一种用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法及其试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法及其试剂，所述用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法包括以下步骤：将CTCA琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至50?55℃时，加入利奈唑胺，所述利奈唑胺的浓度为1.5~3ug/ml，得到含有利奈唑胺的CTCA琼脂溶液，将所述含有利奈唑胺的CTCA琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值为7.0?7.5，得到检测平皿；取粪便标本，涂于步骤S1所述检测平皿的平板上，培养2天后计数肠球菌的总菌落数。本发明的技术方案，操作简单，检验快速，且具有极高的灵敏性，可以直接筛选出利奈唑胺耐药肠球菌，能迅速准确筛选出利奈唑胺耐药肠球菌定植人群。
【专利说明】
-种用于检测利奈性胺耐药肠球菌定植的方法及其试剂
技术领域
[0001] 本发明属于医学检验技术领域，尤其设及一种用于检测利奈挫胺耐药肠球菌定植 的方法及其试剂。
【背景技术】
[0002] W利奈挫胺(Xinezoid，LZD)为代表的嗯挫烧酬类(oxazolidinone)药物是治疗万 古霉素耐药肠球菌（巾日11(3〇1]17(3；[]1-的313化]11:化1日1'〇(3〇(3(3；[，￥1?6)感染和控制￥1?6院内感染暴 发流行的主要药物之一。随着近年LZD广泛应用于难治性G+(gram-positive)菌感染及结核 杆菌感染，其临床耐药问题日益突出，国内外LZD耐药株散发报道日渐增多，甚至不断有院 内暴发流行报道。2011年CHI肥T数据提示La)耐药肠球菌中E.fecalis为0.2% ,E.faecium 为0.1 %，E.gal1 inarum为1.2%，E.avium为2.3 %;2012年E.fecaliS为0.3%，E.faecium为 0,2013 年 E.fecalis 为 0.6%，E.faecium 为 0.4%;2014 年 E.fecalis 为 0.8%，E.faecium 为 0.2%。
【申请人】所在医院2013年和2014年临床分离粪肠球菌LZD耐药率为1.2%和0.7% ;近2 年共发现6株譜鸡肠球菌、5株铅黄肠球菌和3株尿肠球菌中介耐药。美国LEAD邸研究报告近 10年LZD耐药粪肠球菌数据波动在0.5-2%。另有散在报道提示上海、北京等多家医院均有 逐渐增多的LZD耐药株散发病例。随着LZD在临床更为广泛应用，未来我们将面临其严峻的 耐药形势，其中粪肠球菌和葡萄球菌耐药株快速增多尤其引人关注;其中临床分离LZD耐药 肠球菌主要为粪肠球菌，尿肠球菌和其他肠球菌亚群耐药株的分离和机制研究鲜见报道。
[0003] 随着LZD耐药报道增多，临床院感工作中如何对该类多重耐药菌(MDRO)进行院感 耐药管理成为临床需要明确的紧迫问题，根据我国最新公布的《多重耐药菌医院感染预防 与控制中国专家共识》要求和院内VRE监测经验，理论上对该类细菌均应采取接触隔离处理 措施，然而对于LZD耐药菌防控目前仍未引起重视，该类细菌在院内感染防控中是否也需要 "享受"VRE相同"待遇"仍有待理论支持。因此，对于利奈挫胺耐药肠球菌如何监测需要方便 快捷的方法用于该类临床研究和未来的院感监测工作，通过对宿主LZD耐药肠球菌定植规 律研究可望为制定该类MDRO定植人群耐药菌控制和传播策略提供"现实而直接"的数据参 考和理论基础。
[0004] 随着LZD耐药菌株报道日益增多，而运些从患者标本分离的耐药株是否早已定植 在宿主体内呢？如何从体内监测LZD耐药肠球菌株定植变化，目前鲜见相关研究。目前常用 的方法为通过血平板监测大便标本中的菌群生长情况，根据细菌形态学特点挑取其中肠球 菌菌株，然后进行鉴定最后确定该菌株是否为利奈挫胺耐药肠球菌，运一过程复杂、阳性率 低，不能有效筛选利奈挫胺耐药肠球菌耐药株定植的阳性人群。因此，迫切需要一种简单实 用的方法用于该类细菌的筛选和鉴定，W便于开展相关临床研究和相关院感工作。
【发明内容】
[0005] 针对W上技术问题，本发明公开了一种用于检测利奈挫胺耐药肠球菌定植的方法 及其试剂，此方法具有极高的灵敏性，直接筛选出利奈挫胺耐药肠球菌，从而为院感防治提 供有力武器。
[0006] 对此，本发明的技术方案为：
[0007] -种用于检测利奈挫胺耐药肠球菌定植的方法，包括W下步骤：
[000引步骤Sl:将CTCA琼脂溶解于蒸馈水中，并进行灭菌，冷却至50-55°C时，加入利奈挫 胺，所述利奈挫胺的浓度为1.5~3ug/ml，得到含有利奈挫胺的CTCA琼脂溶液，将所述含有 利奈挫胺的CTCA琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值为7.0-7.5，得到检测平皿;其中，所述 CTCA琼脂加热溶解于蒸馈水中，并进行i2rc灭菌。
[0009] 步骤S2:取粪便标本或体液标本，涂于步骤Sl所述检测平皿的平板上，培养2天后 计数肠球菌的总菌落数。其中，所述体液包括疲液、或其他临床耐药菌筛选用标本。
[0010] 作为本发明的进一步改进，步骤Sl中，所述利奈挫胺的浓度为化g/ml。
[0011] 作为本发明的进一步改进，步骤SI中，调整抑值为7.0。
[0012] 作为本发明的进一步改进，所述用于检测利奈挫胺耐药肠球菌定植的方法还包括 步骤S3:从步骤S2的平板上随机挑取肠球菌并进行克隆得到耐药菌株，采用E-test方法测 定耐药菌株的MIC值;其中，所述耐药菌株在确定其MIC值之前，应在无抗生素培养基中培养 3代，同时采用粪肠球菌质控菌株ATCC29212进行质控。
[0013] 作为本发明的进一步改进，所述粪便标本为新鲜粪便标本，或将粪便溶于Iml的 BHI培养基并加入20%甘油混匀的粪便标本。
[0014] 作为本发明的进一步改进，所述CATC琼脂包含的组分及其浓度为：膜酪蛋白腺 15g/L、酵母浸粉5g/L、憐酸二氨钟5g/L、巧樣酸钢15g/L、吐溫80 Ig/L、碳酸钢2g/L、叠氮钢 0.4g/L、红四氮挫(TTC) 0.1 g/L、琼脂 15g/L，pH 值为7.0 ± 0.2。
[0015] 作为本发明的进一步改进，步骤Sl还包括将所述检测平皿冷却凝固有放入四度冰 箱保存备用。
[0016] 本发明还公开了一种用于检测利奈挫胺耐药肠球菌定植的试剂，其特征在于：其 包含无菌CTCA琼脂和利奈挫胺，其中所述利奈挫胺的浓度为1.5~3ug/ml，所述用于检测利 奈挫胺耐药肠球菌定植的试剂的pH值为7.0-7.5。
[0017] 作为本发明的进一步改进，所述利奈挫胺的浓度为化g/ml，所述用于检测利奈挫 胺耐药肠球菌定植的试剂的pH值为7.0。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0019] 采用本发明的技术方案，操作简单，检验快速，且具有极高的灵敏性，可W直接筛 选出利奈挫胺耐药肠球菌，从而为院感防治提供有力武器;能迅速准确筛选出利奈挫胺耐 药肠球菌定植人群，有利于临床中耐药传播的控制和抗生素选择，从而为细菌耐药防控提 供基础。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明采用平板筛选肠球菌结果对比图。图中，1#为宿主于某粪便标本在含 LZD为化g/ml的CTCA平板中的肠球菌生长图片；別为宿主于某粪便标本在无抗CTCA平板的 的肠球菌生长图片；3#为宿主曾某粪便标本在无抗CTCA平板的肠球菌生长图片;4#为宿主 曾某粪便标本在含LZD为化g/ml的CTCA平板中的肠球菌生长图片。
[0021] 图2是本发明4例宿主在无抗和含抗化ZD)平板中肠球菌亚群分布差别比较图，其 中，No antibiotics:无抗平板;LZD-positive:含LZD平板。
【具体实施方式】
[0022] 下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0023] 实施例1
[0024] -种用于检测利奈挫胺耐药肠球菌定植的方法，包括W下步骤：
[00巧]步骤SI:将CTCA琼脂58.5g加热溶解于1000 ml蒸馈水中，并于121°C高压灭菌，冷却 至50-55°C时，加入利奈挫胺，所述利奈挫胺的浓度为1.加 g/ml，得到含有利奈挫胺的CTCA 琼脂溶液，其中，所述CTCA琼脂的配方为膜酪蛋白腺15g/L、酵母浸粉5g/L、憐酸二氨钟5g/ L、巧樣酸钢15g/L、吐溫80 Ig/L、碳酸钢2g/L、叠氮钢0.4g/L、红四氮挫(TTC)0.1g/L、琼脂 15g/L，其抑值7.0 ± 0.2;将所述含有利奈挫胺的CTCA琼脂溶液倒入五个直径9cm的无菌平 皿(20ml/皿）中，采用盐酸和化OH调整培养基抑值分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，五个检测 平皿样本进行分析，将其冷却凝固有放入四度冰箱保存备用，分别每7天取出平板观察平板 中LZD耐药肠球菌生长能力的差别，观察药物稳定性。
[0026] 步骤S2:取患者0.5g新鲜粪便、或取0.5g粪便溶于Iml的BHI培养基并加入20%甘 油混匀保存用于选择性培养作为粪便样本，取粪便样本涂片观察菌群是否失调;然后取5mg 粪便标本，分别涂于步骤SI所述检测平皿的平板上，培养2天后计数肠球菌的总菌落数，即 无抗平板中的生长数，计算〇.5g粪便含的总肠球菌数，如果细菌量多，可采用稀释为10-10^9 倍数倍比稀释方法进行计数，通过无抗平板计算〇.5g粪便总肠球菌数量和含LZD平板中不 敏感肠球菌数量，分析不同pH值对耐药肠球菌生长的影响。
[0027] 步骤S3:分别在无抗和含有LZD随机挑取肠球菌克隆15株，采用E-test方法测定菌 株各抗生素 MIC值，采用细菌鉴定仪(梅尼埃)和ieSrRNA测序方法鉴定细菌亚群，初步比较 LZD耐药菌筛选的稳定性和最佳条件情况。为了保证耐药菌株稳定性，耐药菌株在确定其 MIC值之前，应在无抗生素培养基中培养3代，同时采用粪肠球菌质控菌株ATCC29212进行质 控。
[0028] 实施例2
[0029] 在实施例1的基础上，本例中，所述利奈挫胺的浓度为化g/ml，其他同实施例1。
[0030] 实施例3
[0031 ]在实施例1的基础上，本例中，所述利奈挫胺的浓度为2.加 g/ml，其他同实施例1。
[0032] 实施例4
[0033] 在实施例1的基础上，本例中，所述利奈挫胺的浓度为3ug/ml，其他同实施例1。
[0034] 对比例1
[00巧]在实施例1的基础上，本例中，所述利奈挫胺的浓度为Oug/ml，即不添加利奈挫胺， 其他同实施例1。
[0036] 对比例2
[0037] 在实施例1的基础上，本例中，所述利奈挫胺的浓度为0.加 g/ml，其他同实施例1。 [003引对比例3
[0039] 在实施例1的基础上，本例中，所述利奈挫胺的浓度为lug/ml，其他同实施例1。
[0040] 对比例4
[0041 ]在实施例1的基础上，本例中，所述利奈挫胺的浓度为3.加 g/ml，其他同实施例1。
[0042] 实施例5
[0043] 针对上述实施例1~4和对比例1~4，挑取其中的3份标本挑取50个克隆分析各平 板利奈挫胺耐药肠球菌筛选状态的影响，对其进行MIC值测定，结果如表1和图1所示，可见 含UD分别为化g/ml、2.加 g/m巧日3ug/ml浓度的CTCA平皿测得的LZD不敏感肠球菌的MIC值〉 4ug/ml，能较好的将LZD不敏感肠球菌筛选出来，其中LZD含量为化g/ml的CTCA平皿筛选细 菌MIC值均符合要求，可W较好的将LZD不敏感（intermediate和resistant)细菌均筛选出 来，筛选效果最好。由图1可见，1#宿主于某粪便标本在含LZD为化g/ml的CTCA平板和2#宿主 于某粪便标本在无抗CTCA平板中均有较好生长;3#宿主曾某粪便标本在无抗CTCA平板和4# 宿主曾某粪便标本在含LZD为化g/ml的CTCA平板中均有较多克隆的肠球菌生长，说明含LZD 平板具有"一步法"筛选LZD耐药肠球菌定植菌的良好功能。
[0044] 表1含LZD不同浓度CTCA平皿筛选宿主粪便标本中LZD不敏感肠球菌结果
[OfUSl
[0046] 针对LZD含量为化g/ml的CTCA平皿的不同抑值的平板耐药菌进行对比，结果如表2 所示，从表2中可见，pH值为6.5和8.0时，含化g/ml的平板耐药菌生长明显高于抑值为7.0和 7.5，说明该pH值为6.5和8.0两个pH值条件下可导致药物失效，说明我们制备的CTCA平皿最 好抑值能在7.0-7.5之间，该抑值范围内抗生素在培养基中能具有较好的活性。
[0047] 表2含LZD化g/ml的不同PH值CTCA平皿筛选宿主粪便标本中La)不敏感肠球菌结 果
[004引
[0049] ▲:细菌克隆数计数重复5次后统计采用"均数±标准差"描速结果。
[0050] 然后，针对抑值为7.0的含LZD为2ug/ml平板、存放不同时间点，观察其活性，结果 如表3所示，从表3中可见，pH值为7.0的含LZD为化g/ml平板有较好的保存期活性，其活性可 保存49天。
[0051 ]表3含化g/ml利奈挫胺CTCA平板存放不同时间点的活性观察结果
[0化2]
[0化3] 实施例6
[0054] 针对健康宿主57例健康人宿主粪便LZD耐药肠球菌定植情况进行了研究，采用无 抗和化g/ml浓度CTCA平皿培养2天后计数总菌落数，计算0.5g粪便标本肠球菌总数，结果显 示所有57例患者中54例粪便培养出肠球菌，其中14例采用我们制备的含LZD 2ug/ml的CTCA 平皿筛选到LZD耐药肠球菌定植，另有3例无肠球菌定植，结果详见表4。对照方法采用常规 的血培养平板培养粪便标本，根据形态确定粪肠球菌，继之进行药敏检测，结果显示57例患 者仅1例检测到LZD不敏感肠球菌的定植，说明该方法与其他普通常规方法相比具有较好的 优越性，本发明的方法具有极高的灵敏性，能直接筛选出利奈挫胺耐药肠球菌，从而为院感 防治提供有力武器。
[0055] 表4 57例健康人群肠道微生态LZD不敏感肠球菌筛选结果 「0化61
[0化7]实施例7
[0058]由于肠球菌含有超过20种亚群，因此本发明的方法是否能筛选出人体不同的肠球 菌亚群需要进一步验证。我们同时对无抗和La)筛选平板生长的肠球菌亚群进行了初步分 析，其结果见表5所示，由表5可见54例宿主分离肠球菌包含7个亚群，将各亚群按主要 (dominant )、次要（Secondary )和稀少（Scarce )分类，结果显示，敏感株中W粪肠 "dominant"为48/54，而不敏感株中粪肠"dominant"比例仅为25/54;不敏感组中亚群分布 车交广，包括 E.邑i Ivus、E. raff inosus、E. casse Iif Iavus、E. avium 和 E.邑 all inarum 等。我们选 取4例宿主(包括2例粪肠为dominant, 2例其他细菌为dominant)在含抗和不含抗平板中100 株细菌亚群分布情况，结果如图2所示。由图2可见，4例患者LZD平板中肠球菌生长丰富，取 无抗平板和LZD平板分别挑取100克隆分析其亚群差别，结果显示两者的构成比差别显著， 说明无抗平板分离的敏感株和含抗平板分离的不敏感株在亚群分布上差异显著;我们进一 步按MIC值进行细分，分为不敏感(intermediate)为4-8ug/ml，低MIC值为8-16ug/ml，高MIC 值为高于16ug/ml，我们发现高MIC值均为粪肠球菌，在不敏感（intermediate)的肠球菌亚 群分布尿肠超过粪肠，E. gallina;rum、E.raff inosus、E. casselif Iavus比例亦比较丰富。因 此根据运一结果分析我们建立的筛选方法可W较好的将LZD不敏感肠球菌各亚群较好的筛 选出来。
[0059] 表5健康人群粪便标本LZD敏感和不敏感肠球菌亚群分布特点
[0060]
[0061 ] 实施例8
[0062] 采用上述方法对0-内酷胺类抗生素治疗人群粪便LZD耐药肠球菌株进行短期观 察，观察0-内酷胺类抗生素抗感染治疗，其中21例Cef triaxone，12例Cefoperazone/ Su化actam和13例Imipenem/Cilastatin，患者治疗前和治疗5天时增加肠道粪便标本LZDr 化ZD resistant)肠球菌定植比例，结果如表6所示，由表6可见，0-内酷胺类抗生素能够增 力化ZD耐药肠球菌株定植比例。
[0063] 表6抗生素治疗过程(DO和D5)中肠道肠球菌(包括LZD不敏感肠球菌)检测结果
[0064]
[0065] *，筛选获得具有LZD不敏感肠球菌定植人群比例。结果提示=种抗生素使用5天后 在D5均较DO该类耐药菌比例有上升。
[0066] 肠球菌选择性培养基较多，但目前临床使用的仍然主要W非选择性培养皿血培养 皿为主，在临床标本筛选过程中血培养皿具有显著的优势，细菌生长谱广，而且可W获得较 为稳定的结果，然而对于院感检测该类培养基使用较为不利，院感检测主要用于祀向性检 测各种耐药细菌，对于敏感细菌并不关注，尤其是危重病人，本发明的技术方案能迅速准确 筛选出利奈挫胺耐药肠球菌定植人群，有利于临床中耐药传播的控制和抗生素选择，从而 为细菌耐药防控提供基础。
[0067] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护犯i围。
【主权项】
1. 一种用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法，其特征在于:包括以下步骤： 步骤S1:将CTCA琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至50-55°C时，加入利奈唑 胺，所述利奈唑胺的浓度为1.5~3ug/ml，得到含有利奈唑胺的CTCA琼脂溶液，将所述含有利 奈唑胺的CTCA琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值为7.0-7.5，得到检测平皿； 步骤S2:取粪便标本或体液标本，涂于步骤S1所述检测平皿的平板上，培养2天后计数 肠球菌的总菌落数。2. 根据权利要求1所述的用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法，其特征在于:步骤 S1中，所述利奈唑胺的浓度为2ug/ml。3. 根据权利要求1所述的用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法，其特征在于:步骤 S1中，调整pH值为7.0。4. 根据权利要求1所述的用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法，其特征在于:还包 括步骤S3:从步骤S2的平板上随机挑取肠球菌并进行克隆得到耐药菌株，采用E-test方法 测定耐药菌株的MIC值;其中，所述耐药菌株在确定其MIC值之前，应在无抗生素培养基中培 养3代，同时采用粪肠球菌质控菌株ATCC29212进行质控。5. 根据权利要求1~4任意一项所述的用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法，其特 征在于:所述粪便标本为新鲜粪便标本，或将粪便溶于lml的BHI培养基并加入20%甘油混匀 的粪便标本。6. 根据权利要求5所述的用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法，其特征在于，所述 CATC琼脂包含的组分及其浓度为:胰酪蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、磷酸二氢钾5g/L、柠 檬酸钠15g/L、吐温80 lg/L、碳酸钠2g/L、叠氮钠0.4g/L、红四氮唑0.1g/L、琼脂15 g/L，pH 值为 7.0±0.2。7. 根据权利要求6所述的用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的方法，其特征在于:步骤 S1还包括将所述检测平皿冷却凝固有放入四度冰箱保存备用。8. -种用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的试剂，其特征在于:其包含无菌CTCA琼脂 和利奈唑胺，其中所述利奈唑胺的浓度为1.5~3ug/ml，所述用于检测利奈挫胺耐药肠球菌 定植的试剂的pH值为7.0-7.5。9. 根据权利要求8所述的用于检测利奈唑胺耐药肠球菌定植的试剂，其特征在于:所述 利奈唑胺的浓度为2ug/ml，所述用于检测利奈挫胺耐药肠球菌定植的试剂的pH值为7.0。
【文档编号】C12Q1/10GK105861624SQ201610344430
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】余治健, 邓启文, 程航, 郑金鑫, 陈重
【申请人】深圳市南山区人民医院