一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法，属于鹿制品检测鉴定技术领域。本发明提供了一种可用来检测和鉴定鹿源性物种成分的基因。同时，本发明还提供了利用该基因检测和鉴定鹿源性物种成分的方法。该方法是取待测样品的基因组DNA，通过PCR方法检测待检样品中是否含有鹿源性成份。对含有鹿源性成份的序列进行核苷酸测序，与已测定的核苷酸序列库进行比对，最终确定鹿源性产品来源于何种鹿。本发明所提供的方法具有操作简单快速、准确度高的特点，适合于鹿源性产品的来源检测及质量控制。
【专利说明】
-种鹿源性物种成分的检测鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法，属于鹿制品检测鉴定技术领 域。
【背景技术】
[0002] 鹿是人们熟知的一种珍贵野生动物，远在汉代，即有"鹿身百宝"之说，据《本草纲 目》记载，鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿脑、鹿尾、鹿肾、鹿筋、鹿脂、鹿肉、鹿骨、鹿鞭等都可入药。由于 鹿产品来源有限、价格昂贵，市场上鹿产品鱼龙混杂，许多非鹿源的产品，W假乱真;一些驯 鹿、马鹿等低价产品充当高价的梅花鹿产品。
[0003] 目前鹿产品的鉴定主要依靠传统方法，主要包括直观性状鉴定和理化鉴定。因此 很难准确判定鹿产品的真伪。比如一颗猪屯、的价格与鹿屯、相差几十倍，药效更是天壤之别， 但是几乎不能通过传统方法鉴定真伪。驯鹿、马鹿的鹿茸价格只有梅花鹿鹿茸的一半，切片 W后也不能通过传统方法鉴别，因此如何有效地鉴别鹿产品，既困扰着鹿产品加工企业，也 困扰着广大消费者。
[0004] 查代明等曾公开发表了一种利用PCR技术扩增梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿W 及驯鹿的各线粒体DNA的方法，对不同的鹿种设计了不同的引物，通过PCR扩增判定检测待 检样品中是否含有上述动物成分的方法，该方法主要依据线粒体DNA的不同进行判断。由于 引物是根据不同的鹿种的线粒体DNA设计，因此覆盖面较窄，仅限于报道的五种鹿。而且要 判定一个不明成份的产品，需要同时用到多对引物。周祥山等公开了一种胶类中药及其制 品中鹿源性成分的检测方法，主要是利用酶解方法分析胶原蛋白，仅能够用于鉴别梅花鹿 和马鹿成份。由于动物基因数量十分庞大，获取某种特定动物的特异性基因的工作难度较 大，目前尚未报道有针对鹿科动物的特异性基因。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中检测方法适用的使用范围小，不能区分不同鹿种的技术问题， 本发明提供了一种鹿源性成分的检测鉴定方法，所采取的技术方案如下：
[0006] 发明人在研究过程中偶然发现梅花鹿的化nog基因存在一个假基因化nog-ps，通 过大范围检测证明化nog-ps基因为鹿科动物中特异性存在的基因，可用来检测和鉴定鹿源 性物种成分。本发明的目的在于提供基因化nog-ps在鹿源性物种成分的检测和鉴定方法。 其中，基因 Nanog-ps的核巧酸序列沈Q ID N0.1所示，Gene bank ID为KR005602。
[0007] 本发明提供了一种利用Nanog-PS基因检测鹿源性物种成分的方法，该方法的步骤 如下：
[000引 1)根据Gene ba址ID KR005602所示的Nanog-ps基因核巧酸序列设计引物；
[0009] 2)提取待测样品中的DNA;
[0010] 3) W步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR 扩增产物；
[001 U 4)利用电泳检测鉴定步骤3)所得扩增产物。
[0012] 优选地，步骤1)所述引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[001引优选地，步骤3)所述PCR扩增，扩增条件为:扩增条件为:94°C，5min; 94°C，30S，57 °C，30S，72°C，25S，循环30次，72°C，5min。
[0014] 优选地，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增产物中是否同时含有 270bp和2140bp的条带。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种利用基因化nog-ps鉴别鹿源性物种成分的方法， 该方法的步骤如下：
[0016] 1)根据SEQ ID NO. 1所示序列设计引物；
[0017] 2)提取待测样品中的DNA;
[0018] 3) W步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR 扩增产物；
[0019] 4)利用电泳检测步骤3)所得扩增产物是否含有鹿源性成分；
[0020] 5)提取步骤4)中含有鹿源性成分的核巧酸序列，测序后与数据库进行比对确定基 因来源。
[0021] 优选地，步骤1)所述引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0022] 优选地，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增产物中是否同时含有 270bp和2140bp的条带。
[0023] 优选地，步骤5)所述提取步骤4)中含有鹿源性成分的核巧酸序列，是指对获得的 270bp条带进行基因测序。
[0024] 本发明获得的有益效果：
[0025] 本发明发明人偶然发现了一个仅在鹿科动物中存在的基因序列，依据该基因设计 了鹿科动物特异性扩增引物，通过PCR方法可W扩增鹿科动物的DNA呈两条带特征，从而快 速鉴别待测产品中鹿源性成份。通过基因测序判定鹿源性成份来源于何种鹿。
[0026] 本发明利用一对引物，一次PCR扩增，就可W直观地判定待测样品中是否含有鹿源 性成份。建立了多种鹿科动物的序列数据库，涵盖了鹿科动物的几大分支。通过与待测样品 序列比对，能够确定鹿源性成份属于何种鹿。本发明所提供的方法选择利用鹿科动物特异 性基因序列，检测鹿源性产品，简单明了地检测待检样品的鹿源性成份，可检测和鉴定多种 鹿源性成分，适用范围更广，可从源头上保证鹿产品的保健价值和药效;为鹿产业的可持续 性发展保驾护航。
【附图说明】
[0027] 图1为几种常见鹿科动物的基因序列。
[0028] 图2为PCR检测多种常见鹿科动物DNA结果。
[0029] 图3为市场购买的鹿屯、样品检测结果；
[0030] (其中，一、二、S、四和五分别为五种鹿屯、样品）。
[0031] 图4为某种鹿茸胶囊产品检测结果。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0033] W下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0034] 实施例1鹿科动物特异性基因的筛选
[0035] 1)大范围采集鹿科动物血液样品，包括梅花鹿、马鹿、水鹿、赤鹿、糜鹿、驯鹿、猜鹿 等常见鹿科动物，W及牛和羊的抗凝血1-2毫升。
[0036] 2)用血液DNA提取试剂盒，提取上述样品的基因组DNA，提取方法按照试剂盒说明 书操作，也可W使用自己配置的DNA提取液，均不影响实验结果。
[0037] 3) Wl微升样品的DNA为模板，用我们设计的特异性引物进行扩增，PCR程序设置如 下：
[00；3 引
[0039] 4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外光相机采集图像。经过对大量所得结果如 图2所示，所有检测的鹿科动物均有270bp和2140bp两条带，而非鹿科动物的牛和羊只有 2140bp-条带。驯鹿和猜鹿是鹿科动物最古老的分支，而牛和羊是鹿科动物亲缘关系最近 的非鹿科动物。因此27化P条带为鹿科动物所特有。
[0040] 实施例2多种鹿科动物核巧酸序列数据库的建立
[0041] 1)将实施例1中各种鹿科动物中扩增的27化P条带，通过电泳切胶回收，回收片段 重组到T载体中。
[0042] 2)重组T载体转化感受态大肠杆菌，转化后均匀涂抹到含氨节青霉素的LB固体培 养基中，倒置培养16小时。
[0043] 3)每一个鹿种挑选5个单克隆菌株，接种到LB液体培养基中，37°C摇床培养8小时， 从菌液中提取质粒进行基因测序。
[0044] 4)分析测序结果，排除测序造成的误差后，建立不同鹿科动物核巧酸序列数据库 (图1)。实施例3鹿屯、样品检测结果
[0045] 1)从不同的市场上购买的五份标明鹿屯、的产品进行检测。
[0046] 2)切一小块组织，研磨成粉，称取50微克，用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
[0047] 3) Wl微升样品的DNA为模板，用我们设计的特异性引物进行扩增，PCR程序设置同 实例1。
[004引4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外光相机采集图像。所得结果如图3所示，五 个样品中有4个出现两条带，可W判定为鹿源性产品。而只有一条带的产品为非鹿源性产 品。实施例4鹿源性产品所属鹿种的鉴定 [0049] 1)对实施例2中检测到的鹿源性产品进行基因测序。
[0050] 2)将琼脂糖凝胶中的鹿特性条带纯化回收。
[0051] 3) W回收的片段为模板，进行基因测序。
[0052] 4)测序所得的核巧酸序列与数据库中的序列进行比对，结果显示有两个样品来源 于梅花鹿，两个样品来源于赤鹿。
[0053] 实施例5某品牌全鹿茸粉胶囊的检测
[0054] (1)取胶囊内粉剂50微克，用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
[0055] (2) Wl微升样品的DNA为模板，用我们设计的特异性引物进行扩增，PCR程序设置 如下：
[0化6]
[0化7]
[0058] (3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外光相机采集图像。结果如图4所示，可W 判定该产品中含有鹿源性成份。
[0059] (4)对鹿科动物特有的小条带进行基因测序，与数据库中序列进行比对，结果发现 所测的序列中既有梅花鹿的序列又有驯鹿的序列，由此可W判断该产品是梅花鹿和驯鹿的 混合物。
[0060] 虽然本发明已W较佳的实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可W做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 基因 Nanog-ps在鉴定和检测鹿源性物种成分中的应用。2. 权利要求1所述应用，其特征在于，所述基因 Nanog-ps的Genebank ID为KR005602，核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -种利用基因 Nanog-ps检测鹿源性物种成分的方法，其特征在于，步骤如下： 1) 根据SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列设计引物； 2) 提取待测样品中的DNA; 3) 以步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增 产物； 4) 利用电泳检测鉴定步骤3)所得扩增产物。4. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤1)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和 SEQ ID NO .3所示。5. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述PCR扩增，扩增条件为:94°C，5min; 94 °C，30S，57°C，30S，72°C，25S，循环30次，72°C，5min。6. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增 产物中是否同时含有270bp和2140bp的条带。7. -种利用基因 Nanog-ps鉴别鹿源性物种成分的方法，其特征在于，步骤如下： 1) 根据SEQ ID NO. 1所示序列设计引物； 2) 提取待测样品中的DNA; 3) 以步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增 产物； 4) 利用电泳检测步骤3)所得扩增产物是否含有鹿源性成分； 5) 提取步骤4)中含有鹿源性成分的核苷酸序列，测序后与数据库进行比对确定基因来 源。8. 权利要求7所述方法，其特征在于，步骤1)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和 SEQ ID NO .3所示。9. 权利要求7所述方法，其特征在于，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增 产物中是否同时含有270bp和2140bp的条带。10. 权利要求7所述方法，其特征在于，步骤5)所述提取步骤4)中含有鹿源性成分的核 苷酸序列，是提取鹿科动物特有的270bp的条带进行基因测序。
【文档编号】C12Q1/68GK105861652SQ201610210717
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】王大涛, 赵海平, 李春义, 郭倩倩
【申请人】中国农业科学院特产研究所