性无法真实地反应小麦纹 枯病成株期的抗性，同时由于病情调查时期迴异，其相应的病害分级标准也显著不同。因 此，开展小麦成株期纹枯病抗性鉴定方法研究对推动当前小麦纹枯病研究意义重大。
[0004] 小麦纹枯病成株期抗性鉴定是一种在拔节期进行人工接种、在乳熟期调查统计纹 枯病发病情况的鉴定方法。目前小麦成株期纹枯病抗性鉴定的方法主要有:沟带接种法、± 表接种法、牙签嵌入法=种方法。其中，沟带接种法:首先制作带菌麦粒，选饱满无病麦粒， 浸泡吸涨后置于双层塑料袋中，灭菌后接种菌丝培养15~20d(25°C)，期间定期翻动麦粒， 待菌丝体均匀长满麦粒，备用。接种时期在小麦播种时，将种子和带菌麦粒一起均匀施于播 种沟内，接种量约为50g/m带菌麦粒;±表接种法:带菌麦粒的制作同沟带接种法，接种时期 选择在小麦返青期，首先将上表喷湿，然后将带菌麦粒均匀撒施于麦苗基部，接种量约为 50g/m带菌麦粒，接种后结合松±将麦粒混入浅表±层，根据墙情采取保湿措施，W确保表 ±湿润5dW上；牙签嵌入接种法:选市售的木质牙签折成两半约1.5cm长。水泡12h后煮沸 30min，排在烧杯里，加入适量PDA液体培养基(淹没牙签1/2)，灭菌后接种培养20d (25 °C )， 待菌丝密集地布满牙签时，用于田间接种。接种时期掌握在小麦拔节期，基部节间定长时， 接种中间10株，每株接种3个茎杆，选择贴近地面叶銷，用綴子将短牙签轻轻嵌入叶銷与茎 杆之间，并在相应茎杆挂好标牌，接种后喷雾保湿5d。
[0005] 沟带接种法由于接种时间是在播种时期，环境溫度较低，不利于纹枯病菌的生长， 且±壤中其他微生物会对纹枯病菌产生括抗作用，因此利用该法接种发病率较低;±表接 种法是另一种间接接种法，因此存在病原物播撒不均匀、始病时间不统一、始病时间较长等 缺点，由于接种点较为随机，调查茎杆只能随机选择，无法确定是由于人工接种导致的发病 还是田间自然发病。因此，通过间接种法鉴定小麦纹枯病抗性受环境影响较大，稳定性较 差。在运=种方法当中，牙签嵌入接种法是一种直接将病原菌与接种材料直接接触的鉴定 方法，该法克服了上述两种间接接种方法的缺点，在拔节期接种，乳熟期调查接种茎杆的发 病等级，从而计算病情指数，根据病情指数来评价鉴定材料的纹枯病抗性差异，但是，由于 小麦纹枯病是一种±传真菌病害，其发生、扩展容易受周围的环境的影响，W致于因年份、 地点的变化而造成鉴定结果差异较大的现象时有发生。因此，鉴于目前小麦纹枯病牙签嵌 入接种法所存在的一些技术缺陷，本方法进一步规范了小麦成株期纹枯病抗性鉴定的评价 技术体系，W实现对成株期小麦纹枯病抗性的准确鉴定与评价，满足当前小麦纹枯病研究 的迫切需要。 H、【附图说明】
[0006] 图1为未发病牙签饭盒照片和长满菌丝的牙签饭盒照片；
[0007] 图2为田间牙签接种示意图。 四、
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于:提供一种利用牙签在拔节期接种，乳熟期调查病情指数，并设 立对照品种，通过鉴定材料与对照品种的病害指数进行比较来评价小麦成株期纹枯病抗性 鉴定方法。牙签嵌入接种法克服了利用病麦粒进行接种，对病麦粒接种数量无法控制，始病 时间不统一，无法将接种茎杆与调查茎杆一一对应等缺点，同时设立抗性对照品种，克服了 由于年份、环境变化而造成抗性评价差异较大的弊病。
[0009] 其中，抗性对照品种Niavtl4、宁麦9号和扬麦158均选自本实验室经过多年成株期 鉴定表现为抗、中抗和感病的代表性品种，并已为大家接受并广泛应用于小麦纹枯病抗性 研究中。
[0010] 本发明的技术方案是通过在小麦拔节后，将制备好的带菌牙签嵌入小麦基部叶銷 内，乳熟期记载接种茎杆的发病等级，计算小麦纹枯病病情指数，并通过与对照抗性品种的 病情指数的比较来评价参试材料的纹枯病抗性。
[0011] 本发明的具体步骤、流程和基本特征是：
[0012] (1)将代表性强致病力小麦纹枯病菌(化izactonia cerealis)菌种置于PDA固体 培养基上活化培养，获得菌丝。
[001引（2)将木质牙签浸泡24小时，由于市售牙签为了防腐，均经过了甲醒的浸泡，将牙 签浸泡消除了甲醒对纹枯病培养的影响，对折，牙签尖头朝上直立整齐放入不诱钢饭盒中， 配制PDA培养基，将牙签与培养基常规高压蒸汽灭菌后，在超净工作台上将灭菌后未冷却的 PDA培养基倒入饭盒，使其将牙签1/2浸没。倒入饭盒的PDA培养基数量要适宜，过多，则留下 可W长满菌丝的部位少，不能获得足够的接种菌量，倒入的培养基过少，则接种时活化的菌 株不易接触到培养基，不利于菌丝的生长，使倒入的培养基浸没牙签的1/2处既方便接种操 作又利于菌丝的生长。将牙签尖头朝上排布与饭盒内，纹枯病菌丝会在尖头部位生长，由于 接种时是将带菌端嵌入叶銷和茎杆中间，尖头较平头更有利于嵌入狭小的空间。待浸没牙 签的PDA培养基冷却后，将事先在培养皿中培养好的小麦纹枯病菌菌株无菌操作移入含牙 签的PDA固体培养基中，每个饭盒移入大小为IcmX Icm的布满菌丝的培养基块5块，5块带菌 培养基在含牙签的PDA固体培养基中均匀分布，接种后用封口膜封住饭盒，再放入25°C恒溫 箱中培养Hd~21d，培养过程中每隔7d在超净工作台上查看菌丝生长情况，待菌丝长满牙 签后形成有菌牙签备用。每个饭盒移入5块布满菌丝的培养基，将培养基成梅花状接种到饭 盒内PDA培养基上，是一种较为均匀的接种方式，可W保证饭盒内的牙签可W均匀的布满菌 丝;接种后用封口膜将饭盒盖和盒体接触处封住和查看过程中在超净工作台上操作均是为 了防止杂菌的侵入;培养过程中每隔7d查看生长情况，是为了避免接种失败便于及时重新 接种，保证接种成功率。
[0014] (3)在小麦拔节期，用消毒綴子夹取有菌牙签，将牙签携带菌丝的尖头一端轻轻地 嵌入麦苗基部第1~2叶銷之间，在该位置接种可W利用叶銷内部及±表的湿润环境，便于 接种菌丝的生长与初始侵染，每个叶銷嵌入一个有菌牙签，每份材料接种30个茎杆，接种后 立即对接种材料进行弥雾保湿，W保证牙签接种后所需的湿度，每天喷水一次，连续喷水 7d，满足纹枯病菌菌丝从接种到初始侵入对环境湿度的需求，然后对接种材料进行正常的 田间管理。
[0015] (4)乳熟期调查嵌有接菌牙签茎杆的纹枯病病害等级。病情分级标准如下：
[OOW 0级:全株无病；
[0017] 1级:叶銷有典型的纹枯病病斑，但不侵茎；
[0018] 2级:病菌侵入茎杆，但病斑宽度不超过茎杆周长的1/4;
[0019] 3级:病菌侵入茎杆，病斑宽度占茎杆周长的1/4~1/2;
[0020] 4级:病菌侵入茎杆，病斑宽度占茎杆周长的1/2~3/4;
[0021] 5级：病菌侵入茎杆，病斑宽度超过茎杆周长的3/4,或茎杆已软腐、出现枯孕穗或 枯白穗。
[0022] 化H+當对照品釉巧倍巧价材魁的纺姑痛痛信拾擲
[0023]
[0024] 式中XI、拉、X3、X4、枯分别表示纹枯病1级、2级、3级、4级、5级茎杆数；
[0025] (6)根据病情指数对参试材料的成株期纹枯病抗性进行评价：
[00%]抗性分级标准：
[0027]抗病(R): DKDIck-R;
[002引 中抗(MR) :DIck-r < DKDIck-MR;
[0029] 中感(MS):DIcmr<DKDIck-s;
[0030] 感病（S) :DI> DIck-So
[0031] 将待鉴定的小麦品种或品系的种子按照（3)步骤~（5)步骤在同一环境下至少再 进行一次重复鉴定，计算平均值，通过与对照品种的平均病情指数进行比较，来评价待鉴定 材料的纹枯病抗性差异。
[0032] 本发明的优点在于:该方法不仅可W保持接菌量的相对一致，还可W提供纹枯病 菌丝的初始侵入、定植所需的湿度，同时也便于乳熟期病情调查时做到接种茎杆与调查茎 杆一一对应。另外，=个已知抗纹枯病性显著不同对照品种的引入，可W有效避免年份、环 境等因素对抗性评价带来的不利影响。 五、【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] 纹枯病病原菌：将代表性强致病力小麦纹枯病菌（RMzactonia cerealis)菌株 R030U该菌株引自江苏省农业科学院植物保护研究所，具有较强的致病力，是目前南京地 区的优势菌株)在PDA固体培养基上活化培养，7天后待用。
[0035] 带菌牙签制备：将牙签浸泡24小时，对折，牙签尖头朝上直立整齐放入盒体中，配 审化DA培养基，将牙签与培养基常规高压蒸汽灭菌，在超净工作台上将灭过菌尚未冷却的 PDA培养基溶液倒入饭盒，使其将牙签1/2浸没，待浸没牙签的PDA培养基冷却后，将事先在 培养皿中培养好的小麦纹枯病菌菌株R0301无菌操作移入含牙签的PDA固体培养基中，每个 饭盒移入大小为IcmX Icm的布满菌丝的培养基块5块，5块带菌培养基在含牙签的PDA固体 培养基中均匀分布，接种后用封口膜封住饭盒，再放入25°C恒溫箱中培养14d~21d，培养过 程中每隔7d在超净工作台上查看菌丝生长情况，待菌丝长满牙签后形成有菌牙签备用。
[0036] 实施例2
[0037] 田间弥雾保湿的条件下，利用本发明方法对包含抗性对照品种W及纹枯病抗性不 同的26个小麦品种(品系)进行了 3年成株期小麦纹枯病抗性鉴定。
[0038] 带菌牙签:通过实施例1获得。
[0039] 将上述参试材料的种子于南京正季播种，行长1米，行距25cm，每行播种30粒种子， 重复2次，正常栽培管理。
[0040] 在拔节期(次年3月上旬），用消毒綴子夹取有菌牙签，将携带菌丝一端轻轻地嵌入 麦苗基部第1~2叶銷之间（未携带菌丝的牙签丢弃不用），每个叶銷嵌入一个有菌牙签，每 行接种30个茎杆。接种后，立即采取弥雾喷洒措施对接种材料基部进行保湿，每天喷水一 次，连续喷水7d，然后对接种材料进行正常的田间管理。
[0041] 在乳熟期(约接种后60d)，对上述试验材料进行纹枯病病情调查，并依据本发明所 述的抗性分级标准计算病情指数。
[0042] 结果表明：S个抗性对照品种(扬麦158、宁麦9号和Niavtl4)的平均病情指数在不 同的年份有所变化，但总体趋势一致(表1)，运与小麦纹枯病在生产上的实际发生情况相符 厶 1=1 O
[0043] 表1参试材料不同年份的纹枯病抗性鉴定与评价
[0044]
[0045]
[0046] 巧2011、2012和2014平的成巧期纹巧病巧巧鉴足中，参巧巧料的病情指数变化范 围较大，分别介于21.05%~75.88%、25.63%~69%和29.9%~63.33%之间，表明本发明 所述的方法能够提供纹枯病发病所需的适宜条件，保证感病品种的充分发病。进一步对其 年份间的病情指数进行相关性分析，发现其年份间的相关程度很高，它们的相关系数介于 0.74~0.87之间(表2)，表明该方法的鉴定结果在不同年份间具有较好的一致性与重复性。
[0047] 表2 26份参试材料年份间纹枯病病情指数的相关性
Luu-r'」 气 ?把口口/十、处叩]巧| 乂口JXIU 工刀結^小1忙 tA/X]八I 工八J ；V^、口PMT口J I 旧]日莫义？ 对26份参试材料分别进行了成株期纹枯病的抗性评价，结果列于表1。
[0050]由表1可见，参试材料的抗性评价在不同年份间具有较好的一致性。如CI12633在 2011年抗性评价为中抗，在另外两个年份均评价为抗，而ARz在=年的抗性评价中均为中 抗;徐州25在S年的抗性评价均为中感，而SN931则在2014年评价为中感，另外两年均评价 为感病。运与它们在已有报道的抗性程度相吻合。综上所述，本发明所述的方法可W有效地 应用在小麦成株期纹枯病抗性鉴定研究中，且具备重复性好、可靠度高等优点，值得进一步 推广应用。
【主权项】
1. 一种成株期小麦纹枯病的鉴定评价方法，其步骤为： (1) 将代表性强致病力小麦纹枯病菌(1^1丨23〇1：011丨3〇6代31丨8)菌种在超净工作台上于 PDA固体培养基上活化培养，获得菌丝； (2) 将木质牙签浸泡24小时，对折，牙签尖头朝上直立整齐放入不锈钢饭盒中，配制TOA 培养基，将牙签与培养基常规高压蒸气灭菌后，在超净工作台上将灭菌后未冷却的PDA培养 基倒入饭盒，使其将牙签1/2浸没，待浸没牙签的PDA培养基冷却后，将事先在培养皿中培养 好的小麦纹枯病菌菌株无菌操作移入含牙签的PDA固体培养基中，每个饭盒移入大小为lcm X lcm的布满菌丝的培养基块5块，5块带菌培养基在含牙签的TOA固体培养基中均匀分布， 接种后用封口膜封住饭盒，再放入25°C恒温箱中培养14d~21d，培养过程中每隔7d在超净 工作台上查看菌丝生长情况，待菌丝长满牙签后形成有菌牙签备用； (3) 同时种植待鉴定材料和对照品种，对照品种选用扬麦158为感病对照(Sd〇,宁麦9号 为中抗对照(MRd〇，Niavtl4为抗病对照(Rd〇，在小麦拔节期，用消毒镊子夹取有菌牙签，将 牙签携带菌丝的尖头一端轻轻地嵌入麦苗基部第1~2叶鞘之间，每个叶鞘嵌入一个有菌牙 签，每份待鉴定材料接种30个茎杆，接种后，通过弥雾喷洒接种材料基部进行保湿，每天喷 水一次，连续喷水7d，然后对幼苗进行正常生长管理； (4) 在接种材料乳熟期，调查嵌有接菌牙签茎杆的纹枯病病害等级，纹枯病田间病情分 级标准如下： 0级:全株无病； 1级:叶鞘有典型的纹枯病病斑，但不侵茎； 2级:病菌侵入茎杆，但病斑宽度不超过茎杆周长的1/4; 3级:病菌侵入茎杆，病斑宽度占茎杆周长的1/4~1/2; 4级:病菌侵入茎杆，病斑宽度占茎杆周长的1/2~3/4; 5级：病菌侵入茎杆，病斑宽度超过茎杆周长的3/4，或茎杆已软腐、出现枯孕穗或枯白 穗； (5) 计算对照品种和待评价材料的纹枯病病情指数，式中Χι、X2、x3、X4、X5分别表示纹枯病1级、2级、3级、4级、5级茎杆数； (6) 根据病情指数对参试材料的成株期纹枯病抗性进行评价， 抗性分级标准： 抗病(R) :DI〈DIck-r; 中抗(MR) :DIck-r < DKDIck-mr; 中感(MS) :DIck-mr < DKDIck-s; 感病（S) :DI 2 DIck-s。2. 根据权利要求1所述的小麦纹枯病成株期抗性鉴定评价的方法，其特征在于，将待鉴 定的小麦品种或品系的种子按照（3)步骤~（5)步骤在同一环境下至少再进行一次重复鉴 定，计算平均值，通过与对照品种的平均病情指数进行比较，来评价待鉴定材料的纹枯病抗 性差异。
【文档编号】C12Q1/18GK105861618SQ201610211553
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】张巧凤, 吴纪中, 蔡士宾, 付必胜, 吴小有
【申请人】江苏省农业科学院