检测奶牛β-酪蛋白基因SNP的引物组合物及其用图

检测奶牛β-酪蛋白基因SNP的引物组合物及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种用于确定奶牛β?酪蛋白基因多态性位点(SNP)的引物系统或组合物。基于该引物系统或组合物所制备的产品，可以通过检测奶牛β?酪蛋白基因多态性位点，筛选出具有编码蛋白质β?酪蛋白A2基因的奶牛，从而为专产更为优质健康的A2牛奶的奶牛群的筛选和相关利用提供了指导。
【专利说明】
检测奶牛e-酪蛋白基因SNP的引物组合物及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种用于确定奶牛是否具有0-酪蛋白A2蛋白基因 或者0-酪蛋白Al蛋白基因的检测方法，具体而言，即利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱 技术，对奶牛的e-酪蛋白基因进行检测，确定该奶牛是否具有e-酪蛋白A2蛋白基因或者0-酪蛋白Al蛋白基因，W及它们产生含0-酪蛋白Al或0-酪蛋白A2牛奶的能力，设及筛选专产 e-酪蛋白A2牛奶的奶牛的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 牛乳蛋白主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，酪蛋白中又分为0-酪蛋白（P-CN)、K-酪蛋白化-CN)和a-酪蛋白（a-CN)，其中，(6-酪蛋白约占蛋白质总量的30%，且广泛存在于各 种奶制品中，是氨基酸的重要来源，能参与矿物质转运，并且可被分解成相对分子质量更小 的生物活性肤，同时在体内传递重要的矿物质(如巧和憐等），促进其消化吸收。
[0003] 牛奶中的0-酪蛋白有两个主要的变异型，称为Al和A2,此外，尚有一些罕见的亚变 异型（如A3等）。其中，A2-0酪蛋白是现代奶牛0-酪蛋白的天然原型。最初，所有家养的牛只 含有A2型0-酪蛋白，后来因自然基因突变，出现了Al蛋白质的变体，即今天全球普遍存在的 Al型牛奶0-酪蛋白。Al型与A2型0-酪蛋白的区别在于第67位的氨基酸。Al型0-酪蛋白的第 67位为组氨酸，其前7个氨基酸残基可W被裂解产生e-酪啡肤-7(BCM-7)。而A2型的第67位 为脯氨酸，其无法裂解。
[0004] 现已发现，BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环，并通过阿片受体影响全身和细胞活 动。此外，BCM-7和其他0-酪蛋白衍生物为阿片受体的强效外源性激动剂一外啡肤，其中与y 受体的亲合力最大。因此，BCM-7可能影响多个器官/系统的活动，尤其消化系统和免疫细 胞。此外，BCM-7也可能与婴幼儿的各种疾病有关，如，I型糖尿病和呼吸功能障碍，消化功能 疾病，促使产生肛擾，免疫功能疾病，并影响中枢神经系统活动。
[0005] 牛奶与母乳的蛋白质成分差异颇大。如，母乳主要含乳清蛋白，酪蛋白：乳清蛋白 约为40:60(泌乳早期10:90,泌乳后期50:50)，而牛奶的酪蛋白：乳清蛋白则高达80:20。比 较而言，人乳中的e-酪蛋白与牛奶中的A2型0-酪蛋白结构更为相似，人0-酪蛋白同样不会 产生BCM-7,不会发生由BCM-7导致的负面影响。因此，基于与母乳更为接近、同样不产生 BCM-7的A2型0-酪蛋白制成的配方奶因其不含Al型0-酪蛋白，更有利于促进婴幼儿的生长 发育。筛选专产A2型0-酪蛋白的奶牛进行挤奶并用于生产只含A2型0-酪蛋白的高端优质配 方奶对于改善目前的国产奶粉品质具有重要作用。
[0006] 另外，乳业是一个国家发达程度和食品消费现代化水平的重要标志，其发展对优 化农业结构，促进畜牧业产业升级，增加农民收入，提高国民身体素质，都具有重要意义。当 前我国的乳业正处于从传统乳业向现代乳业转型的关键时期，未来乳业的发展将从注重数 量型向质量型升级。由于并不是所有的奶牛都能产出只含纯净A2型0-酪蛋白而不含Al型0-酪蛋白的牛奶，因此，A2型0-酪蛋白的奶源非常稀有。现今，西方的奶牛中只有约30%的奶 牛为纯正的A2奶牛，由其所产的牛奶只含100%纯净A2型0-酪蛋白。如果我国能掌握A20-酪 蛋白的奶源的鉴定技术，根据我国庞大的奶牛牲畜资源，从中筛选出纯产A2型奶的奶牛，从 而发展中国特色的A2奶制品加工产业，对于提升中国的乳业行业发展水平具有不可估量的 作用。
[0007]对此，中国发明专利申请03815808,发明名称"改变牛奶中脂肪酸组成的方法"公 开了一种通过检测畜群中各个奶牛的第67位脯氨酸的DNA来筛选含有在67位上带有组氨酸 的e-酪蛋白的牛奶的奶牛的方法。该方法包括:①提取DNA并测定牛奶的脂肪酸组成;②将 用于脂肪酸分析的样品进行气相色谱法进行分析，并将色谱图上的峰面积进行积分W定量 每个脂肪酸的水平，通过将每个峰的保留时间与已知标准相比较来确定每种脂肪酸的身 份;③使用广义线性模型比较基因型之间的差异。然而，该方法需要反复筛选色谱参数进行 比较，同时设及到建立模型及数学分析等过程，因此过程非常繁琐，耗时耗力，难W适应中 国大规模的种畜筛查。
[000引中国发明专利申请03817455.3,名称"动物基因分型方法"公开了确定牛是否编码 e-酪蛋白A2基因或者是编码0-酪蛋白Al基因的方法，采用的不同类型的测序方法，如，寡核 巧酸连接测定法，焦憐酸测序。实验结果显示，该方法所使用的测序方法能够较好地完成奶 牛基因分型情况。然而，该发明中所设及的位点AC61仍然只能适用传统的PCR测序法，在适 用于最新一代的检测技术时存在一定的误差。
[0009] 另外，W上技术一直独家保留在新西兰A2有限公司，同时要甄选出基因纯正的A2 奶牛确保生产出合格的A2牛奶，需要极高的技术和专业的质量检测系统。目前该公司实施 的技术壁垒和A2奶牛种质资源的封锁，势必又进一步导致了 A2型0-酪蛋白的珍稀性。我国 奶粉进口对新西兰依存度最高。2002~2011年，进口新西兰奶粉由7.04万t增加到36.71万 t，占奶粉进口量的比例由62.98%提高到80.79%。其中，进口全脂奶粉15.74万t，同比增长 384.4%，在我国市场占有率由2008年的70.5%提高到2009年的89.3%。进口脱脂奶粉4.65 万t，同比增长156.7%，市场占有率达到66.0%，由此可见新西兰在我国奶粉进口来源国中 形成绝对垄断地位。其中，A2公司是全球第一也是唯一一家掌握A2型0-酪蛋白的商业化牛 奶的商业化公司，垄断了我国高端婴幼儿奶粉市场。因此，"有恃无恐"地不断涨价。从2006 年7月至2010年2月，洋奶粉已经先后6次上调价格，其中单次最高涨幅超过20%。即使受欧 洲债务危机的影响，在欧盟地区的多个国家原料奶和"洋乳品"售价不断下跌的状况下，国 内市场洋乳品价格仍居高不下。近两年，"洋奶粉"涨价时间间隔缩短，平均每季提价1次，每 次涨价幅度为10%~15%。据有关资料显示，一罐SOOg的雀巢超级能恩1段婴儿奶粉国内售 价340元，而通过海外代购渠道，其价格仅为185元;德国特福芬有机婴幼儿奶粉2段在其官 网上价格为9.95欧元，约合81元人民币，仅仅为内地销售价格的1/4,而有的"洋奶粉"国内 售价约为生产国当地卖价的3倍。
[0010] 然而，自从加入WTOW后，我国乳制品关税趋于降低，非关税贸易壁垒进一步削减， 而乳制品进口主要来源地却不同程度地存在倾销和补贴。针对运种国际贸易中的不公平行 为，我国除了运用世贸组织规则允许的反补贴、反倾销和保障措施来维护本国乳业的利益， 大力提升我国奶制品产量及质量成为振兴和发展我国乳制品行业所刻不容缓的任务。为 此，发明人尝试与国内乳制品行业合作，通过建立A2奶牛饲养产业W及A2奶制品加工，为中 国乳制品行业的复兴探索新的道路。
[0011] 目前，对于e-酪蛋白的研究表明，e-酪蛋白（e-cN)的编码基因 CSN2全长8.化b，共 发现41、42、43、8、(：、0、6少、6、化、肥和112种基因型，其中41和42在奶牛中最常见。除了八2 公司研究的SNP位点之外(as2酪蛋白的外显子17-18位的AC61位点），8101位点（即A1/A2基 因型）也影响着e-酪蛋白基因的多态性。因此，对于该位点的研究分析，成为当前国内检测 A2奶牛的研究重点。
[0012] 检测牛乳蛋白多态性的方法主要分为蛋白和分子水平进行分析。在蛋白水平检测 方面，刘建新等人(高效液相色谱法分析中国荷斯坦奶牛乳蛋白多态性，《中国食品学报》第 12卷第10期，2012年)报道了通过反向高效液相色谱法分析中国荷斯坦奶牛乳蛋白多态性 的方法，并成功检测了牛乳中包括A1、A2、A3、B、C、D、E多种分型的(6-CN，从而为比较不同地 区奶牛的差异和牛乳的加工选择提供科学依据。
[0013] 在分子水平检测方面，马美蓉等人(荷斯坦奶牛乳蛋白基因多态性与泌乳性能的 关联分析，《遗传育种》第48卷第9期，2012年)报道了采用焦憐酸测序法分析荷斯坦奶牛的 酪蛋白复合基因的多态性，并通过数学模型分析基因多态性与奶牛泌乳性能的关联。虽然 该文献报道了K-CN B和P-CN Al基因是影响泌乳性能的主要基因，可作为改良奶牛产奶性 状的分子遗传标记。但该文献进一步建议焦憐酸测序技术能有效用于基因分型和进行标记 辅助育种。
[0014] 在W上研究的基础上，刘建新等人(焦憐酸测序法分析中国荷斯坦牛、娟姗牛及水 牛的乳蛋白基因多态性，《食品安全质量检测学报》第5卷第10期，2014年10月）全面回顾了 在分子水平上对乳蛋白多态性的检测方法，包括采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-R化P)，聚合酶链反应单链构象多态(PCR-SSCP)及焦憐酸测序(Pyrosequencing)和微 卫星等高通量测序技术。其中，重点介绍了使用焦憐酸测序法对包括8101位点在内的7个位 点进行分析，并结合液相色谱技术分析各种基因型频率。最终结果表明荷斯坦牛和娟姗牛 在乳蛋白多态位点上存在多种等位基因，具有多种基因型，但并没有明确指出CSN2的8101 位点是最适宜的检测位点。
[0015] 综上所述，如何筛选和建立A2奶牛种畜资源成为当前的首要任务。目前国内尚无 有关检测编码A20-酪蛋白基因方法及研究，并且现有国际上相关检测技术仍然停留在传统 PCR相关测序技术。因此，考虑到我国乳业产业的转型和升级，如果需要推进A2奶业的发展， 必须首先根据中国国情需要建立检测奶牛中e-酪蛋白的方法，同时筛选出只编码A2型0-酪 蛋白而不编码Al型0-酪蛋白的奶牛，继而可W利用只编码A2型0-酪蛋白奶牛产的牛奶生产 纯的A2型0-酪蛋白型的奶粉或鲜奶。

【发明内容】

[0016] 本发明的原理在于：提供了一种联合PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术， 检测奶牛是否具有e-酪蛋白A2蛋白基因或者0-酪蛋白Al蛋白基因的检测方案。其中，使用 针对e-酪蛋白基因的引物进行PCR扩增;然后对经过纯化的PCR产物进行单碱基延伸，特异 性的延伸引物延伸一个核巧酸，所延伸的核巧酸类型与e-酪蛋白的Al蛋白或A2蛋白基因型 对应相关；W质谱技术对单碱基延伸产生的由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物进行 检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的延伸引物和延伸产物 的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定e-酪蛋白的 基因型。
[0017]因此，本发明的第一个目的是提供一种用于核酸质谱检测奶牛是否具有(6-酪蛋白 A2/A1基因的引物组，其序列如下表所示。
[001 引
[0024] 在一个实施方案中，上述引物组仅包括沈Q ID No:21-23或沈Q ID No:24-26的组 合。
[0025] 在另一个实施方案中，上述PCR扩增引物序列为核屯、序列，其在5'端可包括保护碱 基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5 '端加入IObp的 化g (ACGTTGGATG)，例女日，在PCR 引物沈Q ID No: 21 的 5 ' 端加入 1 Obp的 tag (ACGTTGGATG)后即 为：
[00%] 5'-ACGTTGGATGTAAAATCCACCCCTTTGCCC-3'。在另一个具体实施方案中，延伸引物 的5'端也可W增加作为接头的碱基序列。
[0027] 本发明第二个目的是提供了由上述引物组所制备的用于确定奶牛中是否存在0-酪蛋白A2/A1基因的核酸质谱检测产品。
[0028] 在一个实施方案中，该检测产品为检测试剂盒，包括：
[0029] (1)用于PCR的反应试剂，包括:上述特异性PCR引物，耐高溫的DNA聚合酶，dNTPs， PCR反应缓冲液；
[0030] (2)用于PCR产物纯化的试剂；
[0031] (3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：上述延伸引物，耐高溫的单碱基延伸酶， ddNTPs，延伸反应缓冲液。
[0032] 在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树 月旨，点样及质谱检测用祀片，外切酶等试剂。
[0033] 在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂:碱性憐酸酶，或碱性憐酸酶 和外切酶ExoI,或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中，当包括碱性憐酸酶和外切酶 Exo I的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
[0034] 本发明第S个目的是利用上述引物组、检测产品或试剂盒，用于鉴定奶牛0-酪蛋 白A2/A1基因的方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0035] (I)PCR反应:使用上述特异性的针对包含所选择SNP位点片段的PCR扩增引物，在 一个反应体系内，得到含扩增目标区域的PCR产物；
[0036] (2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，W减少对后续反应的干扰；
[0037] (3)单碱基延伸:使用上述所选择SNP位点的特异延伸引物，在一个反应体系中，对 步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行单碱基延伸；
[0038] (4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，W获得高纯的延伸产物， 避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
[0039] (5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的祀片上，放入质谱仪 进行检测，得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图；
[0040] (6)将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图，经过质谱仪配套软件分析后，确 认SNP位点的碱基，从而判定该样本的基因型。
[0041 ]其中，用于鉴定奶牛e-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为:CSN2(8101): [C/A]，C 碱基代表A2型，A碱基代表Al型;和/或
[0042] AC61: [G/A]，A碱基代表A2型，G碱基代表Al型。
[0043] 在一个实施方案中，用于鉴定奶牛0-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2 (8101): [C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表Al型。
[0044] 在一个实施方案中，步骤(2)的纯化过程可W选择碱性憐酸酶消化、碱性憐酸酶和 外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性憐酸酶 消化、或碱性憐酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高溫酶灭活处理。
[0045] 本发明第四个目的是提供了一种生产0-酪蛋白A2牛奶的方法，步骤包括：
[0046] (1)根据前述检测产品或鉴定方法，确定奶牛的0-酪蛋白A2/A1基因分型；
[0047] (2)选择只具有编码0-酪蛋白A2基因的奶牛；
[0048] (3)对筛选的奶牛进行挤奶。
[0049] 在一个实施方案中，步骤（1)可W是针对奶牛胚胎、幼体或成体。在一个具体实施 方案中，步骤(3)的挤奶之前还包括对奶牛进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种群 的步骤。
[0050] 在另一实施方案中，包括步骤(4)的对奶进行加工制成奶制品。
[0051] 在上述所有实施方案中，所述奶牛优选为中国荷斯坦奶牛。
[0052] 在上述所有实施方案中，所述奶牛的DM可W从含有有核细胞的任何组织中得到， 该组织优选为该奶牛的血液、精液、毛发或奶。
[0053] 技术效果
[0054] 1.敏感:本发明综合了 PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技 术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本。因此，运种多技术结合的方法远远优于 单独使用PCR检测SNP，该方法具有相当高的检测灵敏度。
[0055] 2.特异:单碱基延伸又称为"微测序"，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有 测序技术的准确性高、特异性高、假阳性低等特点;特别的，不同于测序技术延伸数百个碱 基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低。
[0056] 3.简便安全:操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
[0057] 4.快速:速度快、通量高，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。
[0058] 5.检测结果准确且稳定，抗干扰能力强:本发明是使用质谱图谱进行奶牛0-酪蛋 白基因型的鉴定，质谱技术具有极强的分辨率和灵敏度，最高分辨率达到9Da，且通过计算 机程序判读，人为干扰因素低。相反，传统PCR扩增后凝胶电泳检测，其各自扩增成分的电泳 凝胶条带如果区分度过低，将导致结果难W分辨。
[0059] 6.本发明首次突破了国外技术封锁，填补了国内A2奶产业的检测空白，对于我国 乳业产业的转型和升级具有重要的促进和支撑作用。
[0060] 原理与定义
[0061] 本发明提供了一种联合PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测奶牛是否具有0-酪蛋白A2蛋白基因或者0-酪蛋白Al蛋白基因的检测方案。其原理在于：使用特异性PCR引 物，对待测模板进行扩增，得到含待检SNP位点的PCR产物;PCR产物经过纯化处理后，进行单 碱基延伸，在延伸引物后延伸一个核巧酸，该核巧酸与模板互补配对(如，模板为核巧酸A， 将在对应的延伸引物上延伸T);在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一 个碱基后，延伸引物将终止延伸;在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在脱盐纯化后，点至 含基质的祀片上，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管 的时间与其分子量呈负相关，即分子量越大，飞行时间越慢，到达检测器的时间越晚。
[0062] 术语"PCR扩增"，指在引物和聚合酶的作用下，对于特定的目的片段进行扩增反 应，W便进行相应的检测，例如酶切鉴定、测序鉴定等。在本发明中，由于需要考虑到质谱检 巧化勺区分度和检测窗口等限制条件，因此，扩增长度不同于普通PCR扩增检测过程，本发明 中用于质谱检测的扩增产物长度一般在l〇〇-2(K)bp左右。而通常运种扩增产物长度，是难W 直接进行酶切鉴定或测序鉴定的。由此可见，本发明的PCR扩增是与常规检测所设及的PCR 扩增是不完全相同的。
[006；3]术语"保护碱基"，指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。保护碱基的序列使得PCR 引物的分子量增大，可W避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，W避免干扰检测效 果。此外，延伸引物的5'端也可W适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱 基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口 内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近 时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产 物的分子量之间拉大差距，W避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而 提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上 述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。
[0064] 术语"碱性憐酸酶消化"，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使 dNTP的5 ' -P末端转换成5 ' -OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一 步单碱基延伸的影响。
[0065] 术语"外切酶Exo I消化"，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA 的dNTP之间的3，5-憐酸二醋键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR 反应后剩余的PCR引物。由于外切酶可W将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现， 因此在使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
[0066] 术语"单碱基延伸"，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引 物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3 '连接形成延伸产物，即引物延伸了一个碱基。ddNTP与普 通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少了一个径基，不能与后续的ddNTP形成憐酸二醋 键，因而，延伸引物仅可连接一个ddNTP，故而称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非 常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只 有连接ddNTP后方可终止延伸，因此，测序产生的是长短不一的核巧酸片段的混合物；单碱 基延伸体系中只加入ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸。因此，单碱基延伸 反应产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核巧酸片段。
[0067] 术语"ddNTP"是一种特殊的核巧酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量 差异，如，(1(1机？、(1(141?、(1(161?和(1(1刊？的分子量分别是247.2〇3、271.2〇3、287.20曰和 327. IDa,其中，ddTTP为修饰后的分子量。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的 核巧酸时，将形成分子量差异。可W通过质谱检测，分辨出运种差异（质谱检测核酸的最小 灵敏度约为9Da)。例如，某SNP位点若为G/A多态，对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量 为6153化），当该SNP位点是G基因型时，延伸引物将延伸一个C核巧酸并终止延伸，形成23个 碱基长、分子量为6400.2化的延伸产物；当该SNP位点处为A基因型，延伸引物将延伸一个T 核巧酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量为6480.1 Da的延伸产物，两种产物间存在 80.1 Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，使用此6153Da的延伸引物，G基因型将对应 6400.2化的质谱峰，A基因型将对应6480.1化的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过 软件对6153化、6400.2Da、6480.1化S处进行观察:若6153化处出现质谱峰，则表明有部分 或全部延伸引物未与ddNTP结合;不论6153化处是否有质谱峰，若6400.2化与6480.1化处仅 出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，其基因型与质谱峰的位置对应。如前所 述，6400.2Da的质谱峰对应G基因型，6480.1 Da的质谱峰对应A基因型；若6400.2Da与 6480.1化两处均出现质谱峰，则该SNP位点的基因型为杂合型;若6400.2化与6480.1化两处 均未出现质谱峰，则实验失败。
[0068] 术语"纯化"，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本 发明的PCR产物纯化有两种方式:一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯 化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离介质，并回收相对较纯的PCR产物，属于第一种 纯化方式，该方式一般耗时较长、操作复杂，尤其是样本量大时，更难W提高批量处理能力； 碱性憐酸酶的作用是降解(亦称消化)dNTP,使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶 的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，属于第二种纯化方式。应当指出 的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性憐酸酶混合使用时，其作用是预先将单 链DNA(在反应完成的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性憐酸酶 令dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化 步骤中增加外切酶ExoI处理，则无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步 骤之前，由于外切酶和碱性憐酸酶都通过高溫灭活，其不降解在单碱基延伸步骤中加入的 单链的延伸引物、ddNTP等，因此对后续实验不会产生影响。
[0069] 术语"检测窗口 "，指可用于质谱检测核巧酸分子量的范围，通常设及引物的设计 参考范围。为避免不同延伸引物与产物间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对 较宽的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多种物质的同时检测。
[0070] 术语"SNP"基因型，表示物种基因组中单核巧酸多态性的类型。其中，在实际检查 中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对于物种的基因组中，也可来自克隆入质粒 的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定、易得而受到实际使用者的欢迎。
[0071] 术语"检测产品"，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括:检测试剂、检 测忍片(如基因忍片、液体忍片等）、检测载体，W及检测试剂盒等。
[0072] 术语乂SN2(810ir，指位于CSN2基因（0-酪蛋白基因）第8101位的一个SNP，该SNP 位于6号染色体，其67位氨基酸发生变异，导致CSN2基因型的差异。CSN2基因的NCBI登陆号 为281099。
[0073] 术语"A2(AC6ir，指位于as2酪蛋白（CSN1S2基因）的外显子17-18上的一个SNP，其 同样位于6号染色体上(参见中国专利申请03817455.3)。该基因的NCBI登陆号为282209。
[0074] 应当指出的是，鉴于W上核酸质谱的特殊性，例如，其需先通过PCR反应扩增出含 SNP位点的片段，然后通过延伸引物延伸出SNP位点的碱基;各SNP的PCR反应、延伸反应间无 明显干扰;各SNP的延伸引物、产物间分子量要有足够大的差异W便实现区分等，因此，并非 所有的已知SNP均可W用来进行核酸质谱的检测，也并不是所有针对SNP位点设计的引物均 可用W进行多重PCR反应和多重单碱基延伸反应。例如，Cl如dia M.B等人(Optimization of a multiplex minisequencing protocol for population studies and medical genetics,Genet.Mol.Res 4(2005)115-125)指出，在进行多重PCR反应前需首先对单重PCR 的反应效果进行验证，如果单重PCR扩增效率低则需要放弃；另外，若PCR产物长度偏长，多 重PCR效果会比较差，也需要放弃。Nissum M等人巧igh-throughput genetic screening using m曰trix-曰ssisted laser desorption/ioniz曰tion m曰ss spectrometry,Psychiatr Genets 12(2002)109-117)也报道了通过MLDI-TOF MS高通量检测SNP的过程中，发现只能 获得90 %的准确率，其中，在标准实验条件下，竟然有5 %的情况不能实施PCR扩增过程，而 在单碱基延伸过程中，由于自身引物自身配对、引物二聚体的形成W及扩增产物量过低等 因素，也导致有5 %的情况难W实现单碱基延伸过程。因此，必须进一步优化核酸质谱实验 条件(如扩增引物、实验参数等），否则将影响MALDI-TOF MS在核酸质谱检测SNP中的应用。 例如，本发明在针对AC61位点进行核酸质谱检测中，发现实际生产中的准确率仅为75%，运 与利用传统PCR测序技术通过检测该位点从而获得A2奶牛分型准确率97%形成强烈对比。 因此，对于已知的AC61位点，在本发明的核酸质谱检测过程中，仅仅作为辅助分型的用途。
[0075] 此外，在核酸质谱检测过程中，多重扩增过程的干扰作用，对于最终获得的延伸产 物也存在景多B向。Sascha Sauer等人（Typin邑 of sin邑Ie nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry: Principles and diagnostic applications,Clinica 畑imica Acta 363(2006)95-105)和Heyi Yang等人（Multiplex single-nucleotide polymorphism genotyping by m曰trix-曰ssisted laser desorption/ioniz曰tion time-of-flight mass spechometiT,Analytical Biochemistry 314(2003)54-62)在利用 MALDI质谱技术研究核酸质谱检测过程中提出，所设计的多重引物应具有相近的烙解溫度 (Tm值）并彼此间的相互作用力较弱。如果引物之间的相互作用力过于强烈（AG的最小值 为-lOkcal/mol)，那么必须放弃该理论设计的引物而重新进行设计；当同一反应体系中存 在多重反应引物，那么多重扩增的规模主要受限于引物之间的相互作用程度，从而影响核 酸质谱检测过程;此外，为了准确区分不同碱基之间的差异，特别是腺嚷岭(A)和胸腺喀晚 (T) (4种碱基中运二者分子量之间差值最小，为9Da)，要求的寡核巧酸长度一般不超过40个 碱基，实际应用中，质谱检测窗口的分子量范围一般为4000~9000化，即要求所设及的延伸 引物和产物的分子量尽量分布在4000~9000Da范围之内。同时，要避免各延伸引物及其延 伸产物之间的叠合。由此可见，并非所有已知的SNP均可应用于核酸质谱尤其是多重核酸质 谱的检测，其实际效果会受到多种实验因素的影响，因此，需要通过实验来验证SNP检测的 可行性W及筛选不同的引物组合。
【附图说明】
[0076] 图1为实施例四中，对样本Nl的检测结果，显示为A纯合(Al型）。
[0077] 图2为实施例四中，对样本N2的检测结果，显示为CA杂合(A1/A2型）。
[0078] 图3为实施例四中，对样本N3的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0079] 图4为实施例四中，对样本M的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0080] 图5为实施例四中，对样本N5的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0081] 图6为实施例四中，对样本N6的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0082] 图7为实施例四中，对样本N7的检测结果，显示为A纯合(Al型）。
[0083] 图8为实施例四中，对样本N8的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0084] 图9为实施例四中，对样本N9的检测结果，显示为CA杂合(A1/A2型）。
[0085] 图10为实施例四中，对样本NlO的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0086] 图11为实施例四中，对样本Nl 1的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0087] 图12为实施例四中，对样本N12的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0088] 图13为实施例四中，对样本N13的检测结果，显示为CA杂合(A1/A2型）。
[0089] 图14为实施例四中，对样本N14的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0090] 图15为实施例四中，对样本N15的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0091] 图16为实施例四中，对样本N16的检测结果，显示为C纯合(A2型）。
[0092] 图17为Al型0-酪蛋白奶牛的质粒的检测结果，从左至右S条虚线分别是延伸引 物、A2型（C)延伸产物、Al型(A)延伸产物的理论峰值，A位置出峰，代表该质粒为A纯合(Al 型)。
[0093] 图18为对A2型0-酪蛋白奶牛的质粒的检测结果，从左至右S条虚线分别是延伸引 物、A2型（C)延伸产物、Al型(A)延伸产物的理论峰值，C位置出峰，代表该质粒为C纯合(A2 型)。
[0094]图19为对照实施例一中，对样本NI的测序结果，显示为A纯合(Al型）。
[00M] 图20为对照实施例一中，对样本N2的测序结果，显示为CA杂合(A1/A2型）。
[0096] 图21为对照实施例一中，对样本N3的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0097] 图22为对照实施例一中，对样本M的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[009引图23为对照实施例一中，对样本N5的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0099] 图24为对照实施例一中，对样本N6的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0100] 图25为对照实施例一中，对样本N7的测序结果，显示为A纯合(Al型）。
[0101] 图26为对照实施例一中，对样本N8的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0102] 图27为对照实施例一中，对样本N9的测序结果，显示为CA杂合(A1/A2型）。
[0103] 图28为对照实施例一中，对样本NlO的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0104] 图29为对照实施例一中，对样本Nll的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0105] 图30为对照实施例一中，对样本N12的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0106] 图31为对照实施例一中，对样本N13的测序结果，显示为CA杂合(A1/A2型）。
[0107] 图32为对照实施例一中，对样本N14的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0108] 图33为对照实施例一中，对样本N15的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0109] 图34为对照实施例一中，对样本N16的测序结果，显示为C纯合(A2型）。
[0110] 图35为对照实施例二中，CKl对照组的质谱检测结果，其中A2(AC61)位点残余的延 伸引物（第二条虚线）与CSN2(8101)位点C碱基的延伸产物（第S条虚线）叠加，将会干扰 8101位点延伸产物的判定情况。
[0111] 图36为对照实施例二中，CK2对照组的PCR产物电泳结果(泳道1为表1中引物PCR产 物电泳结果、泳道2为CK2引物PCR结果），与表1引物相比，CK2的引物二聚体较为严重，目的 条带模糊，扩增效率低。
[0112] 图37为对照实施例S中，对样本N5的质谱检测结果，从左至右六条虚线分别是 CSN2(8101)位点的延伸引物、CSN2(8101)的A2型（C)延伸产物、CSN2(8101)的Al型(A)延伸 产物、A2(AC61)位点的延伸引物、A2(AC61)的Al型(G)延伸产物、A2(AC61)的A2型(A)延伸产 物的理论峰值;其中，CSN2 (8101)的A位置出峰，显示为Al型，A2 (AC61)的A位置出峰，显示为 A2型，二者判定结果不匹配。
[011引图38为对照实施例立中，对样本Nl 1的质谱检测结果，CSN2(8101)的A位置出峰，显 示为Al型，A2(AC61)的GA位置出峰，显示为A1/A2型，二者判定结果不匹配。
[0114] 图39为对照实施例S中，对样本N19的质谱检测结果，CSN2 (8101)的CA位置出峰， 显示为A1/A2型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果不匹配。
[0115] 图40为对照实施例S中，对样本N20的质谱检测结果，CSN2 (8101)的CA位置出峰， 显示为A1/A2型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果不匹配。
[0116] 图41为对照实施例S中，对样本N21的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰， 显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为Al型，二者判定结果不匹配。
[0117] 图42为对照实施例S中，对样本N26的质谱检测结果，CSN2(8101)的C位置出峰，显 示为A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为Al型，二者判定结果不匹配。
[0118] 图43为对照实施例S中，对样本N29的质谱检测结果，CSN2 (8101)的CA位置出峰， 显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为Al型，二者判定结果不匹配。
[0119] 图44为对照实施例S中，对样本N32的质谱检测结果，CSN2(8101)的A位置出峰，显 示为Al型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果不匹配。
[0120] 图45为对照实施例S中，对样本N35的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰， 显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为Al型，二者判定结果不匹配。
[0121] 图46为对照实施例S中，对样本N36的质谱检测结果，CSN2(8101)的C位置出峰，显 示为A2型，A2(AC61)的GA位置出峰，显示为A1/A2型，二者判定结果不匹配。
[0122] 图47为对照实施例S中，对样本M3的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰， 显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为Al型，二者判定结果不匹配。
[0123] 图48为对照实施例S中，对样本M5的质谱检测结果，CSN2 (8101)的C位置出峰，显 示为A2型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果一致(A2型）。
【具体实施方式】
[0124] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0125] 实施例一：引物设计及合成
[0126] 针对奶牛0-酪蛋白A2/A1蛋白基因的SNP位点（CSN2 (8101))，设计特异性PCR引物 核屯、序列和特异性延伸引物核屯、序列，如下表所示： 「A4 〇-7l
[0130] 其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5' 端可W在核屯、序列（SEQ ID No:21-22)的基础上增加一定数目的碱基，常见如IObp的tag (ACGTTGGATG)，W使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。
[0131] 相关引物均由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。
[0132] 实施例二:样本DNA提取
[0133] 采用商业化的核酸提取试剂盒(如QIAGEN公司的DNeasy Blood and Tissue kit) 进行提取，提取后的基因组DNA，在2-8°C保存不应超过一周，-20°C保存不应超过两年，-80 °C可长期保存，应避免反复冻融，并置于冰盒中进行运输。
[0134] ( - )关于样本为奶牛精液，其DNA提取步骤如下：
[0135] (1)洁净1.5mL离屯、管中加入1支冻精，用消毒小剪剪去一端，然后再剪另一端，加 入50化L生理盐水，满旋混匀，12,00化pm离屯、Imin，去上清；
[0136] (2)重复步骤 1,12,000巧 m 离屯、2min;
[0137] (3)向管中加入40化L含DlT的牛冻精裂解液，再加入10化L 20 %的SDS，满旋混匀， 使底部沉淀完全溶解，加入IOiiL蛋白酶K后颠倒混匀；
[0138] (4)将混合样品放置在56°C分子杂交炉中消化20-2化；
[0139] (5)向消化好的样品中加入30化L饱和食盐水，颠倒2-3min，4°C放置IOmin;
[0140] (6)41：，12,000旨离屯、10111111，将上清转移到新的21111^离屯、管中；
[0141 ] (7)加入ImL预冷的无水乙醇，颠倒l-2min，12,000巧m离屯、2min，去上清；
[0142] (8)向离屯、管中加入50化L 75%的乙醇，颠倒混匀，12,00化pm离屯、2min，去上清；
[0143] (9)重复步骤7，开盖放置5min，挥发乙醇；
[0144] (10)向离屯、管中加入适量的P册.Odd肥0，溶解沉淀；
[0145] (11)浓度测定及电泳检测，-20°C保存。
[0146] (二)关于样本为奶牛血液，其DNA提取步骤如下：
[0147] (1)取全血200化放入洁净1.5mL离屯、管中，加入500化Lysis Buffer 1，10化蛋白 酶K，充分混匀(满旋），于56°C放置30min(期间颠倒混匀3-4次）；
[014引（2)离屯、，吸上清到新管；
[0149] (3)于上清中加入85化L Binding Buffer 2和15化L磁珠（磁珠使用前要充分悬 浮），充分混匀(轻微满旋），室溫放置5min;
[0150] (4)将离屯、管置于磁力架上Imin，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体；
[0151] (5)在离屯、管中加入20化L Wash Buffer 3,颠倒混匀数次（也可轻微满旋），将磁 珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管内液体；
[0152] (6)在离屯、管中加入20化L Wash Buffer 4,颠倒混匀数次（也可轻微满旋），将磁 珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管内液体；
[0153] (7)在离屯、管中加入20化L Wash Buffer 5,颠倒混匀数次（也可轻微满旋），将磁 珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管内液体；
[0154] (8)在离屯、管中加入20化L Wash Buffer 6,颠倒混匀数次（也可轻微满旋），将磁 珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管内液体；
[01W] (9)将留有磁珠的离屯、管开盖、于56°C放置lOmin，充分干燥(注:在加入洗脱液之 前，磁珠必须充分干燥）；
[0156] (10)加入70化Elution Buffer 7(可根据实验要求决定洗脱体积），使用移液器 吹打，使磁珠重新悬浮，室溫放置IOmin;
[0157] (11)将离屯、管置于磁力架上Imin,使磁珠吸附，将DNA转移至新的1.5mL离屯、管中， 经过浓度测定及电泳检测后，-20°C保存备用。
[015引（S)样本为DNA，则经质检合格后，-20°C保存备用。
[0159] 实施例S:生物学实验
[0160] 在本实施例中，用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分见表3:
'[0162]~使用ABI 9700型PCR仪分别进行单重
或多重核酸质谱检验I。操作按照说明书进行，I 具体方法如下：
[0163] 1. PCR 扩增
[0164] 1.1在PCR配液区，按照待检样品数准备20化L PCR反应管，并在管上标记样本编 号；
[0165] 1.2从试剂盒中取出PCR混合物、PCR酶，使其自然解冻，满旋振荡使其充分混匀，瞬 时离屯、至管底；
[0166] 1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR混合液和PCR酶，置于一个离屯、管中混 匀，按每PCR反应管加入16化混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可 能造成不足W分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如，有10份待测样品 时，可按10.5至11份样品配制混合物。 「01671
[01側 1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入化L待测样品，使每份PCR反应体系总体积 为20化。其中，阴性对照为超纯水，空白对照为不加模板。
[0169] 1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。
[0170]
[0171] 2. SAP 酶消化
[0172] PCR反应结束后，依次取化L PCR产物至新管，每管加入SAP酶混合物1化，然后将 PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。
[0174] 3.单碱基延伸
[0175] 3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混 合物，置于一个离屯、管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足W分 装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份PCR产物时，可按10.5至11 份样品配制混合物。
[0176]
[0177] 3.2在PCR扩增区，按每管PCR产物加入化L延伸混合物进行分装。
[0178] 3.3将PCR反应管晉于PCR扩增仪中，按下表的括序进行延伸反应。
[0179]
[0180] 4.纯化
[0181] 在PCR扩增区向每管延伸产物中加入16化纯水，6mg树脂，颠倒混匀30min。
[0182] 5.点样
[0183] 使用微量移液器，吸取化L纯化产物，点样至含基质祀片。
[0184] 实施例四：上机检测及结果判读
[0185] 使用毅新兴业(北京)科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后 的祀片进行检测和结果判断。
[0186] 另外，分别设置奶牛0-酪蛋白基因 CSN2(8101)位点的Al型、A2型质粒对照，该质粒 来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的对照质粒Al、A2为在商品化质粒 pMDlS-T Vector(化kara公司）的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，用引物和奶牛 DNA进行PCR后，将PCR产物插入pMD 18-T Vector，再分别定点突变，即CSN2(8101)位点的碱 基分别为A、C，即构建对照质粒Al和A2。所述质粒可长期保存于-20°C甘油中，用时活化并提 取质粒DNA。
[0187] 如前述表2所示，CSN2(8101)位点编号为SEQ ID No: 23的延伸引物及其在2个基因 多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，运些分子量对应各自的质 谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质（延伸引物或产 物)。
[018引判断标准：
[0189] (1)若Al型和A2型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在， 均判断为实验失败；
[0190] (2)若Al型和A2型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因 型的纯合型；
[0191] (3)若Al型和A2型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。
[0192] 质谱结果如图1-18所示，其中，图1-16为N1-N16样本的质谱图，图17为Al型质粒的 质谱图，图18为A2型质粒的质谱图。根据前述表2中编号为SEQ ID No:23的延伸引物及延伸 产物的分子量检查样本N1-N16的质谱结果（图1-16)，确定SNP位点的基因型，结果如表4所 示：
[0193]
[0194]
[01巧]对照实施例一:PCR测序检测
[0196] 一.根据实施例一，另行设计并使用如下引物，对0-酪蛋白基因 CSN2(8101)位点进 行扩增和测序： 「ni〇7l

[019引二.样本来源
[0199] 为使不同实验之间产生的数据具有可比性，测序验证采用与实施例二中用于质谱 检测一致的样本，即编号Nl至N16的样本。
[0200] 立.测序鉴定
[0201] 1.PCR反应体系为25L，具体配方如下所示：
[0202]
[0203]
[0204] 2.反应条件
[02化]使用ABI公司9700PCR热循环仪进行PCR反应。
[0206] 反应程序为:95°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s，共35个 循环，最后72°C延伸10min，15°C保存。
[0207] 3. PCR产物纯化和测序
[0208] 用试剂盒(OMEGA D2500-01)回收PCR扩增目的条带，定量后进行测序。
[0209] 测序反应体系为：2化 Mix(Bigdye 3.1、5X sequencing buffer、此0)，2化纯化后 的PCR产物，1化引物(5皿ol/L);使用ABI 9700PCR扩增仪进行测序反应。
[0210] 循环条件为：
[0211] 96°C2min 一（95°C10s 一 50°C5s 一 60°C4min)X30 巧 Cles 一终止反应
[0212] 则序反应产物用试剂盒(omega 1320-01)进行纯化，然后上ABI 3730遗传分析仪 进行序列测定。
[0213] 4.结果分析
[0214] 将测序得到的序列，在NCBI上进行BLAST,确定所扩增序列确实为目的序列后，用 SeqMan进行比对，确定所测样本0-酪蛋白基因 CSN2 (8101)位点的基因型，测序峰图见图19-34，结果汇总如表5所示。
[0215]
[0216]
[0220]
[0221] 其中，编号为SEQ ID No:29和SEQ ID No:32的延伸引物及其延伸产物的分子量见 下表所示。
[0222]
[0223] 将CKl与表1所述引物比较发现，8101
位点的SEQ ID No:29的基因型2延伸产物分 子量为5884,与AC61位点的延伸引物分子量5875.8之间过于接近，小于9Da，质谱检测时难 W将两者实现有效分离(见图35)，当AC61位点的肥P未消耗干净时则会严重影响8101位点 延伸产物的结果识别，因此不能选用。
[0224] 对CK2与表1的引物比较发现，CK2所述引物的二级结构较多，进行PC則寸，二聚体明 显，而目的条带模糊，PCR扩增效率较低(见图36)，因此不能选用。由于PCR效率差，继而则不 必进行质谱检测，直接弃而不用。
[0225] 通过对照实施例二，可证明对于已知的SNP所设计的所有核酸质谱引物组，并非都 能适用于目的检测。
[02%] 实施例五:奶牛样本盲检
[0227]根据本发明的方法，依照实施例一、二中所描述的操作步骤，对45例未知0-酪蛋白 基因型的奶牛样本进行盲检。根据实施例四中描述的判定标准对该45例样本进行结果分 析，得到表6。由下表6可W看出，本发明所提供的方法可W有效的实现待检样本的0-酪蛋白 基因分型，检出率为100%。其中，Al型纯合奶牛6例，A2型纯合奶牛17例，A1/A2杂合奶牛22 例。
[0230]
[0231 ]对照实施例S:联合A2(AC61)位点的多重核酸质谱检测
[0232] -.根据中国发明专利申请03817455.3,名称"动物基因分型方法"中报道的位于 CSN1S2基因的AC61位点进行核酸质谱检测。将该位点与CSN2(8101)位点同时设计入一个体 系中进行多重SNP检测，其中所述引物见表1。
[0233] 二.样本来源
[0234] 为考察AC61位点判定分型结果的准确性，本实验中采用与实施例五中同样的样本 进行检测，即编号Nl至M5的45例样本。
[02对立.实验结果
[0236] 根据本发明的方法，依照实施例一、二中所描述的操作步骤，根据实施例四中描述 的判定标准对该45例样本进行结果分析，得到表7。
[0237]

[0239]
[0240] 从上表可W看出，用AC61位点进行A1/A2分型时，45例样本中检出11例与CSN2基因 判定结果不一致的样本(参见附图37-47)，该AC61位点筛选准确率仅为75%，因此，该位点 仅可用于辅助判断。
【主权项】
1. 一种用于核酸质谱检测奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的引物组，其序列如下： 编号 序列（5'-35) 针对位点 甬途 SE〇 ID No: 2i TAAAATCCACC.CCTTTGCCC· CSN2 (SiOl) PCM物 〇 SF.〇 ID No: 22 AGAGGAGGGATGTTTTGTGG CSN2 (810! ) PC.:R引物 SEQ ID No: 23 TTGTGGGAGGCTGTTA CSN2 (8101) 延伸引物2. -种用于核酸质谱检测奶牛β_酪蛋白A2/A1基因的引物组，其序列如下： 编号 序列（5^3'> 针对位点 用逯 SEQ ID No: 21 TAAAATCCACCCCTTTGCCC CSN2 (8101) PCR引物 SEQ ID No: 22 AiMGGAGGGATGTTTTGTGG CSN2 C8I01 ) PCR.;:;|物 SEQ ID No: 23 TTGTGGGAGGCTGTTA CSN2 C8I0I ) 延伸引物。 SEQ ID No: 24 CAGAGAAACCAAAACTGCAAG A2 CAC6! ) PCR 引?勿 SEQ ID No: 25 AATGACAATCiCiCiCI CiMACG A2 CAC6! ) PCR 引物 SEQ ID No: 26 GGC.TGATAC.GTTAAGAAAT A2 CAC6!) 延#引物3. 权利要求1-2所述的引物组，其中，延伸引物及延伸产物的分子量如下： 延伸引物基园型1基函型1延铈基因型2 基S型2延伸 延伸引物 _ 分子量 kAl) 产勸分子量 （A2) 产賴分子量 〇 SEQ ID No: 23 4983.2 A 5310.3 C 5270.4 SFQ ID No: 26 5875.8 G 6123 A 6202.94. 权利要求1-2所述的引物组，其中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5 '端可包 括保护碱基序列，优选5-15个碱基，更优选10bp的tag:ACGTTGGATG。5. 权利要求1-4所述的引物组，其中，上述延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基 序列。6. 权利要求1-5所述的引物组所制备的用于确定奶牛中是否存在β-酪蛋白A2/A1基因 的核酸质谱检测产品。7. 权利要求6的检测产品，其中，该检测产品为检测试剂盒，包括： (1) 用于PCR的反应试剂，包括：权利要求1-5所述的PCR引物，耐高温的DNA聚合酶， dNTPs，PCR反应缓冲液； (2) 用于PCR产物纯化的试剂； (3) 用于单碱基延伸反应的试剂，包括:权利要求1-5所述的延伸引物，耐高温的单碱基 延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。8. 利用权利要求1-7所述的引物组、检测产品或试剂盒，用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1 基因的方法，步骤包括： (1 )PCR反应:使用所述PCR引物，在一个反应体系内，得到含扩增目标区域的PCR产物； (2 )PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰； (3) 单碱基延伸:使用所述延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR 产物进行单碱基延伸； (4) 延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免 盐离子等杂质对后续检测的影响； (5) 质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行 检测，得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图； (6) 将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图，经过质谱仪配套软件分析后，确认SNP 位点的喊基，从而判定该样本的基因型； 其中，用于奶牛酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为:CSN2(8101): [C/A]，C碱基代表 A2型，A碱基代表A1型;和/或 A2(AC61): [G/A]，A碱基代表A2型，G碱基代表A1型。9. 权利要求8的方法，其中用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2 (8101): [C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表A1型。10. -种生产β-酪蛋白A2牛奶的方法，步骤包括： (1) 根据权利要求1-5的引物组，或权利要求6-7的检测产品，或权利要求8-9的鉴定方 法，确定奶牛的β-酪蛋白Α2/Α1基因分型； (2) 选择只具有编码β-酪蛋白Α2基因的奶牛； (3) 对筛选的奶牛进行挤奶。11. 权利要求10的方法，其中步骤(1)可以是针对奶牛胚胎、幼体或成体;和/或， 在步骤（3)之前包括对奶牛进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种群的步骤； 和/或， 在步骤(3)之后包括对奶进行加工制成奶制品的步骤(4)。12. -种通过权利要求1-5的引物组，或权利要求6-7的检测产品，用于制备奶牛筛选、 繁育中进行联合检测的产品。13. 权利要求1-12所述的引物组、检测产品和方法，其中所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。14. 权利要求1-12所述的引物组、检测产品和方法，其中所述奶牛的DNA可以从含有有 核细胞的任何组织中得到，该组织优选为该奶牛的血液、精液、毛发或奶。
【文档编号】C12Q1/68GK105861671SQ201610260677
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】孟庆勇, 张玉英, 刘春城, 王金金, 马庆伟, 柳春霞, 王瑾瑾, 林燕
【申请人】中国农业大学