一种离体茎测定烟草疫霉致病力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，包括以下步骤：（1）烟草疫霉菌丝块制备；（2）离体茎制备；（3）接种；（4）致病力测定与评价。本发明方法简便易行，病原菌致病性表现稳定，重复性好，结果可靠，可准确地反映烟草疫霉的致病力及其致病强度；在实际操作中，可批量进行，具有占用空间小、节约劳动成本、缩短实验周期的优点。因此，本发明方法适合推广应用。
【专利说明】
-种离体茎测定烟草疫霉致病力的方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物保护技术领域，具体设及一种离体茎测定烟草疫霉致病力的方 法。
【背景技术】
[0002] 烟草疫霉(Phyto地thora nicotianae)是导致烟草黑腔病的一种致病性卵菌，对 烟草生产危害严重，是影响烟草产量和品质的主要病原菌之一。目前，关于烟草疫霉致病力 的测定主要存在如下=种方法:（1)创伤和非创伤烟苗茎基部贴接菌丝块法测定致病力(王 革，郑小波，陆家云等.云南省烟草黑腔病菌致病力分化的研究，南京农业大学学报.1997， 20(4): 30-35.); (2)菌谷/游动抱子接种烟苗测定致病力(YC/T 41-1996烟草品种抗病性 鉴定;梁元存，刘延荣，王玉军等.烟草黑腔病菌致病性分化和烟草品种的抗病性差异，植 物保护学报.2003, 30(2): 143-147.); (3)菌丝块创伤贴接活体或离体叶片测定致病力 (马国胜.烟草黑腔病菌生理生态及对甲霜灵抗性监测与遗传研究.安徽.安徽农业大学 硕±论文.2002)。由于菌丝块接种叶片发病快，比较适合测定病菌的致病力，而不能区分 病菌的致病强度，不适合于同时测定病菌的致病力及其致病强度。另外两种方法均利用盆 栽的活体烟苗测定，由于培育烟苗时间长、占用空间大，导致费工、费时、成本高，不利于大 规模实验，并且烟苗在溫室中生长，溫湿度控制范围相对较宽，环境因素造成发病轻重上的 一些波动，实验稳定性、重复性有待提高。因此，开发一种能缩短时间、节省空间的测定病菌 致病力及其致病强度的方法意义重大。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种离体茎测定烟草疫霉致病力的方法。
[0004] 本发明的目的是运样实现的，包括烟草疫霉菌丝块制备、离体茎制备、接种、致病 力测定与评价步骤，具体包括： A、 烟草疫霉菌丝块制备:将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28 °C下黑暗培养7~10 天，将平板菌丝切成菌丝块； B、 离体茎制备:选取培育60~70天的烟苗或培育10~15天新长出的蔽芽，提前2~3天剪掉 烟苗或蔽芽的叶片和叶柄，W让伤口自我修复，剪取烟草同一茎位的茎段，切口处用灭菌脱 脂棉包裹，均匀置于灭菌的培养床上； C、 接种:于茎段中部表皮处进行刺孔，将A步骤获得的菌丝块菌丝面紧贴于离体茎刺孔 中部位置； D、 致病力测定与评价:将接种后的离体茎于湿度80~85%、溫度25~28°C条件下黑暗培 养，每天观察发病情况，W病斑长度区分致病力及其致病强度。
[0005] 本发明方法简便易行，病原菌致病性表现稳定，重复性好，结果可靠，可准确地反 映烟草疫霉的致病力及其致病强度;在实际操作中，可批量进行，具有占用空间小、节约劳 动成本、缩短实验周期的优点。
【具体实施方式】
[0006] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不W任何方式对本发明加 W限制， 基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0007] 本发明所述的离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，包括烟草疫霉菌丝块制备、离 体茎制备、接种、致病力测定与评价步骤，具体包括： A、 烟草疫霉菌丝块制备:将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28 °C下黑暗培养7~10 天，将平板菌丝切成菌丝块； B、 离体茎制备:选取培育60~70天的烟苗或培育10~15天新长出的蔽芽，提前2~3天剪掉 烟苗或蔽芽的叶片和叶柄，W让伤口自我修复，剪取烟草同一茎位的茎段，切口处用灭菌脱 脂棉包裹，均匀置于灭菌的培养床上； C、 接种:于茎段中部表皮处进行刺孔，将A步骤获得的菌丝块菌丝面紧贴于离体茎刺孔 中部位置； D、 致病力测定与评价:将接种后的离体茎于湿度80~85%、溫度25~28°C条件下黑暗培 养，每天观察发病情况，W病斑长度区分致病力及其致病强度。
[000引 A步骤中所述的菌丝块的直径或边长为5~8mm。
[0009] B步骤中所述的茎段的大小为长34~5cm，茎围^2cm。
[0010] B步骤中所述的培养床为培养皿上垫上海绵和滤纸得到。
[0011] C步骤中所述的刺孔为3-5号昆虫针l-2mm间隔排列成2-4mmX2-4mm的见方，所刺 深度1-2mm。
[0012] C步骤还包括加的灭菌水至培养床底部W渗透、湿润脱脂棉。
[0013] 本发明所述的离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，具体操作如下： A、 烟草疫霉菌丝块制备:将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28 °C下黑暗培养7~10 天至菌丝长满整个平板，将平板菌丝切成直径或边长5-8mm的菌丝块； B、 离体茎制备:选取培育60-70天的烟苗或10-15天新长出的蔽芽，提前2-3天剪掉烟苗 或蔽芽的叶片和叶柄，让伤口自我修复。取烟草同一茎位的茎段，剪取长度4-5 cm、茎围1-2 cm的茎段，切口处灭菌脱脂棉包裹，均匀置于培养床(培养皿上垫海绵和滤纸)上，培养床底 部加入适量的灭菌水，灭菌水湿润脱脂棉； C、 接种;针刺破茎中部表皮，取A步骤获得的烟草疫霉菌丝块菌丝面紧贴于离体茎的中 屯、，加适量的灭菌水至培养床底部，让其渗透、湿润培养床； D、 致病力测定与评价:接种后的离体茎在相对湿度80~85%、溫度25~28°C下黑暗培养， 每天观察发病情况，W第2-3天病斑长度区分致病力及其致病强度。
[0014] 下面W具体实施案例对本发明做进一步说明： 1、材料与方法 1.1烟草疫霉菌丝块制备 将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28°C下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板， 用直径为5 mm的打孔器分别从已培养好的菌落边缘打取菌饼。
[0015] 1.2离体茎制备 选取培育60-70天的烟苗，提前2-3天剪掉烟苗的叶片，让伤口自我修复。取烟草同一茎 位的茎段，75%酒精消毒的剪刀剪下长度4-5 cm、茎围I.2-1.6 cm的茎段，切口处灭菌脱脂 棉包裹，均匀置于培养床(培养皿上垫海绵和滤纸)上，培养床底部加入适量的灭菌水，灭菌 水湿润脱脂棉。
[0016] 1.3 接种 75 %酒精消毒的微量进样器针刺破茎中部表皮，将含有烟草黑腔病菌菌饼的菌丝面分 别紧贴于离体茎的中屯、针刺点上接种，接种空白培养基饼片作为对照，每菌株接种討良离体 茎作为1个处理，重复3次，W接种同样大小的空白培养基饼片作为对照。
[0017] 1.4致病力测定与评价 接种后的离体茎在相对湿度80~85%、溫度25~28°C下黑暗培养，每天观察发病情况，W 第3天病斑长度区分致病力及其致病强度。实验数据WExcel进行常规计算，方差分析则采 用DPS 7.05软件分析。
[〇〇1引2、结果与分析 实验表明，随机取来自云南10个县的烟草黑腔病菌菌株均能侵染红大烟苗茎杆引起发 病，发病率达到100 %。病斑初期从菌饼处开始出现水溃状暗绿色，随之会向周围扩展，病 斑颜色也逐渐转为黑褐色。表1观察发现，病斑长度从30.00-51.67 mm不等，根据病斑长度 及LSD多重比较结果可将10个菌株分为3类:第1类致病强度较强包含4个菌株(Pn26、化20、 Pn23、化11);第2类病强度中等包含5个菌株(？1125、？1116、？118、化13、？116);第3类致病强度弱 包含1个菌株(Pnl5)。观察聚类结果发现，云南烟草黑腔病菌对烟苗致病力的分化与菌株所 处地理位置无明显的相关性，不同地区的不同菌株之间对红大烟苗的致病力会表现出不 同，地理分布较近的菌株对烟苗的致病力也会有显著性差异现象。 「00191 亲1末同他反棚直麗腔痛商创伤巧釉奸十品釉前痛九的比妖
注:表中"±"前面的数字表示病斑长度平均值，后面的数字代表标准差； 小写字母表示P<〇.05水平上的差异显著性，大写字母表示P<0.Ol水平上的差异显著 性。
【主权项】
1. 一种离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，其特征在于包括烟草疫霉菌丝块制备、离 体莖制备、接种、致病力测定与评价步骤，具体包括： A、 烟草疫霉菌丝块制备:将烟草疫霉接种至0A培养基平板，于25~28 °C下黑暗培养7~10 天，将平板菌丝切成菌丝块； B、 离体茎制备:选取培育60~70天的烟苗或培育10~15天新长出的腋芽，提前2~3天剪掉 烟苗或腋芽的叶片和叶柄，以让伤口自我修复，剪取烟草同一茎位的茎段，切口处用灭菌脱 脂棉包裹，均匀置于灭菌的培养床上； C、 接种:于茎段中部表皮处进行刺孔，将A步骤获得的菌丝块菌丝面紧贴于离体茎刺孔 中部位置； D、 致病力测定与评价：将接种后的离体茎于湿度80~85%、温度25~28°C条件下黑暗培 养，每天观察发病情况，以病斑长度区分致病力及其致病强度。2. 根据权利要求1所述的离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，其特征在于A步骤中所述 的菌丝块的直径或边长为5~8mm。3. 根据权利要求1所述的离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，其特征在于B步骤中所述 的茎段的大小为长3~5cm，茎围1~2cm〇4. 根据权利要求1所述的离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，其特征在于B步骤中所述 的培养床为培养皿上垫上海绵和滤纸得到。5. 根据权利要求1所述的离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，其特征在于C步骤中所述 的刺孔为3-5号昆虫针l-2mm间隔排列成2-4_X2-4mm的见方，所刺深度1~2_。6. 根据权利要求1所述的离体茎测定烟草疫霉致病力的方法，其特征在于C步骤还包括 加1~8ml的灭菌水至培养床底部以渗透、湿润脱脂棉。
【文档编号】C12R1/645GK105861619SQ201610276468
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】方敦煌, 肖炳光, 刘萍花, 张谊寒, 陈学军, 曾建敏
【申请人】云南省烟草农业科学研究院