鸟嘌呤检测探针的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测游离鸟嘌呤及其类似物的新型核酸探针。该探针包含：(1)一段能够形成G四链体结构的核酸序列，其在溶液中形成含有缺口的G四链体，游离的鸟嘌呤可以通过氢键配对的方式填入G四链体的缺口上；(2)一段能够形成发夹结构的核酸序列，发夹结构和G四链体结构共用一段核酸序列，两种结构在溶液中以竞争关系存在；(3)核酸探针末端有荧光标记，当核酸探针形成发夹结构时，荧光基团淬灭，而核酸探针形成G四链体时，荧光可以发光。
【专利说明】鸟標岭检测探针
[0001] 本发明设及核酸碱基检测领域。具体地，设及鸟嚷岭检测探针。
【背景技术】
[0002] 鸟嚷岭是生物体遗传物质的基本成分之一。鸟嚷岭是生物体代谢，复制必不可少 的物质，其在正常代谢中氧化成黄嚷岭，在细胞氧化压力下生成8氧鸟嚷岭，鸟嚷岭的一些 衍生物也作为抗病毒治疗的药物广泛使用。鸟嚷岭，W及其代谢产物，衍生物的检测对鸟嚷 岭代谢过程，疾病诊断，药物代谢过程的研究具有重要的价值。
[0003] 近年来，核巧衍生物作为治疗癌症和抗病毒的药物得到极大的发展，其中鸟嚷岭 衍生物中，阿昔洛韦，恩替洛韦，更替洛韦等已经发展为成熟的抗病毒药物，在瘤疹，乙肝， 艾滋病的治疗中发挥重要作用。临床上，需要一些方法去检测运些药物的吸收，代谢动力学 过程，因而发展一种检测鸟嚷岭的方法有重要的应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种检测游离鸟嚷岭及其类似物的新型核酸探针。该探针包含：（1) 一 段能够形成G四链体结构的核酸序列，其在溶液中形成含有缺口的G四链体，游离的鸟嚷岭 可W通过氨键配对的方式填入G四链体的缺口上；（2) -段能够形成发夹结构的核酸序列， 发夹结构和G四链体结构共用一段核酸序列，两种结构在溶液中W竞争关系存在；（3)核酸 探针末端有巧光标记，当核酸探针形成发夹结构时，巧光基团泽灭，而核酸探针形成G四链 体时，巧光可W发光。本发明中的探针可W特异性检测核酸碱基如鸟嚷岭核巧，鸟嚷岭核巧 酸，鸟嚷岭脱氧核巧酸，鸟嚷岭核巧=憐酸等天然鸟嚷岭衍生物，也可W检测鸟嚷岭代谢产 物如黄嚷岭，8氧鸟嚷岭，还可W用于检测抗病毒药物如：阿昔洛韦，更昔洛韦等，检测浓度 可W低至5nM。
[0005] G四链体是一种由多聚鸟嚷岭折叠形成的稳定四链核酸结构，其基本结构包含2层 或W上四聚鸟嚷岭平面，平面上鸟嚷岭之间相互W氨键连接。本发明中使用了一种鸟嚷岭 平面上有一个鸟嚷岭缺口的G四链体，如图IA所示，运种缺口 G四链体可W接受一个来自溶 液的鸟嚷岭或其衍生物，W氨键配对方式填入从而形成完整的四聚鸟嚷岭平面，如图IB; 2 个鸟嚷岭加上一个黄嚷岭的平面(如图IC所示)可W接受一个游离的8氧鸟嚷岭形成一个鸟 嚷岭:黄嚷岭:8氧鸟嚷岭平面(如图ID所示）。在溶液中鸟嚷岭或其衍生物填充后，原来的G 四链体的稳定性得到了极大提升。
[0006] 鸟嚷岭碱基上各个基团的分布是其能填入带缺口 G四链体的关键因素，其他的碱 基如A，C，T，U，鸟嚷岭代谢产物黄嚷岭或次黄嚷岭等不能填入。在鸟嚷岭N7位上甲基化取代 的dzGTP也不能填入。运个性质赋予了本发明方法对鸟嚷岭检测的特异性。
[0007] 图1显示鸟嚷岭及其类似物填入带缺口的鸟嚷岭平面后通过氨键配对形成完整的 四聚鸟嚷岭平面。图IA表示3个鸟嚷岭的平面接受一个游离的鸟嚷岭形成图IB所示的四聚 鸟嚷岭平面，图IC表示2个鸟嚷岭加上一个黄嚷岭的平面可W接受一个游离的8氧鸟嚷岭形 成一个图ID所示的鸟嚷岭:黄嚷岭:8氧鸟嚷岭平面。结构式中6元环里的字母G代表该碱基 为鸟嚷岭，X代表黄嚷岭，O为8氧鸟嚷岭。
[0008] 根据带缺口G四链体适配游离鸟嚷岭的原理，我们设计了如图2所示核酸探针，探 针的3'末端带有一个TAMRA(罗丹明）标记。该核酸探针在溶液中可W两种结构形式存在，其 5'端GGGCGGAGGGAAGTGGG部分可W在K离子下形成带缺口的G四链体结构，其3'端 GGGATATTTTATCCC部分可W形成一个6碱基配对的发夹结构，G四链体和发夹结构共用了一 段序列，因而在溶液中，该探针要么形成G四链体，要么形成发夹结构，两种结构W竞争关系 存在且可W相互转化。当外源的鸟嚷岭或其衍生物存在时，鸟嚷岭填入G四链体的缺口处使 其稳定性增加，探针的构象由发夹向G四链体转化。TAMRA标记可W精确反映运个转化过程。 在发夹结构中，TAMRA所在碱基处于配对状态，其巧光被泽灭，在G四链体形成后，TAMRA所在 碱基变成单链状态，其泽灭被解除，巧光增强。因而检测TAMRA巧光强度的变化可W检测游 离鸟嚷岭的浓度。
[0009] 图2显示基于DNA碱基配对泽灭的单巧光鸟嚷岭检测探针的工作原理。探针处于发 夹状态时，3'端的TAMRA因双链配对处于泽灭状态，当探针处于G四链体结构形式时，3' TAMRA所在碱基处于单链状态，巧光发光。溶液中鸟嚷岭或其类似物的加入改变了探针结构 形式，使其由发夹结构转变为G四链体结构，探针3'端的TAMRA基团从配对的泽灭状态下释 放出来，从而其巧光信号极大升高。TAMRA巧光信号的变化可W反映出加入鸟嚷岭的浓度。
[0010] 除了图2所示的单巧光标记探针，我们还设计了如图3所示双标记探针。该探针5' 端有一个FAM巧光基团，其3 '端有一个泽灭基团BHQl，当探针处于发夹状态时，5 ' FAM和3 ' BHQl因 DNA配对而接近，FAM巧光处于泽灭状态。当探针形成G四链体时，5 ' FAM和3 ' BHQl分 开，FAM巧光不被泽灭。从发夹结构到G四链体结构的转变过程可W通过FAM巧光发光强度来 检测。在外源鸟嚷岭或者其衍生物存在下，发夹结构和G四链体结构的平衡被打破，探针结 构向G四链体增加的方向转变，探针巧光增强。因而，检测探针FAM巧光强度的变化可W反映 溶液中鸟嚷岭或者其衍生物浓度。
[0011] 图3显示基于巧光，泽灭基团双标记的鸟嚷岭检测探针的工作原理。探针处于发夹 结构时，巧光基团和泽灭基团接近，巧光被泽灭；当探针形成G四链体时，巧光基团和泽灭基 团分开一段距离，巧光发光。溶液中鸟嚷岭或其类似物的加入改变了探针结构形式，使其由 发夹结构转变为G四链体结构，探针5'端的巧光基团从配对的泽灭状态下释放出来，从而其 巧光信号极大升高。巧光信号的变化可W反映出加入鸟嚷岭的浓度。
[0012] 具体地，本发明提供用于检测或定量鸟嚷岭或鸟嚷岭类似物或鸟嚷岭衍生物的探 针，其特征在于包括一段能够形成G四链体的序列A和一段能够与所述序列A形成发夹结构 的序列B或由所述序列A和所述序列B组成，
[0013] 其中序列A位于所述鸟嚷岭检测探针的5'端和序列B位于所述鸟嚷岭检测探针的 3'端;或者，序列A位于所述鸟嚷岭检测探针的3'端和序列B位于所述鸟嚷岭检测探针的5' 端，
[0014] 其中所述序列A包含3个单元巧Rl个单元II，所述单元I由GGG组成，所述单元II由 GG组成，其中单元I与单元II之间由1-4个碱基连接，3个单元I之间彼此由1-4个碱基连接， 在所述探针中，鸟嚷岭仅存在于单元I和单元II中，
[0015]其中当所述探针的5'端或3'端连接巧光基团时，所述序列B与序列A形成的发夹结 构的环由3或4个碱基组成，
[0016] 当所述探针的5'端和3'段连接巧光基团-泽灭基团对时，所述序列B与序列A形成 的发夹结构的环由10，11，12，13或15个碱基组成，
[0017] 其中所述序列A和所述序列B形成的发夹结构包括1个单元I，或者包括1个单元II W及单元I的1-2个碱基，
[0018] 其中所述鸟嚷岭类似物选自黄嚷岭或8氧代鸟嚷岭，
[0019] 所述鸟嚷岭衍生物选自含有鸟嚷岭基团的药物。
[0020] 优选地，所述单元I中的GGG里有一个G被黄嚷岭置换。所述单元I中的GGG里有一个 G被8氧代鸟嚷岭置换。
[0021] 优选地，所述探针在含有K离子和PEG200的缓冲体系中能够形成一个有空缺的G四 链体。其中更优选地，K离子浓度是1-150mM，PEG200浓度是10-50 % (w/v)，所述缓冲体系为 pH7.4的IO-IOOmM Tris-肥1，或抑7.4的IO-IOOmM二甲基肿酸裡，或抑7.4的IO-IOOmM憐酸 钢
[0022] 优选地，所述G四链体的空缺被溶液中鸟嚷岭碱基或其类似物填入。
[0023] 优选地，所述巧光基团选自14134术41，8〇(11口7,416皿488或106，所述巧光基团-泽灭基团对选自B册1和FAM，Dabcy巧日FAM，B册巧日TAMRA，Ec 1 ipse和FAM，或CY5和B册3。
[0024] 在本发明中，所述鸟嚷岭类似物选自黄嚷岭或8氧代鸟嚷岭，所述鸟嚷岭衍生物选 自阿昔洛韦，更昔洛韦或恩替洛韦。
[0025] 更优选地，所述探针的序列如SEQ ID NO: 1，2,3,4或5所示。
【附图说明】
[0026] 图1:鸟嚷岭及其类似物填入带缺口的鸟嚷岭平面后通过氨键配对形成完整的四 聚鸟嚷岭平面。图IA表示3个鸟嚷岭的平面接受一个游离的鸟嚷岭形成图IB所示的四聚鸟 嚷岭平面，图IC表示2个鸟嚷岭加上一个黄嚷岭的平面可W接受一个游离的8氧鸟嚷岭形成 一个图ID所示的鸟嚷岭:黄嚷岭:8氧鸟嚷岭平面。结构式中6元环里的字母G代表该碱基为 鸟嚷岭，X代表黄嚷岭，0为8氧鸟嚷岭。
[0027] 图2:显示基于DNA碱基配对泽灭的单巧光鸟嚷岭检测探针的工作原理。
[0028] 图3:显示基于巧光，泽灭基团双标记的鸟嚷岭检测探针的工作原理。
[0029] 图4:本发明中使用的鸟嚷岭及其类似物结构式。
[0030] 图5:显示鸟嚷岭探针对含鸟嚷岭碱基核巧酸的选择性。
[0031] 图6显示鸟嚷岭探针检测更昔洛韦和阿昔洛韦的浓度曲线。
[0032] 图7显示鸟嚷岭探针T-MY0G2检测阿昔洛韦(A)，更昔洛韦(B)，泛昔洛韦(C)。
[0033] 图8显示鸟嚷岭探针DQ-MYOG对阿昔洛韦和更昔洛韦检测。
[0034] 图9显示探针X-ABTB2对8氧鸟嚷岭脱氧核巧，鸟嚷岭核巧，黄嚷岭核巧的检测曲 线。
[0035] 图10显示探针0-ABTB2对8氧鸟嚷岭脱氧核巧，鸟嚷岭核巧，黄嚷岭核巧的检测曲 线。
【具体实施方式】
[0036] 下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可W理解的是， 下述实施例是举例说明的目的，其不应W任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护 范围由后附的权利要求所限定。
[0037]使用的材料，引物序列
[003引使用到的引物DNA是在化kara公司合成。二甲基神酸裡(pH 7.4)，PEG 200，LiCl， KCl等为常用化学试剂。本发明中使用检测样品分子及结构式如图4所示，所有图4分子均购 自 Si卵a和Tri 1 ink Biotechnology。ATP，CTP，UTP，GTP，GMP等为常用核巧酸。
[0039] 表1使用引物W及序列，SEQ ID N0:4中的N代表黄嚷岭，SEQ ID N0:5中的N代表8 氧鸟嚷岭
[0040]
[0041 ]注:序列中的粗体下划线表示形成G四链体的序列。
[0042] 实验步骤
[0043] 1. GMP，GTP，ATP，CTP，UTP，dzGTP溶解于水中，浓度为1 OOmM，泛昔洛韦，阿昔洛韦和 更昔洛韦购自sigma,溶解在水中，浓度为ImM。样品分子在实验中用水稀释至相应浓度。
[0044] 2.探针DNA溶解在水中，母液浓度为IOiiM。
[0045] 3.样品反应缓冲液成分包含40%(w/v)PEG 200,50mM二甲基神酸裡(口^.4)，0-150mM KCl，0-150mM LiCKLiCl和KCl总浓度 150mM)。
[0046] 4.样品制备。
[0047] 终浓度5-50nM鸟嚷岭探针加入到样品反应缓冲液，95°C加热5分钟，迅速放冰上冷 却。加入不同浓度待检测化学分子，室溫放置10-30分钟。
[004引5.样品检测
[0049] 样品巧光检测在巧光稳态测量系统（QuantaMaster-40)上完成，测量时使用激发 光556nm，收集565-600nm发射光谱。收集最大发射579nm处巧光值进行分析。
[0050] 实施例1鸟嚷岭探针T-ABTB2对天然鸟嚷岭核巧酸的特异性检测
[0051] 将5nM探针T-ABTB2加入到30mM KCl，120mM 11(：1，40%阳6200,50碰二甲基肿酸裡 (pH 7.4 )，95 °C加热5分钟，迅速放冰上冷却。取1.5mL溶液加入到光程为1 cm的石英比色杯 中，从低到高逐步加入GMP，GTP，dzGTP，W及ACU(ATP，CTP，UTP等摩尔量混合物），充分混匀， 静置2分钟，设置556nM激发，579nM发射，每秒读取一次巧光值，持续检测100秒，取运一百个 巧光值的平均值对核巧分子浓度作曲线。
[0052] 根据图2原理设计，探针T-ABTB2形成的G四链体上有一个缺口，鸟嚷岭填入缺口后 G四链体稳定性增加，探针DNA构象由发夹结构往G四链体转变，TAMRA巧光增强。
[0053] 结果见图5所示，探针巧光随GMP和GTP浓度增加逐渐增强，线性变化区间为10-190 WMdGTP的类似物dzGTP在400iiMW内都没有增加探针巧光值。和GTP相比，dzGTP的N7位氮原 子替换为碳原子(如图3)，使其不能够与含缺口 G四链体形成4个氨键，因而dzGTP不具备和 GTP-样填入和稳定G四链体的能力。AClK ATP，CTP和UTP的等摩尔量混合物)和dzGTP都不能 填入G四链体，探针巧光值不会增加。
[0054] 图5显示鸟嚷岭探针对含鸟嚷岭碱基核巧酸的选择性。其中横轴和纵轴分别表示 鸟嚷岭衍生物的浓度和样品巧光值，图A，GMP浓度与探针TAMRA最大发射峰579nm处巧光值 的关系曲线，线性范围是10-190測，方程为:Y=165.7巧+108208,32 = 0.9980;图6,61口浓度 与探针TAMRA最大发射峰57化m处巧光值的关系曲线，线性范围是10-170础，方程为：Y = 175.0巧+119864，R2 = 0.9999;图C，ATP: CTP:UTP= 1:1:1下总NTP浓度与探针TAMRA最大发 射峰57化m处巧光值的关系曲线，W及鸟嚷岭衍生物dzGTP浓度与探针TAMRA最大发射峰 579nm处巧光值的关系曲线。
[0055] 实施例2鸟嚷岭探针T-ABTB2对抗病毒药物阿昔洛韦和更昔洛韦的检测
[0056] 5nM T-ABTB2加入到30mM KCl，120mMLiCl，40%PEG 200,50mM二甲基肿酸裡（pH 7.4)，95°C加热5分钟，迅速放冰上冷却。取1.5mL溶液加入到光程为Icm的巧光杯中，从低到 高逐步加入阿昔洛韦或者更昔洛韦，充分混匀，静置2分钟，设置556nM激发，579nM发射，每 秒读取一次巧光值，持续读100秒，取运一百个值的平均值为相应阿昔洛韦或者更昔洛韦浓 度下的巧光值作曲线。
[0057] 结果如图6所示，相比GMP和GTP，阿昔洛韦和更昔洛韦能够在更低浓度下增强探针 巧光，样品浓度和巧光值的线性范围为0.5-2祉M。
[0058] 图6显示鸟嚷岭探针检测更昔洛韦和阿昔洛韦的浓度曲线。其中横轴和纵轴分别 表示鸟嚷岭衍生物的浓度和样品巧光值，空屯、方框为阿昔洛韦浓度与探针TAMRA最大发射 峰57化m处巧光值的关系曲线，线性范围是0.5-2如M，方程为：Y= 1575巧+117305，R2 = 0.9941;实屯、圆点为更昔洛韦浓度与探针TAMRA最大发射峰57化m处巧光值的关系曲线，线 性范围是 0.5-2 祉 M，方程为:Y=1526*X+116164，R2 = 0.9967。
[0059] 实施例3:与T-ABTB2具有相似结构特征的T-MY0G2探针对鸟嚷岭衍生物抗病毒药 物的检测。
[0060] 5nMT-MY0G2加入到30mMKCl，120mMLiCl，40%阳G 200,50mM二甲基肿酸裡(pH 7.4 )，95 °C加热5分钟，迅速放冰上冷却。取1.5mL溶液加入到光程为Icm的巧光杯中，从低到 高逐步加入阿昔洛韦或者更昔洛韦或泛昔洛韦，充分混匀，静置2分钟，设置556nM激发， 579nM发射，每秒读取一次巧光值，持续读100秒，取运一百个值的平均值为相应阿昔洛韦或 者更昔洛韦浓度下的巧光值作曲线。
[0061 ] 检测结果见图7 ,T-MY0G2探针对鸟嚷岭衍生物的检测浓度范围在0.1-5測之间，与 T-ABTB2相比其检测灵敏度提高了 5倍W上。
[0062] 图7显示鸟嚷岭探针T-MY0G2检测阿昔洛韦(A),更昔洛韦（B)，泛昔洛韦（C)。其中 横轴和纵轴分别表示鸟嚷岭衍生物的浓度和样品巧光值，阿昔洛韦的线性范围为0.1-0.化 M，线性关系方程为:Y = O. 4492巧+6.145R2 = 0.9910。更昔洛韦的线性检测范围为0.2-3iiM， 线性关系方程为:Y = O. 2457巧+6.280R2 = 0.9958。泛昔洛韦的线性检测范围是0.2-5測，线 性关系方程为:Y = O. 1647*X+6.222R2 = 0.9951。
[0063] 实施例4.鸟嚷岭探针DQ-MYOG对抗病毒药物阿昔洛韦和更昔洛韦的更高灵敏度检 测
[0064] 探针DQ-MYOG检测鸟嚷岭的原理见图3。
[00化]50nMDQ-MY0G加入到30mMKCl，120mMLiCl，40%阳G 200,50mM二甲基肿酸裡(pH 7.4 )，95 °C加热5分钟，迅速放冰上冷却。取1.5mL溶液加入到光程为Icm的巧光杯中，从低到 高逐步加入阿昔洛韦或者更昔洛韦，充分混匀，静置2分钟，设置490nM激发，520nM发射，每 秒读取一次巧光值，持续读100秒，取运一百个值的平均值为相应阿昔洛韦或者更昔洛韦浓 度下的巧光值作曲线。
[0066] 鸟嚷岭探针DQ-MYOG对鸟嚷岭的检测基于图3所示原理。和T-ABTB2，T-MY0G2相比， DQ-MYOG形成发夹时其连接环更长，其形成的发夹稳定性比较差，在和G四链体的竞争中处 于劣势。在很低浓度鸟嚷岭时，DQ-MYOG的发夹结构就开始向G四链体转变，巧光信号发生增 长。图8结果显示，DQ-MYOG对阿昔洛韦和更昔洛韦可W在很大浓度范围内检测，其对运两种 药物的检测线性关系在5-lOOnM之间。
[0067] 图8显示鸟嚷岭探针DQ-MYOG对阿昔洛韦和更昔洛韦检测。其中横轴和纵轴分别表 示鸟嚷岭衍生物的浓度和样品巧光值，阿昔洛韦的线性范围为lO-lOOnM，线性关系方程为： ￥ = 0.007654巧+3.159，1?2 = 0.9988。更昔洛韦的线性检测范围为5-80碰，线性关系方程为： Y = 0.00 7767*X+3.177，R2 = 0.9965。
[006引实施例5.探针X-ABTB2对8氧鸟嚷岭的特异性检测
[0069] 探针X-ABTB2检测8氧鸟嚷岭的原理见图2。
[0070] 25nM探针X-ABTB2加入到30mM KCl，120mM LiCl，40%PEG200,50mM二甲基肿酸裡 (抑7.4)，95°C加热5分钟，迅速放冰上冷却。取1.5血溶液加入到光程为1 cm的巧光杯中，从 低到高逐步加入鸟嚷岭核巧及其类似物，充分混匀，静置2分钟，设置490nM激发，520nM发 射，每秒读取一次巧光值，持续读100秒，取运一百个值的平均值为相应鸟嚷岭核巧及其类 似物浓度下的巧光值作曲线。
[0071] 图9结果显示，0到25咖范围内，8氧鸟嚷岭脱氧核巧可W被探针X-ABTB2特异性识 另IJ，而与其结构非常接近的鸟嚷岭核巧和黄嚷岭核巧几乎不识别。8氧鸟嚷岭脱氧核巧的线 性检测范围在40nM到1.5iiM。
[0072] 图9显示探针X-ABTB2对8氧鸟嚷岭脱氧核巧，鸟嚷岭核巧，黄嚷岭核巧的检测曲 线。其中横轴和纵轴分别表示核巧浓度和探针TAMRA最大发射峰579nm处巧光值。图A中显示 0到25測范围内，探针巧光值与8氧鸟嚷岭脱氧核巧，黄嚷岭核巧和鸟嚷岭核巧的浓度关系。 图B是探针检测8氧鸟嚷岭脱氧核巧的线性范围。线性方程为:Y = O. OOl 151巧+3.901，R2 = 0.9993
[0073] 实施例6.探针0-ABTB2对黄嚷岭的特异性检测
[0074] 探针0-ABTB2检测黄嚷岭的原理见图2。
[0075] 25nM探针0-ABTB2加入到30mM KCl，120mM LiCl，40%PEG200,50mM二甲基肿酸裡 (抑7.4)，95 °C加热5分钟，迅速放冰上冷却。取1.5血溶液加入到光程为I cm的巧光杯中，从 低到高逐步加入鸟嚷岭核巧及其类似物，充分混匀，静置2分钟，设置490nM激发，520nM发 射，每秒读取一次巧光值，持续读100秒，取运一百个值的平均值为相应鸟嚷岭核巧及其类 似物浓度下的巧光值作曲线。
[0076] 图9结果显示，0到20咖范围内，黄嚷岭核巧可W被探针0-ABTB2特异性识别，而与 其结构非常接近的鸟嚷岭核巧识别能力较差，在扣MW上才开始识别。8氧鸟嚷岭脱氧核巧 在该浓度范围内几乎不被探针识别。黄嚷岭核巧的线性检测范围在50nM到化M。
[0077] 图10显示探针0-ABTB2对8氧鸟嚷岭脱氧核巧，鸟嚷岭核巧，黄嚷岭核巧的检测曲 线。横轴和纵轴分别表示核巧浓度和探针TAMRA最大发射峰579nm处巧光值。图A中显示0到 20測范围内，探针巧光值与8氧鸟嚷岭脱氧核巧，黄嚷岭核巧和鸟嚷岭核巧的浓度关系。图B 是探针检测黄嚷岭核巧的线性范围。线性方程为:Y = O. OOl 106*X+7.130，R2 = 0.9944。
【主权项】
1. 用于检测或定量鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物或鸟嘌呤衍生物的探针，其特征在于包括一 段能够形成G四链体的序列A和一段能够与所述序列A形成发夹结构的序列B或由所述序列A 和所述序列B组成， 其中序列A位于所述鸟嘌呤检测探针的5'端和序列B位于所述鸟嘌呤检测探针的3'端； 或者，序列A位于所述鸟嘌呤检测探针的3 '端和序列B位于所述鸟嘌呤检测探针的5 '端， 其中所述序列A包含3个单元I和1个单元II，所述单元I由GGG组成，所述单元II由GG组 成，其中单元I与单元Π 之间由1-4个碱基连接，3个单元I之间彼此由1-4个碱基连接，在所 述探针中，鸟嘌呤仅存在于单元I和单元II中， 其中当所述探针的5 '端或3 '端连接荧光基团时，所述序列B与序列A形成的发夹结构的 环由3或4个碱基组成， 当所述探针的5'端和3'段连接荧光基团-淬灭基团对时，所述序列B与序列A形成的发 夹结构的环由10,11，12,13,14或15个碱基组成， 其中所述序列A和所述序列B形成的发夹结构包括1个单元I，或者包括1个单元II以及 单元I的1-2个碱基， 其中所述鸟嘌呤类似物选自黄嘌呤或8氧代鸟嘌呤， 所述鸟嘌呤衍生物选自含有鸟嘌呤基团的药物。2. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述单元I中的GGG里有一个G被黄嘌呤置 换。3. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述单元I中的GGG里有一个G被8氧代鸟嘌 呤置换。4. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述探针在含有K离子和PEG200的缓冲液中 能够形成一个有空缺的G四链体。5. 根据权利要求4所述的探针，其特征在于K离子浓度是l-150mM。6. 根据权利要求4所述的探针，其特征在于PEG200浓度是10-50 % (w/v)。7. 根据权利要求4所述的探针，其特征在于所述缓冲体系为pH7.4的10-100mM Tris-HC1，或ρΗ7·4的10-100mM二甲基胂酸锂，或ρΗ7·4的10-100mM磷酸钠。8. 根据权利要求4所述的探针，其特征在于所述G四链体的空缺被溶液中鸟嘌呤碱基或 其类似物填入。9. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述荧光基团选自TAMRA，FAM，Bodipy， A1 exa 488或JOE，所述荧光基团-淬灭基团对选自BHQ1和FAM，Dabcy 1和FAM，BHQ2和TAMRA， Eel ipse和FAM或CY5和BHQ3 〇10. 根据权利要求1所述的探针，其中所述鸟嘌呤衍生物选自阿昔洛韦，更昔洛韦或恩 替洛韦。11. 权利要求1所述的特征，其序列如SEQ ID N0:l，2,3,4或5所示。
【文档编号】C12Q1/68GK105861682SQ201610292415
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】谭亥力, 江瑜, 郑阳丽, 唐骏
【申请人】厦门多维生物医药科技有限公司