‘中山杉405’的分子标记鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物遗传标记和品种分子鉴定的方法，具体公开了一组鉴定‘中山杉405’的SSR标记引物及其鉴别方法。使用该组引物进行PCR反应获取每对引物的扩增片段，根据所获片段与本发明所公开的基因组片段进行比较，可以准确鉴定该中山杉品种是否为‘中山杉405’。
【专利说明】'中山杉405 '的分子标巧鉴定方法 -、技术领域
[0001] 本发明设及一种植物遗传标记和品种分子鉴定的方法，具体地说是一种基于基因 组SSR分析的'中山杉405 '分子标记鉴定方法。 二、技术背景
[0002] 落羽杉属（Taxodium)为杉科（Taxodiaceae)半常绿或落叶乔木，包括落羽杉 (T.distichum)，墨西哥落羽杉（T.mucronatum)和池杉（T.ascendences)3个树种。落羽杉具 有较强的耐水湿能力和一定的抗赤枯病能力；墨西哥落羽杉具有较强的耐盐碱能力，并且 具有较长的绿叶期；池杉多生长于湖泊及沼泽地，具有较强的耐溃能力。中山杉（T. 'Zhongshanshan'）是落羽杉、墨西哥落羽杉、池杉3个树种种间、种内杂交得到的优良无性 系的总称。江苏省.中国科学院植物研究所于20世纪70年代初开始着力于落羽杉属种间杂 交优势利用研究，陆续育成了一批W国家级林木良种中山杉302(落羽杉墨西哥落羽杉）、中 山杉118(落羽杉墨西哥落羽杉）墨西哥落羽杉为代表的第1期、第2期中山杉优良无性系和 W中山杉405、中山杉406、中山杉407(墨西哥落羽杉落羽杉)等为代表的第3期优良无性系。 运些中山杉优良无性系具有墨西哥落羽杉较高的耐盐碱能力，较长的绿叶期，具有落羽杉 较强的耐水湿、抗病虫害能力，同时还具有生长快、干型直、材质好、抗强风、观赏价值高和 适应性广等优点，迄今为止，运些优良品种已经在江苏、浙江、重庆、云南等沿海和内陆省 (市)大规模扩繁和推广，运将为我国滩涂、湿地造林，城乡绿化等方面的建设产生巨大的生 态价值和经济价值。
[0003] '中山杉405 '是2004年杂交获得，2010年被国家林业局授与植物新品种权，该品种 与'中山杉406'、'中山杉407'、'中山杉502'等品种为全同胞家系的不同无性系，因此运些 品种的外部形态较为相似，导致开发商及其使用者难W准确辨别品种的真实性，给新品种 的进一步开发利用带来影响。因此，寻找一种快速有效，不受环境影响，能够准确区分不同 基因型的简单、有效的的鉴别技术显得十分重要。
[0004] 简单序列重复（simple sequence repeats, SSRs),又称为微卫星 DNA (microsatellite DNA)，是Wl-6个核巧酸为单位多次串联重复的DNA序列。SSRs具有重复 性好、特异性强、多态性丰富、共显性遗传、基因组覆盖率高等优点，可用于遗传图谱构建、 分子辅助育种、群体遗传结构分析及比较基因组学研究。2015年本单位首次将SSR分子标记 技术应用到落羽杉属植物的杂种真实性鉴定和基因分型分析中（化eng Y L，Yan巧，Wang Z Y，Qi BY,Yin Y L,Li H G.Development and characterization of EST-SSR markers in I'axodium'zhongshansa'.PlantMol Biol Rep，2015.D0I 10.1007/slll05-015-0875-9. 王紫阳，成彦丽，殷云龙，於朝广，李火根.中山杉EST-SSR引物通用性及基因分型检测.分子 植物育种，2015,13(7) :1631-1638.),研究表明该标记具有操作简便、重复性好、不受环境 影响、多态性和通用性较高、能够准确区分不同基因型等特点，可有效地应用于落羽杉属植 物的品种鉴定、群体遗传结构分析，指纹图谱及遗传图谱构建等领域。 H、
【发明内容】
[0005] 技术问题:本发明提供一种基于中山杉优良无性系'中山杉405'基因组的SSR分子 标记鉴定方法，它克服了根据形态鉴定的不确定性，该方法对'中山杉405'的鉴别更可靠、 准确、快速有效。
[0006] 技术方案：
[0007] 上述'中山杉405 '的分子标记鉴定方法，其特征在于：
[000引1、用改良的CTAB法(张博，张露，诸葛强，王明麻，黄敏仁.一种高效的树木总DNA提 取方法，南京林业大学学报：自然科学版，2004,28(1) :13-16.)提取'中山杉405'叶片基因 组 DNA。
[0009] 2、用SSR标记引物TA231的左端引物序列5 ' -GGTGTTGGAGGAAGGCAAGA-3 '和右端引 物序列5 ' -TAATGCCAGATGGTGCTGCA-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到16加 P 片段大小的单一谱带。
[0010] 用SSR标记引物TA236的左端引物序列5 ' -TCTTCTTCACCTACCCCCGT-3 '和右端引物 序列5 ' -ACCGCCAAAATATCACCCGT-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到22化P、 230bp的2个DNA片段。
[0011 ] 用SSR标记引物TA372的左端引物序列5 ' -TCGGCACTCCCATCCATTTC-3 '和右端引物 序列5 ' -AGCTTGCTATACCGCTCTGC-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到18化P片 段大小的单一谱带。
[001^ 同时用W上3对引物对某一中山杉的叶片DNA进行扩增，并且每对引物的扩增结果 与上述的扩增片段及其大小完全一致，则表明该中山杉品种为'中山杉405'。
[0013] 3、上述的对'中山杉405'叶片分离的DNA进行扩增及其产物的检测方法如下：
[0014] SSR-PCR采用 10化的反应体系，其中包括:MgCl23.75mmol/L，dNTP 0.4mmol/L，正 反向引物各0.25皿ol/L，TaqE 0.抓，DNA模板20ng，lxPCR buffer。
[0015] SSR-PCR 扩增程序为：94°C 预变性 3min;94°C 变性 3〇3,59°(：退火453,72°(：延伸453， 35个循环;最后72°C延伸7min，4°C保存。
[0016] 扩增反应在英国TECH肥公司的TC-412型PCR仪上进行。扩增产物通过8%的聚丙締 酷胺凝胶电泳进行检测，并通过银染技术进行染色。
[0017] 有益效果：
[0018] 1、本发明通过直接检测'中山杉405'的DNA序列对其进行鉴定，它克服了根据外部 形态鉴定的不确定性，该方法对'中山杉405'的鉴别更可靠、准确、快速有效。
[0019] 2、本发明为'中山杉405'新品种的专利保护提供了客观科学的技术保障。
[0020] 3、本发明为'中山杉405'在推广应用中的品种鉴定提供了有力的实验证据。 四、【附图说明】：
[0021] 图1: SSR标记引物TA231对'中山杉405 '的扩增图谱
[0022] 图2: SSR标记引物TA236对'中山杉405 '的扩增图谱
[0023] 图3: SSR标记引物TA372对'中山杉405 '的扩增图谱
[0024] 图4: SSR标记引物TA231对'中山杉405 '及其对照品种的扩增图谱
[0025] 图5: SSR标记引物TA236对'中山杉405 '及其对照品种的扩增图谱
[0026] 图6: SSR标记引物TA372对'中山杉405 '及其对照品种的扩增图谱
[0027] 在W上六幅图中，图谱上方为材料编号，其中'中山杉405'的编号为17，M为DNA Maker;图1-图3左侧、图4-图6右侧为DNA marker片段大小；图1、图2和图3右侧为'中山杉 405'扩增片段大小。 五、【具体实施方式】
[002引本发明中利用SSR分子标记技术鉴别'中山杉405'采取的步聚如下：
[0029] (一)DNA的提取及鉴定标记的获得
[0030] 用改良的CTAB法提取'中山杉405'叶片基因组DNA。
[0031] 用20对SSR引物对所提取的DNA进行PCR扩增，SSR-PCR采用10化的反应体系，其中 包括:MgC 123.75mmo 1 /L，dNTP 0.4mmo 1/L，正反向引物各0.25皿ol/LJaciEO.抓，DNA模板 20ng，1 xPCR buffer。SSR-PCR扩增程序为：94°C预变性3min; 94°C变性30s，59°C退火45s，72 。(:延伸453,35个循环;最后72°(：延伸7111111，4°(：保存。扩增反应在英国16邸肥公司的1'(：-412 型PCR仪上进行。扩增产物通过8%的聚丙締酷胺凝胶电泳进行检测，并通过银染技术进行 染色。
[0032] 20对SSR引物的扩增结果表明引物TA231、TA236和TA372对'中山杉405 '的扩增谱 带清晰，稳定，没有非特异性条带，该3对引物的序列及其扩增结果如下：
[0033] 用标记引物TA231的左端引物序列5 ' -GGTGTTGGAGGAAGGCAAGA-3 '和右端引物序列 5 ' -TAATGCCAGATGGTGCTGCA-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到16化P片段大 小的单一谱带。
[0034] 用标记引物TA236的左端引物序列5'-TCTTCTTCACCTACCCCCGT-3'和右端引物序列 5 ' -ACCGCCAAAATATCACCCGT-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到22化P、230bp 的2个DNA片段。
[0035] 用SSR标记引物TA372的左端引物序列5 ' -TCGGCACTCCCATCCATTTC-3 '和右端引物 序列5 ' -AGCTTGCTATACCGCTCTGC-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到18化P片 段大小的单一谱带。
[0036] (二)用所筛选的3对SSR标记鉴别'中山杉405'的验证实验
[0037] 应用上述3对引物，对'中山杉405 '及落羽杉属的3个种、本单位选育的3期中山杉 无性系共28个基因型同时进行扩增，扩增体系、扩增程序和产物检测方法都同上。SSR扩增 位点片段的读取，按从小到大的顺序依次用阿拉伯数字表示，纯合片段用相对应的两个相 同数字表示，杂合片段用相对应的两个不同数字表示，最后将多个扩增位点获得的数字按 一定顺序组合起来得到各无性系的多位点指纹，形成指纹图谱(表1)。扩增结果（图1-图6) 表明，引物TA231和引物TA236共同扩增，或者引物TA236和引物TA372共同扩增均可将'中山 杉405'与其它落羽杉属植物分开来，运表明本发明设计的3对SSR引物和方法可W用来进行 '中山杉405'的品种鉴定。
[003引从验证结果可W看出，本发明设计的3对SSR引物中，引物TA236和其它两对引物中 的任意一对共同扩增均可对'中山杉405'的品种真实性进行鉴定，但考虑到本发明验证实 验的对照品种有限，将来可能会有更多的中山杉新品种问世，为了保证鉴定的准确性，本发 明建议用W上3对引物同时对'中山杉405'进行鉴定，若3对引物的扩增带型与本发明公布 的带型完全一致，则说明该品种为'中山杉405 '。
[0039]表128份落羽杉属植物SSR指纹 LUU牛I」 巧：说K称化顺巧：抓
【主权项】
1. '中山杉405 '的分子标记鉴定方法，其特征在于： 用SSR标记引物TA231的左端引物序列5 ' -GGTGTTGGAGGAAGGCAAGA-3 '和右端引物序列 5 ' -TAATGCCAGATGGTGCTGCA-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到165bp片段大 小的单一谱带。 用SSR标记引物TA2 36的左端引物序列5 ' -TCTTCTTCACCTACCCCCGT-3 '和右端引物序列 5 ' -ACCGCCAAAATATCACCCGT-3 ' 对'中山杉405 ' 叶片分离的DNA进行扩增，得到225bp、230bp 的2个DNA片段。 用SSR标记引物TA372的左端引物序列5 ' -TCGGCACTCCCATCCATTTC-3 '和右端引物序列 5 ' -AGCTTGCTATACCGCTCTGC-3 '对'中山杉405 '叶片分离的DNA进行扩增，得到185bp片段大 小的单一谱带。2. 根据权利要求1所述的'中山杉405 '的分子标记鉴定方法，其特征在于： 同时用以上3对引物对某一中山杉的叶片DNA进行扩增，并且每对引物的扩增结果与权 利要求1所述的扩增片段及其大小完全一致，则表明该中山杉品种为'中山杉405'。
【文档编号】C12Q1/68GK105861662SQ201610234828
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】王紫阳, 殷云龙, 於朝广
【申请人】江苏省中国科学院植物研究所