Braf基因突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种Braf基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中Braf基因Exon15号外显子的特异性引物，长度在21?25个碱基，引物序列分别是SEQ ID Nos：1?2；（2）用于测序PCR的测序引物，用于对Braf基因Exon15号外显子c. 1799T>A,p. V600E突变位点进行测序分析，引物序列是SEQ ID No：3；（3）1个装有Braf野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本利用Sanger测序法检测出样本中Braf基因主要突变位点的状态。
【专利说明】
Braf基因突变检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及一种试剂盒，具体设及一种肿瘤相关基因化af基因突变检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] BRAF (B-type Raf kinase)基因属于RAF家族成员，位于染色体7q：34,大小为 190Kb，含有屯个转录区，包括18个外显子，编码一个67KD-99KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激 酶，参与细胞的增殖、分化和调亡。2002年化Vie等在66%的恶性黑色素瘤和一系列的其它 肿瘤中检测到BRAF基因体细胞突变，该突变主要见于BRAF基因11和15外显子的激酶结 构域内，80% W上的突变都是15外显子1799位核巧酸上的单碱基颠换，致使其编码的氨基酸 由鄉氨酸转变为谷氨酸。之后，不同国家和地域的学者在甲状腺乳头状癌(Papilla巧thyroid cancer，PTC)中检测到了BRAF V600E突变。由于该突变中在599位的苏氨酸活化性憐酸化 位点附近插入了一个负性调节残基，可模拟活化区域的憐酸化过程，使BRAF基因与维持其 失活态的ATP结合环活化区的联系中断，从而级联式激活，并通过RAS-RAF-MEK-MAPK激酶 信号传导通路而引起细胞的异常增殖和分化.最终导致肿瘤的形成。
[0003] BRAF突变发生在近8%人类肿瘤中，BRAF基因可在甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、 肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中发生突变。文献报道的突变位点主要有位于15号外显子的V600E S616F(C1847T)、K6(nE(A1801G)、D594G(A1781G)及串联突变 V600K(G1798A、T1799A)及位于 11号外显子的G466R(G1396A)，将近90%是V600E突变。检测BRAF基因突变，对判断肿瘤的发 生和发展后W及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义。（1)正常人血检中出现BRAF基因异常， 提示存在肿瘤易感性；（2)大量研究表明，无 BRAF基因突变的结直肠癌等肿瘤患者，经帕尼 单抗和爱比妥祀向药物治疗疗效明显，因此，通过检测BRAF基因突变状态可W筛选用药人 群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。因此，运种检测为临床医生用药提供指 导和依据，降低医生治疗风险W及患者经济负担。
[0004] 据统计，约15%的结肠癌患者中存在体细胞BRAF基因突变，绝大部分突变发生于 外显子15上的1799位核巧酸上，导致其编码的鄉氨酸由谷氨酸取代(V600E)。目前针对BRAF 的祀向药物主要有爱必妥或帕尼单抗，美国国家癌症综合治疗联盟《结直肠癌临床实践指 南KV3.2011)建议，在使用爱必妥(cetuximab)或帕尼单抗(Panitumumab)等祀向药物时， 须检测肿瘤组织KRAS基因状态，如果KRAS无突变，应考虑检测BRAF基因状态。一项对结直肠 癌（mCRC)患者的研究证实，KRAS基因野生型的状态下，BRAF基因野生型的患者使用 Ce化ximab+FOLFIRI药物疗效最好，总生存期显著延长。
[0005] 在黑色素瘤患者的治疗方面，BRAF基因在原发性黑素瘤中突变率为80%、在转移 性黑色素瘤中突变率为68%、在良性捷中的突变率高达82%。针对BRAF基因突变所研发的 新型勒1向药物Vemuraf en;Lb对于BRAF基因突变阳性患者疗效显著。Vemurafenib是由制药巨 头一瑞±罗氏公司和Plexxikon公司联合研发的一种治疗伴BRAF V600E突变的转移性黑色 素瘤的新药，其本质就是一种BRAF激酶抑制剂，它能特异性的降低黑色素瘤细胞活化产物 的表达，而不影响正常的组织，从而能够快、准、狠的杀死肿瘤细胞。经第1期和第2期临床试 验已证实其对伴BRAF V600E突变的转移性黑色素瘤患者的反应率超过50%。它是目前唯一 一个被证实与标准化疗方案相比可同时改善BRAF V600E基因突变型黑色素瘤患者的有效 率、无进展生存期和总生存率的药物。因此，通过检测BRAF基因的突变情况来为临床医生用 药提供科学依据，降低医生治疗风险W及患者经济负担。
[0006] 甲状腺癌根据其组织学类型可分为乳头状癌（PTC)，滤泡状癌（FTC)，未分化癌 (ATC)和髓样癌(MTC)，其中WPTC所占比例最大。BRAF基因在甲状腺癌中的突变率为39%。 BRAF基因突变作为乳头状甲状腺癌（PTC)发生的驱动性突变，已经成为乳头状甲状腺癌 (PTC)细针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标。研究表明PTC中BRAF基因突变 率高达44%，具有很好的诊断意义。BRAF基因突变阳性的病人较突变阴性病人预后不良。目 前针对BRAF的祀标药物主要有化281，它是一种口服烦人RA内敦酶小分子抑制剂，I期的临床 研究结果表明，该药能很好地稳定患者的病情;Vemurafenib: -种口服BRAF激酶小分子选 择性抑制剂，其对BRAF突变型激酶作用明显；索拉非尼：一种口服多激酶抑制剂，一方面通 过与BRA内敦酶区结合，阻断RA内敦酶信号传导途径，另一方面通过抑制VBraf和PDGFR，阻止 肿瘤新生血管的生成，该药在晚期的患者中，效果良好。
[0007] 化af基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、FI甜等。其中FISH技术主要适用 于拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法W逐渐显现其局限性;ARMS技术是目 前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才 能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检 测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型 的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形 式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所W探索一种Sanger测序法检测化af基因的技 术具有重要的临床意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种化af基因突变检测试剂盒，可直接 利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中化af基因主要突 变位点c.l799T〉A, P.V600E。
[0009] 本发明的化af基因突变检测试剂盒具体包括： n 田平扩憎措尤由Rrgf其巧FYnn 1 Fi鸟々k再早的赔县化引物!.且化席巧Il々n下- 、oy丄I歌U丄O丄丈」工出也TH入乂出
也]乂丄.丄炒4里心以化口 M'J KM 1工WJ]工口口目TH丄| 装有PCR反应预混液的试管;其中突变型质粒为化af基因上的c.l799T〉A，P.V600E突变位 点;PCR反应预混液由W下组份组成：
其中l〇x PCR buffer中含有500 mM KCiaoo mM Tris-HCl (pH 8.3),100 mM (畑4) 2S〇4,和 15 mM MgCl2;5x Q solution 中含有IM Tricine [p册.7(with KOH)]，8〇/〇 (v/v) Glycero巧P5% (v/v) DMS0;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和 25mM dGTPso
[0010]本试剂盒主要是根据化af基因的Exonl5号外显子的保守序列分别设计化af基因 C. 1799T〉A，P.V600E突变位点的特异性引物，并纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长 度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的 PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操 作流程包括： (1) 引物设计:利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从化af基因 DNA序列中挑选特 定的序列，然后根据碱基互补特点，设计化af基因 ExonlS号外显子的特异性引物，用于扩增 样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引 物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID N0s:l-3。长度在21-25个碱基左右 (2) PCR扩增:利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。
[00川 （3)琼脂糖凝胶电泳及胶回收:将扩增得到的目的基因化af的ExonlS号外显子片 段回收用于测序。
【附图说明】
[0012] W下是附图的说明，W便于理解上述发明的目的和具体特征。
[OOU]图1为化af基因的ExonlS号外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0014]附图1中各标号的具体表示如下： 1:1号样本;2:2号样本;3:3号样本;4:4号样本;5:5号样本;6:6号样本;M:DNA maker， 从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。
[001引图2-1为Braf基因的ExonlS外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
[0016] 图2-2为化af基因的ExonlS外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
【具体实施方式】
[0017] 1、引物设计 根据化af基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物 设计软件，如Primer Premier 5,从化af基因 DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互 补特点，设计化af基因 ExonlS号外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别 是沈Q ID Nos: 1-2。
[0018] 巧U序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物 只需要一段即可，引物序列是SEQ ID No:3。
[0019] 2、PCR 扩增 2.1、质巧品准备 阳性质控品为化af野生型和突变型质粒混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室溫融 化，旋满振荡10秒，瞬时离屯、10秒。
[0020] 2.2、试剂配制 提前将试剂取出，室溫融化，旋满振荡10秒，瞬时离屯、10秒。
[0021] 确定反应数N，N=待检样本数(n) X 4+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个 试剂的畳，计貸化下：
化一个火菌罔必菅肥制上巧仅化体《，巧刑全部观入后赃網派汤IU砂，隣町罔必。然后 将上述混合液按20iil/管分装至PCR反应管中。
[0022] 2.3、加样 将化af阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5 iil加入到PCR反应管中，其中样 本要稀释至20ngAU;然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物 各加2.扣1(引物用之前先稀释1/10至1化M)，同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离屯、15秒，将 管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离屯、至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩 增反应。
[0023] 2.4、PCR 扩增 配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下： 3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳必回收
由于PCR产物长度较短，配制2%(w/w)的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成 后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结 果良好，即可回收目的片段用于测序。本试剂盒不包含核酸回收成分，请采用商品化的琼脂 糖凝胶回收试剂盒。回收得到的产物即可用于测序。
【主权项】
1. 用于检测Braf基因突变的Exonl5号外显子的引物，包括特异性引物和测序引物，特 异性引物序列分别是SEQ ID Nos: 1-2,测序引物序列是SEQ ID No:3。 2. Braf基因突变检测试剂盒，包括： (1)用于扩增样本中Braf基因 Exonl5号外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-2 〇3. (2)用于测序PCR的测序引物，用于对Braf基因 Exonl5号外显子c.l799T>A，p. V600E突变位点进行测序分析，引物序列是SEQ ID Ν〇:3; (3)1个装有Braf野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个 装有PCR反应预混液的试管。4. 权利要求2所述试剂盒，其特征在于，PCR反应预混液由以下表组成：其中 10其 PCR buffer中含有500 mM KC1，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4) 2SO4,和 15 mM MgCl2;5* Q solution 中含有 1M Tricine [pH8.7(with K0H)]，8% (v/v) Glycerol和5% (v/v) DMS0;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和 25mM dGTPs〇
【文档编号】C12Q1/68GK105861726SQ201610402452
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】徐锋, 陈俊飞, 郑焱, 谢龙旭
【申请人】广东凯普生物科技股份有限公司