清热解毒类药品抗菌生物活性测定多参数评价方法
【专利摘要】本发明涉及中医药技术领域，具体为一种清热解毒类药品抗菌生物活性测定多参数评价方法，包括（1）、菌液制备，（2）、药液制备，（3）、正式试验，（4）、结果计算与多参数统计：定义：R≥0.8为极相关，计分为2；0.5<R<0.8为相关，计分为1；R ≤0.5为可疑，计分为0；IC50≥0.1为可疑，计分为0；0.01< IC50<0.1为抑制，计分为1；IC50≤0.01为强抑制，计分为2；IC95≥5为可疑，计分为0；1< IC95<5为抑制，计分为2；IC95≤1为强抑制，计分为3；统计每批药物对各菌的此三项计分和，将每个企业各批次计分和平均作为此企业样品抑菌指数。
【专利说明】
清热解毒类药品抗菌生物活性测定多参数评价方法
技术领域
[0001]本发明涉及中医药技术领域，具体为一种清热解毒类药品抗菌生物活性测定多参数评价方法。
【背景技术】
[0002]清热解毒，清热法之一。适用于瘟疫、温毒及多种热毒病证或疮疡疔毒的治法。症见高热烦扰、口燥咽干、便秘尿黄、或吐衄发斑，或红肿热痛，舌红苔黄，脉数有力等。常用药有黄连、黄芩、黄柏、石膏、连翘、板蓝根、蒲公英等，代表清热类食物有清热凉血，解毒的作用，宜于治疗热证。例如，清热解毒类药品防风通圣丸出自《宣明论方》，临床报道，对于感冒、湿疹、习惯性便秘、荨麻疹等疾病都有很好的疗效。
[0003]中药质量标准和含量测定方法具有很大的局限性，未能达到中药质量标准的最终目的，也不符合中医的整体思想。首先，目前的中药质量标准在很大程度上是通过测定某一个或某几个有效成分的含量来对中药的质量加以控制，且该指标成分不一定是该药品的药效成分或主要药效成分，即使为主要药效成分，其低微的含量限度与临床有效剂量间缺乏相关性，因而该指标成分测定也不一定能代表总体生物活性。最为关键的是对于组成药物多、成分极其复杂的中药制剂，很难用其中一味药的某个化学成分的作用来阐述其药效。
[0004]其次，中成药在批准上市前新药研究阶段虽然经过主要药效学试验和临床研究，研究结果表明药品具有有效性，但药效学研究和临床研究时样品的代表性、可靠性以及中药活性成分的可变性，不能保证每批产品是否仍具有药效作用，其重现性一般未经验证。
[0005]中药制剂在生产过程中原料来源发生改变时、在考虑改进工艺时、在考核产品稳定性时，一般对生物活性可能发生的变化考虑甚少，认为只要满足目前的药品标准即可。长此下去，某些药品虽然仍符合目前的药品标准，生物活性必然也会发生很大变化。
[0006]因此，理化分析方法和“生物活性效价测定”方法的结合能够通过综合和分析的方法达到全面控制中药注射剂质量的目的。
[0007]为了更全面、更好地了解和控制清热解毒类药品的质量，拟从抗菌生物活性方面，用多参数评价方法测定不同企业不同剂型供试品的解毒作用，以评价不同企业产品的有效性。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是建立一个简便、专属的检测清热解毒类药品的解毒作用的生物活性多参数评价方法，用于测定和比较不同企业不同剂型供试品的抗菌生物活性。
[0009]本发明是采用如下技术方案实现的:
一种清热解毒类药品抗菌生物活性测定多参数评价方法，包括如下步骤:
(I)、菌液制备:
用选择性琼脂平板分离所试菌，取纯菌接种MH肉汤，化脓性链球菌接种脑浸出物培养基，37°C培养24小时，该菌液作为原液，再用稀释液稀释至所需浓度备用，计数大约17?18个/mL;
(2)、药液制备:
将供试品用生理盐水配制成0.25g/mL混悬液，对照组按照原处方去除主药后其余药物的用量及相同浓度药物，配制成混悬液，震荡混勾3min，3000rpm，1min后，取上清用0.45μηι膜过滤，无菌分装备用；实验时，用MH肉汤做2倍稀释，最终菌液中药物浓度为0.125g/mL?
0.004g/mL;同时设空白对照，阳性对照；
(3)、正式试验:
各管加入培养液稀释的药液0.5mL，各管依次定量加入用培养液稀释好的试验菌液(105/mL-106/mL)，0.5mL，混匀，封口，37°C培养24小时，观察各管试验情况，并分别取出培养物定量(200仙)点种无菌平板内，加0.5% MTT 50μ?，37°(:培养4小时，加DMSO lOOyL吹打提取MTT，酶标492nm测定结果；
(4)、结果计算与多参数统计:
根据酶标仪测定的MTT吸光度值，设同板菌液对照孔OD平均值为对照，其抑制率0%，计算不同浓度药物抑制率，抑制率=(对照OD-药物组OD)/对照OD，用IC50计算软件计算如下指标:1C50，IC95，量效关系R值为多参数评价指标；
定义:R 2 0.8为极相关，计分为2; 0.5<R<0.8为相关，计分为I ；R <0.5为可疑，计分为
O；
1〇50 2 0.1为可疑，计分为0;0.01〈 1〇50〈0.1为抑制，计分为1;1050<0.01为强抑制，计分为2 ；
IC95 > 5为可疑，计分为O; 1< IC95〈5为抑制，计分为2 ；IC95< I为强抑制，计分为3;
统计每批药物对各菌的此三项计分和，将每个企业各批次计分和平均作为此企业样品抑菌指数。
[0010]本发明方法建立了一种清热解毒类药品抗菌生物活性测定多参数评价方法。测定细菌MTT吸光值具有很强的专属性，而且简便快速客观，适合大批量处理。应用多指标多参数综合评价，避免了一种指标评价孤立、易受试验条件的影响等缺点，多种参数全面评价，多指标立体反映试验结果，不易受试验条件的影响。
[0011]经19批次中药制剂验证，本法准确、客观、重现性更好。可用于对清热解毒类药品抗菌生物活性测定，以达到综合评价和控制此类产品质量的目的。
【附图说明】
[0012]图1表示MTT法与菌计数法结果(20100822金葡)对比图。
[0013]图2表示MTT法与平板法结果(20100815金葡)对比图。
【具体实施方式】
[0014]下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
[0015]本实施例以清热解毒类药品中的防风通圣丸为例进行说明。
[0016]1、试验材料
药物:采用单盲法提供药物，提供者选取各剂型不同企业防风通圣丸19批，药物信息编号后，对实验者单盲，实验者不清楚有关药物信息。试验结束数据汇总后揭盲。
[0017]本试验涉及7个企业，阴性药物对照为矿物药对照，按照处方量及药物浓度制备的芒硝、石膏和滑石粉混悬液，阳性对照为扁咽口服液。
[0018]菌种:参考文献，选择对清热解毒类药品(防风通圣丸)的敏感菌:化脓性链球菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌。均购自中国药品生物制品检定所。大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌培养液为MH营养肉汤培养液，化脓性链球菌培养液为脑浸出物培养基。常规方法复苏、扩增、传代、保种。
[0019]2、试验方法
模型:选用体外抑菌模型评价
2.1、菌液制备:用选择性琼脂平板分离所试菌，取纯菌接种MH肉汤，化脓性链球菌接种脑浸出物培养基，37°C培养24小时，该菌液作为原液，再用稀释液稀释至所需浓度备用，计数大约107~108个/mL。
[0020]2.2、药液制备:将供试品防风通圣丸或颗粒剂用，生理盐水配制成0.25g/mL混悬液，对照组矿物样按照原处方用量及相同浓度药物，配制成混悬液(其中含芒硝0.962g/lOOmL，石膏 1.923g/100mL，滑石粉 5.769g/100mL)，震荡混匀 3min，3000rpm、10min 后，取上清用0.45μπι膜过滤，无菌分装备用。实验时，用MH肉汤做2倍稀释，最终菌液中药物浓度为
0.125g/mL?0.004g/mL。同时设空白对照，阳性对照。
[0021 ] 2.3、正式试验:各管加入培养液稀释的药液0.5mL，各管依次定量加入用培养液稀释好的试验菌液(105/mL?10%L)，0.5mL，混匀，封口，37 °C培养24小时，观察各管试验情况，并分别取出培养物定量(200灿)点种无菌平板内，加0.5% MTT 50灿，37°C培养4小时，加DMSO 100μ I吹打提取MTT，酶标492nm测定结果。
[0022]2.4、结果计算与多参数统计:根据酶标仪测定的MTT吸光度值，设同板菌液对照孔OD平均值为对照，其抑制率0%，计算不同浓度药物抑制率，抑制率=(对照OD-药物组OD)/对照0D，用IC50计算软件计算如下指标:1C50，IC95，量效关系R值为多参数评价指标。
[0023]定义:R2 0.8为极相关，计分为2; 0.5〈R〈0.8为相关，计分为I ;R <0.5为可疑，计分为O。
[0024]1〇50 2 0.1为可疑，计分为0;0.01〈 IC50〈0.1为抑制，计分为I; IC50 < 0.01为强抑制，计分为2。
[0025]IC95 2 5为可疑，计分为0;1〈 IC95〈5为抑制，计分为2; IC95 < I为强抑制，计分为3。
[0026]统计每批药物对各菌的此三项计分和，将每个企业各批次计分和平均作为此企业样品抑菌指数。
[0027]2.5、方法学研究:为了观察MTT法用于抑菌试验的效果，在试验前还对MTT比色结果与细胞计数结果进行对比，另外还对MTT比色结果与细菌接种平板后的结果进行对比。另外在每次试验时，设立菌液对照，培养液对照，矿物药对照和阳性对照两个随行对照进行方法的质量控制。
[0028]3、试验结果
3.1、MTT比色法与细胞计数结果对比
在MTT试验之前，取部分菌液进行计数，同时与加MTT比色后计算的抑制率相比较，结果见图1。
[0029]由图1可以看到，由两个药物的MTT的结果基本与菌计数结果一致。抑制率高，菌数少，抑制率低菌数多。提示:MTT OD吸光值计算抑制率后与菌数成反比，MTT法具有一定的专属性，由于其具有简便，快速，适合大批量处理的特点，可以替代菌计数法。
[0030]3.2、MTT比色法与平板法结果对比
在加药培养结束，MTT试验之前，取101IL培养物接种血琼脂平板，同样条件下培养24小时，观察MTT试验结果与平板法菌培养结果的一致性。
[0031]试验结果见图2，由图2可见，MTT法结果与平板法结果一致。MTT法计算IC50为稀释25倍，平板法可见IC50大约在第4管和第5管之间(稀释16?32)ITT OD值高，计算抑制率低时，培养平板中菌落多;MTT OD值低，计算抑制率高时，培养平板中菌落少。MTT法具有一定的专属性，由于其结果客观，准确，可以定量，并且简便快速，可以替代平板法。
[0032]3.3、随行对照结果
试验时除了设置无药物菌液对照和无药物无菌空白对照以外，还设置两个评价方法重复性和专属性的随行对照，一个为扁咽口服液阳性对照，一个为按照药物浓度和水丸中矿物药的比例配置的矿物药阴性对照。
[0033]试验结果表明，经计算抑菌指数，阳性药平均为6，阴性对照为0.17。提示本法的重复性和专属性较好。
[0034]3.4、不同企业样品抑菌活性
经计算抑菌指数，A企业的样品较好(抑菌指数5.36)，B企业样品较差(抑菌指数3.17)。
[0035]试验结束揭盲后，此试验结果与样品中化学测定结果比较，两者结果基本一致，从指纹图谱和含量测定结果看，A企业样品中含量较高，B企业样品含量较低，此结果与抑菌结果相一致。提示:抑菌活性试验多参数评价方法能够反映药品的有效性，其抑菌活性与其中的成分含量相关，成分含量高的抑菌活性较好，成分含量低的抑菌活性较差。
[0036]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
【主权项】
1.一种清热解毒类药品抗菌生物活性测定多参数评价方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)、菌液制备: 用选择性琼脂平板分离所试菌，取纯菌接种MH肉汤，化脓性链球菌接种脑浸出物培养基，37°C培养24小时，该菌液作为原液，再用稀释液稀释至所需浓度备用，计数大约17?18个/mL; (2)、药液制备: 将供试品用生理盐水配制成0.25g/mL混悬液，对照组按照原处方去除主药后其余药物的用量及相同浓度药物，配制成混悬液，其中含芒硝0.962g/100mL，石膏1.923g/100mL，滑石粉5.769g/100mL，震荡混勾3min，3000rpm, 1min后，取上清用0.45μηι膜过滤，无菌分装备用;实验时，用MH肉汤做2倍稀释，最终菌液中药物浓度为0.125g/mL?0.004g/mL;同时设空白对照，阳性对照； (3)、正式试验: 各管加入培养液稀释的药液0.5mL，各管依次定量加入用培养液稀释好的试验菌液(105/mL-106/mL)，0.5mL，混匀，封口，37°C培养24小时，观察各管试验情况，并分别取出培养物定量(200仙)点种无菌平板内，加0.5% MTT 50μ?，37°(:培养4小时，加DMSO lOOyL吹打提取MTT，酶标492nm测定结果； (4)、结果计算与多参数统计: 根据酶标仪测定的MTT吸光度值，设同板菌液对照孔OD平均值为对照，其抑制率0%，计算不同浓度药物抑制率，抑制率=(对照OD-药物组OD)/对照OD，用IC50计算软件计算如下指标:1C50，IC95，量效关系R值为多参数评价指标； 定义:R 2 0.8为极相关，计分为2; 0.5<R<0.8为相关，计分为I; R <0.5为可疑，计分为O； 1〇50 2 0.1为可疑，计分为0;0.01〈 1〇50〈0.1为抑制，计分为1;1050<0.01为强抑制，计分为2 ； IC95 > 5为可疑，计分为O; 1< IC95〈5为抑制，计分为2 ；IC95< I为强抑制，计分为3; 统计每批药物对各菌的此三项计分和，将每个企业各批次计分和平均作为此企业样品抑菌指数。
【文档编号】C12Q1/18GK105861627SQ201610313675
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】董培智, 泰刚, 朴晋华, 郭景文, 张蕻
【申请人】山西省食品药品检验所