评价eb病毒阳性鼻咽癌dna损伤修复能力和放疗预后的生物标志物及应用
【专利摘要】本发明公开了评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后的生物标志物及应用。所述生物标志物为磷酸化的DNA?PK和AMPK，优选为为磷酸化的DNA?PK Thr2609和AMPK Thr172。所述生物标志物可用于制备评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后检测药物和试剂盒。
【专利说明】
评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后的生物标志物及应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物标志物，具体是将参与D N A损伤反应的D N A蛋白激酶(D N A -activated protein kinase，DNA-PK)和AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)磷酸化水平作为评价EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后的生物标志物。
【背景技术】
[0002]DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)通过多条信号传导通路来检测和传递DNA损伤信号，启动细胞周期关卡点，进行DNA损伤修复或激活细胞凋亡，维持基因组的稳定性和细胞内稳态。细胞DNA损伤修复能力缺陷是肿瘤发病的重要机制。DNA损伤未被修复或错误地修复可能引起基因组的不稳定性，导致肿瘤的发生；同时DNA损伤修复的异常涉及到肿瘤对放化疗的敏感性。对DNA损伤修复机制研究的成果正在转化为肿瘤治疗的新靶点。
[0003]DNA双链断裂是真核细胞最严重的一种DNA损伤，也是电离辐射对染色体所产生的最关键的致死性损伤。非同源末端重组(nonhomologous end_joining，NHEJ)是人类体细胞修复DNA双链断裂的主要途径，DNA-PK是NHEJ的中心分子。
[0004]AMPK是一个丝氨酸苏氨酸激酶，其主要功能是感受细胞能量状态的变化、维持细胞代谢稳态。最新的研究发现AMPK在DDR中具有重要作用，多种肿瘤中存在DNA-PK和AMPK的异常表达及两者的相互作用。
[0005]鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤，年发病率为(10—25)/10万，死亡率占全国恶性肿瘤死亡率的2.81%，其中EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)阳性鼻咽癌占80%以上。
[0006]EBV属于人类γ疱疹病毒，是第一个被证实和人类肿瘤发病直接相关的DNA致瘤病毒。EB病毒感染相关肿瘤约占全球恶性肿瘤的1.5 %，占所有感染相关性肿瘤的5.6%，目前尚无EBV疫苗。EB病毒感染是鼻咽癌发病的重要病因。
[0007]EBV潜伏感染期编码的膜蛋白EBV-LMPl是重要的癌基因JBV-LMP1介导宿主细胞的增殖、侵袭转移并对抗凋亡，显著促进肿瘤细胞的放射抗拒性。阐明EBV-LMPI对DNA损伤反应的调控机理，有助于发现鼻咽癌治疗和预后的新靶点。
【发明内容】
[0008]本发明旨在克服现有技术的不足，提供评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后的生物标志物及应用。所述生物标志物为磷酸化的DNA-PK和AMPK，优选为磷酸化的DNA-PK Thr2609和AMPK Thrl72。所述生物标志物可用于制备评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后检测药物和试剂盒。
[0009]下面对本发明作进一步说明:
[0010]本发明确定了EBV-LMPI调控鼻咽癌DNA损伤反应新的分子机制，明确DNA-PK和AMPK磷酸化水平的降低与EBV阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力及鼻咽癌患者放疗预后的相关性，评价两者作为新的生物标志物的可行性。
[0011]本发明利用γ-Η2ΑΧ分析技术检测鼻咽癌细胞DNA双链断裂修复能力，发现EBV-LMPl阳性细胞的DNA双链断裂修复能力受到明显抑制。
[0012]通过对DNA双链断裂修复的中心分子DNA-PK蛋白磷酸化水平检测，发现EBV-LMPl可以显著降低DNA-PK Thr2609磷酸化水平及其介导的细胞DNA损伤修复能力；同时EBV-LMPl减少DNA-PK与AMPK的结合，使鼻咽癌细胞AMPK Thrl72磷酸化水平降低，活化AMPK后可以显著逆转EBV-LMPl阳性鼻咽癌细胞的放射抗性。
[0013]采用免疫组化方法发现鼻咽癌组织中的γΗ2ΑΧ水平较正常鼻咽上皮显著升高，而DNA-PK Thr2609磷酸化水平明显降低，两者存在负相关性，提示DNA-PK Thr2609水平的降低抑制了 EBV阳性鼻咽癌细胞的DNA损伤修复能力。
[0014]用免疫组化方法检测鼻咽癌组织中的AMPK Thrl72磷酸化水平亦显著降低，DNA-PK Thr2609与AMI3K Thrl72磷酸化水平均与EBV-LMPl的表达存在负相关性；对DNA-13KThr2609和AMPK Thrl72与鼻咽癌患者放疗后的5年生存率进行相关分析发现，AMPK Thrl72阴性患者的5年生存率显著降低，提示AMPK Thrl72磷酸化水平是评价鼻咽癌患者放疗预后的一个新的生物标志物。
[0015]总之，本发明的研究发现鼻咽癌细胞中DNA双链断裂修复能力显著低于正常鼻咽上皮，同时DNA-PK Thr2609和AMPK Thr172的表达降低，并与EBV编码的潜伏膜蛋白I(latent membrane protein I，LMP1)水平呈负相关。EBV-LMPI^fDNA-PK Thr2609磷酸化的抑制是细胞DNA双链断裂修复能力降低的重要分子基础，对DNA-PK与AMPK结合的抑制是AMPK Thr172低表达的原因之一，活化AMPK可以逆转EBV-LMPI介导的鼻咽癌细胞放射抗性，AMPK Thrl72水平与患者放疗后的5年生存率存在显著的正相关性。因此，鼻咽癌组织中DNA-PK Thr2609的低表达可以用于评估DNA双链断裂修复能力，AMPK Thrl72磷酸化水平可以用于预测鼻咽癌患者的放疗预后。
【附图说明】
[0016]图1采用Western Blot检测γ -Η2ΑΧ评价EBV-LMP1对鼻咽癌细胞DNA双链断裂修复能力的影响，Α显示CNE1-LMP1细胞的γ -Η2ΑΧ水平较0肥1细胞升高;8显示!1他2-11031细胞的γ -Η2ΑΧ水平较ΗΝΕ2细胞升高；
[0017]图2采用Western Blot检测稳定表达LMPl和敲除LMPl的鼻咽癌细胞磷酸化DNA-PKThr2609的水平，A显示CNE1-LMP1细胞的DNA-PK Thr2609水平较CNEl细胞降低，敲除LMPl后升高;B显示HNE2-LMP1细胞的DNA-PK Thr2609水平较HNE2细胞降低，敲除LMPl后升高；
[0018]图3采用免疫共沉淀方法检测DNA损伤诱导的鼻咽癌细胞DNA-PK与AMPK的结合，A显示CNE1-LMP1细胞中DNA-PK与AMPK的结合较CNEl细胞减少;B显示HNE2-LMP1细胞中DNA-13K与AMPK的结合较HNE 2细胞减少；C显示EB V-LMPI抑制鼻咽癌细胞DNA损伤诱导的AMPKThrl 72磷酸化;
[0019]图4采用克隆形成试验，绘制细胞的存活曲线检测活化AMPK后对EBV-LMPI阳性鼻咽癌细胞放射敏感性的影响，A显示二甲双胍显著促进CNE1-LMP1细胞的放射敏感性;B显示二甲双胍显著促进HNE2-LMP1细胞的放射敏感性；
[0020]图5采用免疫组化方法检测鼻咽癌和正常鼻咽上皮EBV-LMPl、γ _H2AX、DNA_PKThr2609和AMPK Thrl72的表达情况。其中easel是正常鼻咽上皮，case2和case3分别是低表达EBV-LMPl和高表达EBV-LMPl的鼻咽癌组织；
[0021]图6根据鼻咽癌组织DNA-PK Thr2609和AMPK Thrl72表达的免疫组化结果，将患者分为阴性和阳性表达组，采用Kaplan Meier法分别分析其与患者5年生存率的关系。
【具体实施方式】
[0022]本发明所用鼻咽癌细胞系CNEl细胞为中国医学科学院肿瘤研究所建系，CNEl-LMP1、HNE2、HNE2-LMP1细胞为中南大学肿瘤所建系。
[0023]实施例1 EBV-LMPl抑制鼻咽癌细胞DNA双链断裂修复
[0024]H2AX蛋白是真核细胞中H2A组蛋白家族中的成员，其羧基末端包括一个139位为丝氨酸残基的丝氨酸一谷氨酰胺一谷氨酸(Ser—Gin—Glu，SQE)结构域，能够被PI3K激酶家族包括ATM，ATR，DNA-PK磷酸化，即γ -H2AX0H2AX Serl39位磷酸化是电离辐射或化学药物导致DNA双链断裂的一个早期事件，在断裂处形成γ -Η2ΑΧ foci，招募DNA损伤识别和修复蛋白。目前认为γ -Η2ΑΧ是检测DNA双链断裂敏感性和特异性最高的指标之一。通过对γ -Η2ΑΧ的Western Blot检测，明确EBV-LMPl对鼻咽癌细胞DNA双链断裂修复的影响。
[0025]实验方法如下:鼻咽癌细胞在6孔板中培养，至70?80%融合时，采用6-MV的X线照射4Gy以诱导DNA双链断裂，在照射后0.5h，Ih，4h和24h抽提细胞总蛋白，置于-20°C冻存。待各时间点蛋白收集完成后进行γ -Η2ΑΧ的Western Blot分析。
[0026]结果显示，在X线照射后0.5h，Ih，4h和24h，2株EBV-LMPl阳性细胞中的γ Η2ΑΧ水平较EBV-LMPl阴性细胞升高，提示EBV-LMPl可以抑制鼻咽癌细胞的DNA双链断裂修复。结果见图1。
[0027]实施例2 EBV-LMPl抑制鼻咽癌细胞DNA-PK磷酸化
[0028]DNA-PK Thr2609的磷酸化是其在DNA双链断裂修复中发挥作用的关键，通过对稳定表达LMPl和敲除LMPl鼻咽癌细胞中DNA-PK Thr2609的Western Blot检测，明确EBV-LMPl对鼻咽癌细胞DNA-PK磷酸化的调控。
[0029]实验方法如下:鼻咽癌细胞在6孔板中培养，EBV-LMPl阳性细胞转染LMPl的siRNA后继续培养48小时，然后采用6-MV的X线照射4Gy，在照射后0.5h抽提细胞总蛋白，进行DNA-PK Thr2609的Western Blot分析。
[0030]结果显示，在2株EBV-LMPl阳性细胞中，EBV_LMP1可以抑制DNA-PK Thr2609的磷酸化，采用特异性靶向LMPl的siRNA减少其表达后促进了DNA-PK Thr2609的磷酸化。结果见图2。
[0031 ] 实施例3 EBV-LMPl抑制鼻咽癌细胞DNA-PK与AMPK的结合，减少AMPK的磷酸化
[0032]采用免疫共沉淀法检测DNA损伤诱导的DNA-PK与AMPK的物理结合以及EBV-LMPl对这种结合的调控，通过Western Blot检测DNA损伤诱导的AMPK Thr172磷酸化。
[0033]实验方法如下:鼻咽癌细胞在1cm培养皿中培养，当细胞达到90%的融合时，予6_MV的X线照射4Gy，在照射后0.5h抽提细胞总蛋白，首先进行预清除以去除全蛋白裂解液中可以和珠子结合的非特异性蛋白:①取A-sepharose珠子悬液20ul，离心去除上清，冰冷的IXI3BS洗三次。②每个实验组准备全蛋白裂解液I OOOug，加入20u I已清洗过的珠子，4°C转摇l-2h，4°C离心14000gX10min，转移上清至新的EP管中。然后进行免疫共沉淀:①加入2ugDNA-PK抗体至上清中，4°C振摇上清和抗体的混合液过夜。②混合液总加入20ul清洗过的A-sepharose珠子，4 °C振摇2h。③收集A-sepharose珠子，12000rpm离心5S，去上清，珠子用IP lysis buffer清洗5次。④重悬珠子在20ul5 X loading buffer中，混勾。⑤珠子煮沸5min，解离珠子上的蛋白，离心14000g X 5min。⑥转移上清至新的EP管中，上样，SDS-PAGE凝胶电泳。同时取照射后0.5h抽提的细胞总蛋白进行AMPK Thrl72的Western Blot检测。
[0034]结果显示，在鼻咽癌细胞中X线所致的DNA双链断裂可以诱导DNA-PK与AMPK的物理结合，EBV-LMPl显著抑制了这种结合，同时减少了DNA损伤诱导的AMPK Thr172的磷酸化。结果见图3。
[0035]实施例4活化AMPK后促进EBV-LMPl阳性鼻咽癌细胞放射敏感性
[0036]采用克隆形成试验，计算细胞的存活分数并绘制存活曲线，检测用二甲双胍活化AMPK后对EBV-LMPl阳性鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。
[0037]实验方法如下:取指数生长期的细胞，0.25%胰酶消化成单细胞悬液。梯度倍数稀释将12?15个细胞种植到直径3CM的6孔板中，不同细胞数对应不同的照射剂量。每个剂量设3个平行孔。照射前I小时培基中加入二甲双胍(5μΜ)，使用Siemens primus.E电子直线加速器照射，剂量率2Gy/min，照射时覆盖I?1.5cm厚组织胶。细胞接受照射后，继续培养10?14天，肉眼见克隆形成时终止培养。弃培养基，用P B S洗2次。甲醇固定15 m i η，结晶紫染色1min，流水冲洗染色液，空气干燥。计数每个培养孔中的克隆数，>50个细胞数为一个克隆，计算每组均值。计算每种细胞的存活分数(surviving fract1n,SF)值。利用Graphpadpr ism软件，采用单击多靶模型拟合每种细胞的存活曲线。
[0038]结果显示:AMPK的激动剂二甲双胍可以显著减少细胞的存活分数，促进EBV-LMPl阳性鼻咽癌细胞的放射敏感性，结果见图4。
[0039]实施例5 DNA-PK Thr2609磷酸化水平降低抑制EBV-LMPl阳性鼻咽癌组织DNA损伤修复能力
[0040]采用免疫组化的方法在60例鼻咽癌和15例正常鼻咽上皮的组织样本中检测EBV-LMPU γ-Η2ΑΧ,DNA-PK Thr2609和AMPK Thr 172的表达情况，明确其在正常鼻咽上皮与肿瘤中的表达差异。
[0041]实验方法如下:将组织芯片在80°C恒温箱中烘烤30分钟，然后置于松节油中浸泡5分钟，更换松节油后再浸泡5分钟;再依次放入无水乙醇、95 %乙醇和80 %乙醇中各浸泡5分钟。然后将芯片置于0.0lM枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)放入微波炉内高火加热置沸腾，然后改用中低火继续加热10?15分钟。PBS洗5分钟X 3次，滴加3%H2O2中室温静置10分钟，PBS洗5分钟X 3次，滴加一抗50yL，4°C湿盒过夜。37 0C复温45分钟，PBS洗5分钟X 3次，滴加二抗40?50yL，室温静置I小时，PBS洗5分钟X 3次，DAB显色5?10分钟(在显微镜下掌握染色程度)，自来水冲洗10分钟，苏木素复染I?2分钟(在显微镜下掌握染色程度)，自来水冲洗10?15分钟，干燥，中性树脂封片后阅片。免疫组化评分参考许良中的判断标准:根据着色的强弱程度评分:无着色O分，淡黄色I分，棕黄色2分，棕褐色3分;同时按阳性细胞所占的百分比计分:阳性细胞率< 10%为I分，阳性细胞率>10%且< 50%为2分，阳性细胞率>50%且<75 %为3分，阳性细胞率>75 %为4分。利用SPSS 16.0软件分析免疫组织化学结果，相关性分析采用Spearman法，用Log-rank计算p值得出统计学差异。
[0042]结果显示:鼻咽癌组织中的EBV-LMPl表达明显高于正常鼻咽上皮(p = 0.001)，而DNA-PK Thr2609和AMPK Thrl72磷酸化水平普遍降低(p<0.05)，并与EBV-LMPI的表达存在负相关性；鼻咽癌组织中的γΗ2ΑΧ水平较正常鼻咽上皮显著升高(p = 0.0005)，与DNA-PKThr2609磷酸化水平存在负相关性。DNA-PK Thr2609磷酸化水平的降低抑制EBV-LMPl阳性鼻咽癌细胞的DNA损伤修复能力。结果见图5。
[0043]实施例6 DNA-PK Thr2609和AMPK Thrl72磷酸化水平预测鼻咽癌患者放疗预后
[0044]在上述免疫组化的基础上，根据DNA-PK Thr2609和AMPK Thrl72的表达情况将患者分为阴性表达和阳性表达组，分别分析其与患者放疗后5年生存率的关系，明确两者与鼻咽癌患者放疗预后的关系。
[0045]实验方法如下:免疫组化方法和评分标准同上，利用SPSS16.0软件分析免疫组织化学结果，总生存期采用Kaplan Meier法进行分析，用Log-rank计算p值得出统计学差异。
[0046]结果显示:DNA-PKThr2609和AMPK Thrl72之间存在正相关性(p = 0.000) ;DNA_PKThr2609阴性组和阳性组的5年生存率分别为66.67%和70.37% (p = 0.757)，单因素分析显示DNA-PK Thr2609与患者的5年生存率无显著相关性;而AMPK Thrl72阴性组和阳性组的5年生存率分别为53.57%和78.26% (p = 0.037)，单因素分析显示AMPK Thrl72与患者的5年生存率存在显著相关性。提示虽然单独的DNA-PK Thr2609水平不能评价鼻咽癌患者的预后，但通过与其相互作用的AMPK Thrl72水平的检测，可以预测患者的生存期。结果见图6。
【主权项】
1.评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为磷酸化的DNA-PK和AMPK。2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为磷酸化的DNA-PKThr2609和AMPK Thrl72。3.权利要求1或2所述生物标志物在制备评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后检测药物中的应用。4.权利要求1或2所述生物标志物在制备评价EB病毒阳性鼻咽癌DNA损伤修复能力和放疗预后检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105861705SQ201610327552
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】曹亚, 卢景琛
【申请人】中南大学