一种快速检测人染色体数目的多重相对实时荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测人染色体数目的多重相对实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括A组反应体系和B组反应体系2个反应管，其中：A组反应体系包括：用于检测21号和18号染色体间重复序列、13号和1号间染色体重复序列的2对引物以及4条Taqman探针，主要用于检测13号、18号和21号染色体的数目；B组反应体系包括：用于检测16号和X染色体间重复序列、1号和Y染色体间重复序列的2对引物以及4条Taqman探针，主要用于检测X和Y染色体的数目。本发明所述试剂盒能同时而独立地分别检测出13号、18号、21号、X和Y染色体的数目，结果准确、可靠，且灵敏度高、特异性强。
【专利说明】
-种快速检测人染色体数目的多重相对实时黄光定量PCR检 测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及医学检测技术领域，具体设及一种快速检测人染色体数目的多重相对 实时巧光定量PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 染色体病主要是因染色体的数目或结构异常引起的疾病，临床上常会引起流产、 死胎、早夭、先天性智力低下、发育滞后、多发崎形及性发育不全等疾病的发生。临床上21 号，18号和13号染色体=体综合征最为常见，其发病率分别为1/700~1/800,1/3500~1/ 8000和1/4000~1/10000。目前，该类染色体疾病尚无有效的治疗方法，因此，及时进行产前 诊断防止患儿的出生是预防染色体疾病发生的主要方法。
[0003] 羊水细胞培养、染色体核型分析是产前诊断的经典方法(Caspersson T，Zech L, Johansson C，et al. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents[J] .QiromosomatigTOtSO(S) :215-227.)，但是，该方法一般需要两周 W上才能得到检测结果，容易导致孕妇及其家庭承受极大的屯、理压力。焚光原位杂交 (FISH)技术应用于产前快速诊断，无需进行细胞培养，实现了染色体疾病的快速诊断化O SSYjChua CjGole L，et al.Same-day prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies using microfIuidics-fIuorescence in situ hybridization[J] .化enatal Diagnosis,2012,32(4) :321-328.),但是由于该技术操作繁琐并且要求具有良 好的技术专业性，使得该技术不能大量的进行临床标本的应用。基于STR的QF-PCR方法 (Atef SH,Hafez S,Helmy S，et al.QF-PC民 as a Rapid Technique for Routine Prenatal Diagnosis of Fetal Aneuploidies[J].Pediatric 民esearch，201I，70:412- 412.)和Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)方法实现了21号W 及其它染色体的快速诊断（Slater HR，Bruno DL,Ren H，et al .Rapid,high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitative method(MLPA)[J] ? Journal of medical genetics,2003,40(12):907-912.),但是该类方法需要产物的后续 毛细管电泳分析等步骤，操作繁琐且需昂贵的遗传分析仪，不利于方法的广泛推广应用。
[0004] 实时焚光定量PCR方法诊断非整倍体不需要PCR后处理，具有简便、快速和批量处 理的能力。之前的研究主要是采用不同染色体间的特异性基因进行诊断，如21号染色体的 诊断（Zimmermann B，Holzgreve W,Wenzel F，et al .Novel real-time quantitative PC民 test for trisomy 21[J].Clinical chemist巧，2002,48(2):362-363.), 1^及21 号和 18号 染色体的诊断（Zimmermann B G，Dudarewicz L.民eal-time quantitative PC民 for the detection of fetal aneuploidies[M].Prenatal Diagnosis.Humana Press，2008:95-109) D但是，由于采用两对引物分别扩增不同的片段，很微小的退火温度的变化或DNA质量 的差异都会引起假阴性或假阳性的结果，从而导致结果的不准确性化elmy SM, Ismail S， Bassiouni 民，et al.Sensitivity of DCS民3/GAPDH ratio using quantitative real- time PCR in the rapid prenatal diagnosis for down syndrome[J].Fetal Diagn 化er，2009，25(2): 220-223.)。为此，本发明人开发出了重复片段的实时巧光相对定量PCR 法快速诊断21 号染色体（Rapid detection of Down's syndrome using quantitative real-time PCR(qPCR)targeting segmental duplications on chromosomes 2Iand 11)， 从而大大的提高了 qPCR检测的稳定性和可靠性。
[0005] 在前期的研究中，本发明人建立了基于重复片段的qPC財夹速诊断唐氏综合征的研 究，也是在前期的研究中，我们发现，基于重复片段的相对定量非常稳定，从而研究建立了 一种单管同时检测4条染色体的数目的单管四色双重相对定量PCR。在理论结合实践的研究 过程中，我们通过人类染色体基因数据库，开发了一系列新的重复序列分子标记，开发出实 现人21号、18号、13号、X和Y染色体数目快速检测的试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是筛选出了一系列新的重复序列分子标记，并因此提供 了一种快速检测人21号、18号、13号、X和Y染色体数目的多重相对实时巧光定量PCR检测试 剂盒。该试剂盒采用两套独立的检测体系，用于检测人21号、18号、13号、X和Y染色体数目结 果准确、可靠，且灵敏度高、特异性强。
[0007] 本发明所述的快速检测人染色体数目的多重相对实时巧光定量PCR检测试剂盒， 包括A组反应体系和/或B组反应体系，其中：
[000引所述A组反应体系中的扩增检测试剂包括：
[0009] (1)同时扩增21号染色体特异重复序列C虹21与18号染色体特异重复序列Chris的 引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示；
[0010] (2)特异性检测21号染色体特异重复序列chr21的化91113]1探针chrSl-Probe，其碱 基序列如SEQ ID NO:3所示；
[0011 ] (3)特异性检测18号染色体特异重复序列chrlS的I'aqman探针chrlS-Probe，其碱 基序列如SEQ ID NO:4所示；
[0012] (4)同时扩增13号染色体特异重复序列C虹13与1号染色体特异重复序列Chrl-I的 引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
[0013] (5)特异性检测13号染色体特异重复序列chr 13的I'aqman探针chr IS-Probe，其碱 基序列如SEQ ID NO:7所示；
[0014] (6)特异性检测1号染色体特异重复序列(3虹1-1的I'aqman探针C虹I-I-Probe，其碱 基序列如SEQ ID NO:8所示。
[0015] 所述B组反应体系中的扩增检测试剂包括：
[0016] (1)同时扩增16号染色体特异重复序列Chrie与X染色体特异重复序列Ch巧的引物 对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示；
[0017] (2)特异性检测16号染色体特异重复序列chr 16的I'aqman探针chr IG-Probe，其碱 基序列如SEQ ID NO: 15所示；
[001引（3)特异性检测X染色体特异重复序列C虹X的化qman探针ckrX-Probe，其碱基序列 如沈Q ID NO: 16所示；
[0019] (4)同时扩增1号染色体特异重复序列C虹1-2与Y染色体特异重复序列Ch巧的引物 对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
[0020] (5)特异性检测1号染色体特异重复序列(3虹1-2的I^qman探针C虹I-S-Probe，其碱 基序列如SEQ ID NO: 19所示；
[0021 ] (6)特异性检测￥染色体特异重复序列油巧的化〇11励1探针油巧斗1'〇66，其碱基序列 如沈Q ID NO:20所示。
[0022] 本发明所述的技术方案中，A组反应体系包括:用于检测21号和18号染色体间重复 序列、13号和1号间染色体重复序列的2对引物W及4条化qman探针，主要用于检测13号、18 号和21号染色体的数目；B组反应体系包括:用于检测16号和X染色体间重复序列、1号和Y染 色体间重复序列的2对引物W及4条化qman探针，主要用于检测X和Y染色体的数目。本发明 所述试剂盒不仅可W实现对13号、18号、21号、X和Y染色体的检测，同时，还可实现对1号和 16号染色体的非整倍体进行筛查。
[0023] 由于染色体的数目与染色体上的特异序列拷贝数一致，而染色体序列的拷贝数通 过实时巧光的2-^et换算而来，因此，通过2-AAET值我们就能推断出所检测序列的拷贝数，并 得到所检测染色体的数目。
[0024] 本发明所述技术方案虽然将检测体系分成了 A组反应体系和B组反应体系，但是在 实际的应用中，每对重复序列的引物和探针不仅可W单独使用，还可W任意两两组合使用。
[0025] 上述技术方案的A组反应体系中，所述21号染色体特异重复序列chr21与18号染色 体特异重复序列ChrlS为两个相似序列，其中，21号染色体特异重复序列chr21的碱基序列 如SEQ ID N0:9所示，18号染色体特异重复序列ChrlS的碱基序列如SEQ ID NO: 10所示。所 述SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2为一对引物，能同时扩增21号和18号染色体上的chr21与 C虹18两个相似序列。
[00%]上述技术方案的A组反应体系中，所述13号染色体特异重复序列chrl3与1号染色 体特异重复序列C虹1-1为两个相似序列，其中，13号染色体特异重复序列C虹13的碱基序列 如SEQ ID NO: 11所示，1号染色体特异重复序列C虹1-1的碱基序列如SEQ ID NO: 12所示。所 述SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6为一对引物，能同时扩增13号和1号染色体上的chrl3与 C虹1-1两个相似序列。
[0027]上述技术方案的A组反应体系中，
[002引 I^qman探针chr21-Probe(沈Q ID N0:3)的5'端标记FAM，3'端标记B册1，能特异的 检测21号染色体上的序列C虹21的扩增量；
[0029] I^qman探针ChrlS-Probe(沈Q ID N0:4)的5'端标记肥X，3'端标记B册1，能特异的 检测18号染色体上的序列C虹18的扩增量；
[0030] I^qman探针chrl3-Probe(沈Q ID N0:7)的5'端标记CY5,3'端标记B册2,能特异的 检测13号染色体上的序列C虹13的扩增量；
[0031] I'aqman探针chrl-1-Probe(SEQ ID 顯：8)的5'端标记3(^，3'端标记8朋2，能特异 的检测1号染色体上的序列C虹1-1的扩增量。
[0032] 上述技术方案的B组反应体系中，所述16号染色体特异重复序列Chrie与X染色体 特异重复序列Ch巧为两个相似序列，其中，16号染色体特异重复序列Chrie的碱基序列如 SEQ ID N0:21所示，X染色体特异重复序列Ch巧的碱基序列如SEQ ID N0:22所示。所述SEQ ID NO: 13和沈Q ID NO: 14为一对引物，能同时扩增16号和X染色体上的chrl6与C虹X两个相 似序列。
[0033] 上述技术方案的B组反应体系中，所述1号染色体特异重复序列chrl-2与Y染色体 特异重复序列Ch巧为两个相似序列，其中，1号染色体特异重复序列chrl-2的碱基序列如 SEQ ID N0:23所示，Y染色体特异重复序列Ch巧的碱基序列如SEQ ID N0:24所示。所述SEQ ID NO: 17和沈Q ID NO: 18为一对引物，能同时扩增1号和Y染色体上的chrl-2与C虹Y两个相 似序列。
[0034] 上述技术方案的B组反应体系中，
[0035] 化9111311探针Chrie-Probe(沈Q ID ^:15)的5'端标记〔￥5,3'端标记8朋2，能特异 的检测16染色体上的序列C虹16的扩增量；
[0036] I^qman探针chri(-Probe(SEQ ID側：16)的为5'端标记1?(^，3'端标记8册2，能特异 的检测X染色体上的序列C虹X的扩增量。
[0037] I^qman探针chrl-2-Probe(SEQ ID側：19)的5'端标记皿乂，3'端标记8册1，能特异 的检测1号染色体上的序列C虹1-2的扩增量；
[0038] I^qman探针Ch巧-Probe(SEQ ID N0:20)的5'端标记FAM，3'端标记B册1，能特异的 检巧化染色体上的序列C虹Y的扩增量。
[0039] 本发明试剂盒中所设及的引物均是来源于所筛选出的染色体间特异的重复序列， 运些特异重复序列的开发是研究成果的关键，试剂盒所开发的重复序列主要有：
[0040] (1)21号染色体与18号染色体间的重复序列分别为21号染色体序列（NC_ 000021.8:14678083-14695820; 29363117-29409417)和 18 号染色体序列（NC_0000018.10: 15042954-15089199)；
[0041] (2) 13号染色体与1号染色体间的重复序列分别为13号染色体序列（NC_ 000013.11:24678454-24692625)和 1 号染色体序列（NCJ)OOOOI . 10:79324763-79325050);
[0042] (3) 16号染色体与X染色体间的重复序列分别为16号染色体序列(NC_000016.9: 69151913-69154553)和 X染色体序列（NC_000023.11:44633469-44636065);
[0043] (4)1号染色体与Y染色体间的重复序列分别为1号染色体序列（202371840-202414823)和Y染色体序列（NC_000024.10:26328480-26365418)。
[0044] 本发明所述的巧光探针中，FAM指簇基巧光素，肥X指六氯-6-甲基巧光素，ROX指簇 基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ1和B册2是指巧光泽灭基团。本申请中，将试剂盒 的巧光标记的探针分别用FAM、肥X、R0X和CY5,但所用巧光标记并不限于所用到运几种巧光 标记，也可W采用现有技术中常用的其它巧光标记代替，可W达到一样的检测效果。
[0045] 本发明所述的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如阳性对照模 板、阴性对照模板、缓冲液、酶液、dNTP、Mg 2+等。
[0046] 与现有技术相比，本发明的特点在于：
[0047] 1、通过在染色体间相似序列的两端完全相同的DNA序列部位设计一对共同的扩增 引物，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它条件的干扰，从而保证了扩增 效率的一致性;并选择在具有碱基差异的DNA序列部位设计化qman探针，W便能通过重复片 段的相对实时巧光PCR的值精确检测两个序列的相对扩增量。
[004引 2、通过A组反应体系的21号和18号染色体间重复序列，W及13号和1号间染色体重 复序列实现了 13号、18号和21号染色体的数目的检测;通过B组反应体系的16号和X染色体 间重复序列，W及I号和Y染色体间重复序列实现了X和Y染色体的数目的检测。
[0049] 3、本发明所述试剂盒具有灵敏度高、特异性强和快速简便等优点。
【附图说明】
[0050] 图1为18号和21号染色体间的特异重复序列在染色体上的位置，其中，（a)为18号 染色体上的特异重复序列ChrlS在18号染色体上的位置，（b)为21号染色体上的特异重复序 列C虹21在21号染色体上的位置；
[0051] 图2为图1中21号染色体上的特异重复序列C虹21和18号染色体上的特异重复序列 C虹18, W及根据序列设计的公共引物和各自的化qman探针；
[0052] 图3为1号和13号染色体间的特异重复序列在染色体上的位置，其中，（a)为1号染 色体上的特异重复序列C虹1-1在1号染色体上的位置，（b)为13号染色体上的特异重复序列 C虹13在13号染色体上的位置；
[0053] 图4为图3中13号染色体上的特异重复序列chrl3和1号染色体上的特异重复序列 Chrl-I，W及根据序列设计的公共引物和各自的化qman探针。
[0054] 图5为X和16号染色体间的特异重复序列在染色体上的位置，其中，（a)为X染色体 上的特异重复序列Ch巧在X染色体上的位置，（b)为16号染色体上的特异重复序列Chrie在 16号染色体上的位置；
[0化5]图6为图5中16号染色体上的特异重复序列Chrie和X染色体上的特异重复序列 ChrX，W及根据序列设计的公共引物和各自的化qman探针；
[0056]图7为1号和Y号染色体间的特异重复序列在染色体上的位置，其中，（a)为1号染色 体上的特异重复序列chrl-2在1号染色体上的位置，（b)为Y染色体上的特异重复序列Ch巧 在Y染色体上的位置；
[0化7]图8为图7中1号染色体上的特异重复序列chrl-2和Y染色体上的特异重复序列 ChrY，W及根据序列设计的公共引物和各自的化qman探针。
【具体实施方式】
[0058] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，W更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于W下实施例。
[0059] 实施例1:采用本发明所述试剂盒对正常标本、待测13- =体标本、待测18- =体标 本、待测21体标本、待测47，XXY标本、待测45，X标本、待测47，XYY标本进行检测。
[0060] 1、重复序列的比对查询
[0061 ] 通过NCBI的Blast功能，对不同染色体上的序列进行比对，在其中找出目标染色体 和参考序列染色体上两条染色体特异的重复序列，并通过设计不同的引物对重复序列的特 异性进行验证，最后筛查出的重复序列如下：
[0062] (1)21号染色体与18号染色体间的重复序列分别为21号染色体序列（NC_ 000021.8:14678083-14695820; 29363117-29409417)和 18 号染色体序列（NC_0000018.10: 15042954-15089199)；
[0063] (2) 13号染色体与1号染色体间的重复序列分别为13号染色体序列（NC_ 000013.11:24678454-24692625)和 1 号染色体序列（NCJ)OOOOI . 10:79324763-79325050);
[0064] (3) 16号染色体与X染色体间的重复序列分别为16号染色体序列(NC_000016.9: 69151913-69154553)和 X染色体序列（NC_000023.11:44633469-44636065);
[00化](4)1号染色体与Y染色体间的重复序列分别为1号染色体序列（202371840-202414823)和Y染色体序列（NC_000024.10:26328480-26365418);
[0066] 2、试剂盒的组成：
[0067] 2. IA组反应体系
[0068] (1)检测21号和18号染色体的引物和探针：
[0069] 选择21号和18号染色体间的特异重复序列chr21和ChrlS为目标序列设计引物和 化qman探针，碱基序列组成如下：
[0070] 重复序列chr21和Chris的公共扩增引物：
[0071] C虹2i-i8-F:5'-GAAACAGGTCTAGGAGTG-3'（沈Q ID N0:1);
[0072] C虹2i-i8-R:5'-TGTAGCTTGATGTTTAGTAGG-3'（沈Q ID N0:2);
[0073] 检测重复序列C虹21的C虹21-p;robe 1:aqman探针：
[0074] c虹21-probe:FAM-5'-CATGTTATTCAGCTACTGCAATAT-3'-B册l(沈QIDN0:3);
[00"7日]检测重复序列C虹18的。虹18-91'〇66 1:aqman探针：
[0076] 〇虹18可的66:肥乂-5'-1'1'口'4〔4167^(：1'〔467^口'4〔4-3'-8册1(沈9 10備：4);
[0077] 重复序列C虹21和C虹18的碱基序列：
[007引 Chr21：GAAACAGGTCTAGGAGTGGATGGTGACCCCTTTCTACATGTTATTCAGCTACTGCAATATATG TTAATCAAGTTGAATAATATATGTCATTCAAACCTACTAAACATCAAGCTACA(SEQ ID N0：9)；
[00 巧]C虹18:GAAACAGGTCTAGGAGTGGATGGTGACCCCTTTCTACATGTTACTCAGTTACTACAATATATG TTAATCAAGTTGAATAATATATGTCATTCAAACCTACTAAACATCAAGCTACA(SEQ ID NO：10)；
[0080] 序列Chr21和Chris在染色体的定位如图I所示，重复序列的具体碱基序列W及相 应的引物和探针的设计如图2所示。
[0081] (2)检测13号和1号染色体的引物和探针：
[0082] 选择13号和1号染色体间的特异重复序列chrl3和Chrl-I为目标序列设计引物和 化qman探针，碱基序列组成如下：
[0083] 重复序列chrl3和Chrl-I的公共扩增引物：
[0084] C虹13-广F:5'-GAGGTGTGGAAAATCTAAG-3'（沈Q ID N0:5)
[00化]C虹13-广R:5'-GAGGGAATTTGAAGTGTTAG-3'（沈Q ID N0:6)
[00化]检测重复序列C虹13的。虹13-91'〇66 1:aqman探针：
[0087] 〇虹13可的66:〔￥5-5'-46141'口'1761'口'口'4口'6口'4(：-3'-8册2(沈9 10備：7);
[0088] 检测重复序列 C虹 l-lJtichrl-1-probe 1:aqman探针：
[0089] C虹l-1-probe:R0X-5'-AGCATCTTTGTTTCTACCGC-3'-B册2(沈Q ID N0:8);
[0090] 重复序列C虹13和C虹1-1的碱基序列：
[0091] C虹13:GAGGTGTGGAAAATCTAAGATCACAAATATGCCATGAGAAAGTATCTTTGTCTCTACTGCTAC TTTACAAAACCACGTCTCTAACTGCTAACACTTCAAATTCCCTC(沈Q ID N0:11);
[0092] C虹1-1:GAGGTGTGGAAAATCTAAGATCACAAATATGCCATGAGAAAGCATCTTTGTTTCTACCGCTA CTTTACAAAACCACATCTCTTACTACTAACACTTCAAATTCCCTC(沈Q ID N0:12);
[0093] 序列C虹13和Chrl-I在染色体的定位如图3所示，重复序列的具体碱基序列W及相 应的引物和探针的设计如图4所示。
[0094] (3)Hots化r-hq酶，缓冲液，dATP、dTTP、dCTP和dGTPW及Mg2+等均购自北京康为世 纪生物科技有限公司。
[00巧]2.2B组反应体系
[0096] (1)检测16号和X染色体的引物和探针：
[0097] 选择16号和X染色体间的特异重复序列Chrie和(：11扣为目标序列设计引物和 化qman探针，碱基序列组成如下：
[009引重复序列C虹16和C虹X的公共扩增引物：
[0099] C虹i6-x-F:5'-GTCCATCTCCCTGTTCTG-3'（沈Q ID N0:13);
[0100] C虹i6-x-R:5'-GCTCACTGCTCTCTAGAA-3'（沈Q ID N0:14);
[0101 ] 检测重复序列C虹16的。虹16-91'〇66 1:aqman探针：
[0102] C虹16-probe:CY5-5'-AACGGACCATGCTTCCGTA-3'-B册2(沈Q ID N0:15);
[0103] 检测重复序列C虹X的C虹X-probe 1:aqman探针：
[0104] 油巧可的6:30乂-5'-44口'64〇：4口'口7〇：4146口'(：-3'-8册2(沈9 10備：16);
[01化]重复序列C虹16和C虹X的碱基序列：
[0106] C虹16:GTCCATCTCCCTGTTCTGTGTTCAAGCCCCCAGGGAAAGGTATGGCAGTAGAGGATGACCAGG TCCAAGCTGCCCAGGTCAGAGCTACGGAAGCATGGTCCGTTCACCAACGCCACGTTTCTAGAGAGCAGTGAGC(沈Q ID N0：21)；
[0107] C虹X:GTCCATCTCCCTGTTCTGTGTTCAAGCCCCCAGGGAAAGGTATGGCAGTTGAGGATGACCAGTT CCAAGCTGCCCAGGTCAGAGCTATGGAAGAATGGTCAGTTCACCAATGCCACGTTTCTAGAGAGCAGTGAGC(沈Q ID NO：22)；
[010引序列C虹16和Ch巧在染色体的定位如图5所示，重复序列的具体碱基序列W及相应 的引物和探针的设计如图6所示。
[0109] (2)检测1号和Y染色体的引物和探针：
[0110] 选择1号和Y染色体间的特异重复序列chrl-2和(：11巧为目标序列设计引物和 化qman探针，碱基序列组成如下：
[0111] 重复序列C虹1-2和C虹Y的公共扩增引物：
[0112] C虹i-y-F:5'-GCTTGTTTAGCCTGCTTC-3'（沈Q ID N0:17);
[0113] C虹i-y-R:5'-GCCCACTTATAAAACTGTTTC-3'（沈Q ID N0:18);
[0114] 检测重复序列C虹1-2的。虹1-2-91'〇66 1:aqman探针：
[0115] C虹l-2-probe:HEX-5'-ACTTCAACACCATACCTCTACACA-3'-B册1(沈Q ID N0:19);
[0116] 检测重复序列C虹Y的C虹Y-probe 1:aqman探针：
[0117] c虹Y-probe:FAM-5'-ACTTCAACATCACGCCTCTACA-3'-B册l(沈QIDN0:20);
[0118] 重复序列C虹1-2和C虹Y的碱基序列：
[0119] Chr1-2：GCTTGTTTAGCCTGCTTCCCAAGAAAAGGAAAGACCTATCTCTCTGGAAGGTTTAGCATAGC TCTGTGTAGAGGTATGGTGTTGAAGTTCATGTCCCTGGAAACAGTTTTATAAGTGGGC(沈Q ID N0:23);
[0120] C虹Y:GCTTGTTTAGCCTGCTTCCCAAGAAAAGGAAAGACCTATCTCTCTGGAAGATTTAGCATAGTTC TGTGTAGAGGCGTGATGTTGAAGTTCATGACCCTGGAAACAGTTTTATAAGTGGGC(沈Q ID N0:24);
[0121] 序列chrl-2和Ch巧在染色体的定位如图7所示，重复序列的具体碱基序列W及相 应的引物和探针的设计如图8所示。
[0122] (3)Hots化r-hq酶，缓冲液，dATP、dTTP、dCTP和dGTPW及Mg2+等均购自北京康为世 纪生物科技有限公司。
[0123] 3、PCR反应体系的配制：
[0124] 3. IA组PCR的反应体系的配制
[0125] 按下述表1配制PCR反应体系：
[0126] 表1: (ml表示mm〇l/L，]iM表示皿ol/L)
[0129] PCR反应体系为50uL。
[ni07l [
[0130] 4、样本的来源及处理
[0131] 样本来源于经传统的染色体核型分析方法确定核型的DNA样本，DNA样本采用实验 室常规DNA提取方法进行提取，W双蒸水稀释至20ngAiL，并于-20°C保存备用。
[0132] 5、PCR扩增程序：
[0133] PCR反应所用仪器为CFX96实时巧光定量PCR仪。PCR反应程序为：95°C预变性 IOmin;95°C 15sec，60°CImin，40个循环，于60°C退火步骤末采集巧光信号，在反应结束后， 仪器分别记录每个样本每种巧光的CT值，即CTfam值、CTct日值、CTiwx值和CThex值。
[0134] 6、结果检测与分析：
[0135] W2_[a(ct目标割-CT魏献说寺獅体-AKT目标執W惨D頭D正稱邪雕H二2-AACT的值来分析目标染色 体的数目，具体分析如下：
[0136] 6. IA组反应体系
[0137] 通过21号染色体与18号染色体的相对定量值的不同分布区间，可判断出 该标本是正常标本、21-=体标本或是18-=体标本;通过13号染色体与1号染色体的相对定 量值的不同分布区间，可判断出该标本是正常标本或是13-立体标本。
[0138] 正常标本的21号染色体与18号染色体的理论值为体标本的21号 染色体与18号染色体的理论值为1.5; 18-S体标本的18号染色体与21号染色体的 2-AAeT2i-i增论值为2/3。正常标本、21-立体或18-立体标本间的2-^et值无交叉重叠，通过2 AAeT值的区间范围即能判断待测标本的21号和18号染色体的数目。
[0139] 正常标本的13号染色体与1号染色体的理论值为l;13-s体标本的13号 染色体与1号染色体的理论值为1.5。正常标本与13-立体标本间的2AAGT值无交叉 重叠，通过值的区间范围即能判断待测标本的13号染色体的数目。
[0140] 6.2B组反应体系
[0141] 通过16号染色体与Y染色体的相对定量2AAET1W(值的不同分布区间，可判断出该 标本是正常标本或是X染色体数目异常的标本；通过1号染色体与Y染色体的相对定量2 AAeTW值的不同分布区间，可判断出该标本是正常标本或是Y染色体数目异常的标本，所有 样本的正常参考样本均为正常男性样本。
[0142] 正常男性标本的16号染色体与X染色体的理论值为1;正常男性标本的1 号染色体与Y染色体的理论值为1。
[0143] 正常女性标本的16号染色体与X染色体的理论值为2;正常女性样本的Y 染色体的序列没有扩增，因此，Y = 0。
[0144] 因此，通过16号与X染色体，1号与Y染色体间重复序列的相对定量2AAET值的区间 范围即能判断待测标本的X染色体和Y染色体的数目。
[014日]6.3传统细胞遗传学分析
[0146]检测的临床正常核型标本(染色体核型结果表示为46，XX或46，XY，46表示正常人 的染色体数目；XX表示正常女性的两条性染色体;XY表示正常男性的两条性染色体）；染色 体核型为47，乂乂，+21或47，乂￥，+21，47表示染色体的数目，乂乂或乂￥表示正常的性染色体，+21 表示多了一条21号染色体;染色体核型为47，XX，+18或47，XY，+18,47表示染色体的数目，XX 或XY表示正常的性染色体，+18表示多了一条18号染色体；染色体核型为47，XX，+13或47， XY，+13,47表示染色体的数目，XX或XY表示正常的性染色体，+13表示多了一条13号染色体； 染色体核型为45，X，45表示染色体的数目，X表示只有一条性染色体;染色体核型为47，XXY， 染色体数目为47条，XXY表示多了一条X性染色体。
[0147] 实验结果显示，试剂盒的检测体系与传统细胞遗传学分析一致，能非常有效检测 出21号、18号、13号、X和Y染色体的数目，因此，本发明所述试剂盒能用于临床标本的检测。
[0148] 实施例2:用实施例1所述试剂盒、方法、步骤等对临床标本进行检测
[0149] 采用试剂盒对33例正常标本，12例21-S体标本，3例13-S体标本，6例18-S体标 本，3例45，X样本，2例47，XXY样本，1例47，XYY样本进行检测，所有样本均来源自经传统的染 色体核型分析方法确定核型的DNA样本。
[0150] 通过21号染色体与18号染色体间的重复序列的值判断21号染色体和18号染 色体的拷贝数。
[0151] 通过13号染色体与1号染色体间的重复序列的值判断13号染色体的拷贝数。
[0152] 通过16号和X染色体间的重复序列的值判断X染色体的拷贝数。
[0153] 通过1号和Y染色体间的重复序列的值判断Y染色体的拷贝数。
[0154] A组反应体系对21号染色体、18号染色体及13号染色体的检测结果和传统细胞遗 传学分析检测结果见表3。
[0155] 表3:A组反应体系的值结果和细胞遗传学分析结果
[0157]
[0158」B組反应体《对X梁芭体和Y梁芭体的检测结呆和传统细胞遗传字分化检测结呆见 表4。
[0159]表4:B组反应体系的值结果和细胞遗传学分析结果
[01A91
[0163]实验结果表明，我们开发的多重相对定量PC时式剂盒能有效、快速、准确的检测出 21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体的数目，检测结果与传统的染色 体核型分析方法一致，准确率为100%，结果可读性好，分析、检测过程简单、高效。
【主权项】
1. 一种快速检测人染色体数目的多重相对实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括A组反应 体系和/或B组反应体系，其特征在于： 所述A组反应体系中的扩增检测试剂包括： (1) 同时扩增21号染色体特异重复序列chr21与18号染色体特异重复序列chrlS的引物 对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示； (2) 特异性检测21号染色体特异重复序列chr21的Taqman探针chr21_Probe，其碱基序 列如SEQ ID NO:3所示； (3) 特异性检测18号染色体特异重复序列chr 18的Taqman探针chr 18-Probe，其碱基序 列如SEQ ID NO:4所示； (4) 同时扩增13号染色体特异重复序列chrl3与1号染色体特异重复序列chrl-1的引物 对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示； (5) 特异性检测13号染色体特异重复序列chr 13的Taqman探针chr 13-Probe，其碱基序 列如SEQ ID NO:7所示； (6) 特异性检测1号染色体特异重复序列chr 1-1的Taqman探针chr l-1-Probe，其碱基序 列如SEQ ID NO:8所示。 所述B组反应体系中的扩增检测试剂包括： (1) 同时扩增16号染色体特异重复序列chrl6与X染色体特异重复序列chrX的引物对， 它们的碱基序列分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示； (2) 特异性检测16号染色体特异重复序列chr 16的Taqman探针chr 16-Probe，其碱基序 列如SEQ ID NO: 15所示； (3) 特异性检测乂染色体特异重复序列〇114的13卩11^11探针〇114-?1'(^6，其碱基序列如 SEQ ID NO: 16所示； (4) 同时扩增1号染色体特异重复序列chrl-2与Y染色体特异重复序列chrY的引物对， 它们的碱基序列分别如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示； (5) 特异性检测1号染色体特异重复序列chr 1-2的Taqman探针chr l-2-Probe，其碱基序 列如SEQ ID NO: 19所示； (6) 特异性检测Y染色体特异重复序列chrY的Taqman探针chrY-Probe，其碱基序列如 SEQ ID NO:20所示。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:A组反应体系中，所述21号染色体特异重 复序列chr21与18号染色体特异重复序列chrlS为两个相似序列，其中，21号染色体特异重 复序列chr21的碱基序列如SEQ ID N0:9所示，18号染色体特异重复序列chrlS的碱基序列 如SEQ ID NO: 10所示。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:A组反应体系中，所述13号染色体特异重 复序列chrl3与1号染色体特异重复序列chrl-Ι为两个相似序列，其中，13号染色体特异重 复序列chrl3的碱基序列如SEQ ID勵:11所示，1号染色体特异重复序列^^1-1的碱基序列 如SEQ ID NO: 12所示。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:A组反应体系中， 所述Taqman探针chr21_Probe的5 '端标记FAM，3 '端标记BHQ1; 所述Taqman探针chr 18-Probe的5 '端标记HEX，3 '端标记BHQ1; 所述Taqman探针chr 13-Probe的5 '端标记CY5，3 '端标记BHQ2; 所述Taqman探针chr l-1-Probe的5 '端标记ROX，3 '端标记BHQ2。5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:B组反应体系中，所述16号染色体特异重 复序列chrl6与X染色体特异重复序列chrX为两个相似序列，其中，16号染色体特异重复序 列chrl6的碱基序列如SEQIDN0 :21所示，X染色体特异重复序列chrX的碱基序列如SEQID NO: 22所示。6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:B组反应体系中，所述1号染色体特异重 复序列chrl-2与Y染色体特异重复序列chrY为两个相似序列，其中，1号染色体特异重复序 列chrl-2的碱基序列如SEQ ID N0:23所示，Y染色体特异重复序列chrY的碱基序列如SEQ ID NO :24所示。7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:B组反应体系中， 所述Taqman探针chr 16-Probe的5 '端标记CY5，3 '端标记BHQ2; 所述Taqman探针chrX-Probe的5 '端标记R0X，3 '端标记BHQ2; 所述Taqman探针chr 1-2-Probe的5 '端标记HEX，3 '端标记BHQ1; 所述Taqman探针chrY-Probe的5 '端标记FAM，3 '端标记BHQ1。8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:该试剂盒可实现对13号、18号、21号、X和 Y染色体的检测，还可实现对1号和16号染色体的非整倍体进行筛查。9. 根据权利要求1-8中任一项所述的试剂盒，其特征在于:试剂盒中的重复序列公共扩 增引物来源于以下重复序列： (1) 21号染色体与18号染色体间的重复序列分别为21号染色体序列NC_000021.8: 14678083-14695820; 29363117-29409417和 18号染色体序列NC_0000018.10:15042954-15089199； (2) 13号染色体与1号染色体间的重复序列分别为13号染色体序列％_000013.11: 24678454-24692625 和 1 号染色体序列NC_000001 · 10:79324763-79325050; (3) 16号染色体与X染色体间的重复序列分别为16号染色体序列NC_000016.9 : 69151913-69154553 和 X染色体序列NC_000023.11:44633469-44636065; (4) 1号染色体与Y染色体间的重复序列分别为1号染色体序列202371840-202414823和 Y染色体序列NC_000024 · 10:26328480-26365418。
【文档编号】C12Q1/68GK105861699SQ201610320505
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】孙雷
【申请人】孙雷