一种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法
【专利摘要】本发明涉及一种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，⑴制备菌体粗悬液；⑵方法三中所得粗悬液经离心后，获取菌体，以含一定量纤维素酶的生理盐水或磷酸盐缓冲液将菌体重悬，至初始体积；⑶梯度稀释：先向梯度稀释液中添加一定量的纤维素酶，再进行梯度稀释实验；⑷充分混匀后，涂布计数或倾注计数。本方法以纤维素酶将菌体从细菌纤维素中释放，制得均匀的菌悬液。并通过向梯度稀释液中添加纤维素酶，达到充分降解菌体间连接的纤维素丝的目的，避免在计数过程中，由于纤维素的存在使菌体无法完全区分，造成菌落聚集或无法计数，该方法应用于涂布计数和倾注计数法时，菌体分离效果极好。
【专利说明】
一种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法
技术领域
[0001]本发明涉及微生物培养技术，特别涉及一种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法。
【背景技术】
[0002]细菌纤维素(Bacterial Cellulose ,BC)是指由醋酸菌属(Acetobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和八叠球菌属(Sarcina)等微生物合成的，为与植物纤维区别，命名为“细菌纤维素”或者“微生物纤维素”。目前，研究范围最广、所产细菌纤维素性质相对较优良的是醋酸杆菌属。
[0003]Czaja W等和Tang WH等研究表明，醋酸杆菌在静置培养和振荡培养生产细菌纤维素的过程中，菌体大多被包裹于膜状和球状细菌纤维素中。Brown等研究报道表明，木醋杆菌的细胞膜表面，分布着密集的纤维素分泌位点。纤维丝以2um/min的速度不断延伸，并推动细胞运动。纤维丝之间又通过氢键相互连接，形成细菌纤维素独特的三维网状结构。由于科研或应用中的需求，常常要把菌体从细菌纤维素的网状结构中分离出来。目前，国内外科研学者和细菌纤维素生产厂家，多为酸碱处理法将菌体细胞破裂，从而达到将菌体与细菌纤维素分离的目的。然而，若是要对菌体进行活菌计数，则此方法不可行。通常利用稀释涂布法对醋酸杆菌进行菌落计数，然而，菌落无法分开，只能以菌落覆盖面积，粗略比较样本减菌落浓度的差异。赵琼等人通过向培养基中添加纤维素酶而获得均匀的菌悬液。然而，此方法应用于菌落计数时，依然无法得到单一的菌落，因而无法进行有效计数。
[0004]我们在实验的过程中发现，此方法失败的原因主要是忽略了菌体在实验过程中所产生的纤维素。因此，本发明以此为出发点，提出一种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法。
【发明内容】
[0005]本发明为克服现有技术的不足，提供一种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，本方法将达到利用倾注和涂布等方法对细菌纤维素生产菌株进行有效活菌计数的目的。
[0006]为实现发明目的，本发明所采用的具体实验步骤如下:
[0007]—种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，步骤如下:
[0008]⑴制备菌体粗悬液;将菌体培养，形成菌体粗悬液，将菌体菌体粗悬液中纤维素降解至无肉眼可见纤维丝；
[0009]⑵菌体粗悬液在纤维素被完全降解后，离心获取菌体，以含纤维素酶的生理盐水或磷酸盐缓冲液将菌体重悬，至初始体积；
[0010]⑶梯度稀释:先向梯度稀释液中添加纤维素酶，再进行梯度稀释实验；
[0011 ]⑷充分混匀后，涂布计数或倾注计数。
[0012]而且，所述菌体粗悬液的制备有三种不同的方法:①向发酵培养基中添加纤维素酶，接种生产菌株进行培养;②或向培养一段时间的发酵液中添加纤维素酶，继续培养一段时间后，纤维素被降解;③或将培养好的发酵液离心，取得全部菌体和细菌纤维素，再浸于纤维素酶液中，降解至无肉眼可见纤维丝。
[0013]而且，所述菌体粗悬液的制备方法适用于静置培养、振荡培养、鼓泡培养和转盘培养。
[0014]而且，梯度稀释液中纤维素酶含量0.5U-10U。
[0015]而且，梯度稀释实验的稀释梯度为10—4、10—5和10'
[0016]本发明的优点和积极效果如下:
[0017]本发明提供一直细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，本方法遵循典型的活菌计数法，实验结果可靠性强。
[0018]本发明提供细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法解决了一直以来困扰相关研究领域科研人员的技术难题，推动了相关科研工作的技术进步。
【附图说明】
[0019]图1为利用菌体粗悬液稀释涂布醋酸杆菌的平板照片；
[0020]图2为利用本发明的方法稀释涂布醋酸杆菌的平板照片；
[0021]图3为实施例1的菌落涂布照片；
[0022]图4为实施例2的菌落涂布照片；
[0023]图5为实施例4的菌落涂布照片。
[0024]具体实施案例
[0025]下面结合实施案例，对本发明进一步说明，下述实施案例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施案例来限定本发明的保护范围。
[0026]以下实施案例所采用的菌株为木葡萄糖酸醋杆菌(GluconacetobacterxylinusCGMCC N0.2955)，其合成的带状纤维素具有纯度高、聚合度高、结晶度高等优点，是目前细菌纤维素先关领域研究最为广泛的菌株之一。
[0027]实施例1
[0028]—种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，步骤如下:
[0029]⑴挑一环菌落，接种至150mL发酵培养基中。培养基配方:葡萄糖25g/L，酵母粉7.5g/L，蛋白胨10g/L，Na2HP04l0g/L，3% (v/v)过滤除菌的纤维素酶(100U)WC振荡培养(180rpm)48h。
[0030]⑵取ImL菌液注入含有8.9mL无菌生理盐水和0.1mL的纤维素酶(1000U)的试管内，振摇试管，使管内溶液混匀，制成1:10的稀释液。
[0031]⑶按上述操作依次做10倍递增稀释至10—6，在10—4、10—5和10—6梯度对应的试管内分别取10yL稀释液，均匀涂布于固体平板上，28°C倒置培养3-4天后，进行菌落计数，见图3。
[0032]实施例2
[0033]—种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，步骤如下:
[0034]⑴实施例挑一环菌落，接种至50mL发酵培养基中。培养基配方:葡萄糖25g/L，酵母粉7.5g/L，蛋白胨 I Og/L，Na2HPO41 Og/L。30 °C 静置培养 72h。
[0035]⑵将发酵液和所产BC全部倾注至50mL离心管中，5000rpm离心5min。弃上清，向沉淀中加入5mL膜过滤的纤维素酶(1000U)，30°C静置30min至纤维素完全降解。5000rpm离心5min，弃上清。
[0036]⑶以50mL无菌生理盐水将沉淀重悬，充分混匀后，取ImL菌液注入含有8.8mL无菌磷酸盐缓冲液和0.2mL纤维素酶(1000U)的试管内。振摇试管使管内溶液混匀，制成1:10的稀释液。按上述操作依次做10倍递增稀释液，至10一7。
[0037]⑷在10—5、10—6和10—7梯度对应的试管内分别取10yL稀释液，均匀涂布于固体平板上。30°C倒置培养3-4天后，进行菌落计数，见图4。
[0038]实施例3
[0039]—种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，步骤如下:
[0040]⑴挑一环菌落，接种至150mL发酵培养基中。培养基配方同案例2。30°(:振荡培养(160rpm)20h后，添加5mL纤维素酶(1000U)，继续振荡培养4h。
[0041]⑵按照案例I的方法梯度稀释，取150yL稀释液均匀涂布于固体平板上。30°C倒置培养3-4天后，进行菌落计数。
[0042]实施例4
[0043]—种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，步骤如下:
[0044]⑴挑一环菌落，接种至5L鼓泡式发酵罐中。培养基配方同案例2。30°C培养24h后，取10mL含絮状细菌纤维素的发酵液至无菌三角瓶中，充分振荡混匀。
[0045]⑵按照案例2的方法降解纤维素并梯度稀释至10—5后，在10—5、10—6和10—7梯度对应的试管内分别取10yL稀释液，采用倾注法计数。30°C倒置培养3-4天后，进行菌落计数，见图5。
【主权项】
1.一种细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，其特征在于:步骤如下: ⑴制备菌体粗悬液;培养菌体，将发酵液中的纤维素降解至无肉眼可见纤维丝； ⑵菌体粗悬液在纤维素被完全降解后，离心获取菌体，以含纤维素酶的生理盐水或磷酸盐缓冲液将菌体重悬，至初始体积； (3)梯度稀释:先向梯度稀释液中添加纤维素酶，再进行梯度稀释实验； ⑷充分混匀后，涂布计数或倾注计数。2.根据权利要求1所述的细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，其特征在于:所述菌体粗悬液的制备有三种不同的方法:①向发酵培养基中添加纤维素酶，接种生产菌株进行培养;②或向培养一段时间的发酵液中添加纤维素酶，继续培养一段时间后，纤维素被降解；③或将培养好的发酵液离心，取得全部菌体和细菌纤维素，再浸于纤维素酶液中，降解至无肉眼可见纤维丝。3.根据权利要求2所述的细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，其特征在于:所述菌体粗悬液的制备方法适用于静置培养、振荡培养、鼓泡培养和转盘培养等。4.根据权利要求1所述的细菌纤维素生产菌株的活菌计数方法，其特征在于:梯度稀释液中纤维素酶含量0.5U-10U。
【文档编号】C12Q1/06GK105861622SQ201610355676
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】钟成, 刘淼, 邓婷月, 贾士儒, 郑鑫, 杨啸天, 谭之磊, 韩培培
【申请人】天津科技大学