用于检测3种眼科感染螺旋体的lamp引物组合及应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测3种眼科感染螺旋体的LAMP引物组合及应用。本发明的引物组合由序列1至序列18所示的18条单链DNA分子组成。本发明还保护所述引物组合的应用。本发明还保护应用引物组合鉴别待测螺旋体为梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体还是钩端螺旋体的方法、鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体的方法、鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺旋体的方法。应用本发明的方法可快速、准确的检测出梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体。
【专利说明】
用于检测3种眼科感染螺旋体的LAMP引物组合及应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种用于检测巧中眼科感染螺旋体的LAMP引物组合及应用。
【背景技术】
[0002] 梅毒螺旋体是引起梅毒的病原体，可侵袭宿主全身各个系统和器官，可引起孕妇 流产，还可通过胎盘导致死胎和胎传先天梅毒。梅毒螺旋体侵袭力极强，可破坏患者表皮或 黏膜屏障的完整性，使梅毒患者感染或传播HIV的风险增加4-5倍，促进HIV的感染和传播。 世界卫生组织2010年统计资料显示，全球每年超过1200万例新增梅毒者。截至2009年，中国 疾病预防控制信息系统数据显示，全国大陆地区的31个省市区上报的梅毒病例数高达 358534例，其发病率居全国甲乙类法定报道传染病第3位，说明梅毒已成为不可忽视的公共 卫生问题。梅毒性眼病可见于梅毒任何一期，梅毒感染各期均可出现中枢神经系统改变，并 非晚期才发生神经系统受累。目前眼梅毒的发病机制尚有争议，根据眼睛的胚胎学，眼球起 源于中枢神经系统，因此眼梅毒应该是神经梅毒的一种表现，是神经梅毒的一个亚型。近年 来，我国梅毒发病率呈逐年上升趋势，梅毒性眼病由于缺乏临床特异性，早期极易误诊，漏 诊，常常给视力带来不可弥补的损失。
[0003] 伯氏疏螺旋体是莱姆病的病原体，它是由婢叮咬传播引起的一种自然疫源性人畜 共患疾病。人感染伯氏疏螺旋体后可W引起人体多系统、多器官的损害，临床表现为脑膜 炎、关节炎、神经根炎、慢性萎缩性肢皮炎、屯、肌炎等。莱姆病在全世界至今已有五大洲的70 多个国家报告发现了该病，且发病区域仍在不断扩大，发病率呈上升趋势。我国目前已在30 个省市及地区有报道，成为严重的公共卫生问题。莱姆病属多系统多器官受累的炎症性综 合征，眼部的表现如视力模糊、复视、中浆病、葡萄膜炎、角膜炎、眼险下垂、结膜炎等。莱姆 病眼部病变的机理尚不清楚，一种认为是伯氏疏螺旋体直接侵犯眼部，另一种观点认为是 机体受病原体感染后激活了眼部的免疫反应，还有人认为是由于免疫介入或继发性快速感 染及血管炎性病变所致。
[0004] 钩端螺旋体有致病性和非致病性两大类，致病性钩体侵入机机体后可引发钩体 病。钩体病分布广、菌型多、临床类型复杂、发病率及病死率高的自然疫源性急性传染病，致 病性钩体的分类及临床标本的鉴定，对钩体病的监测、控制都具有十分重要的意义。钩端螺 旋体性葡萄膜炎是一种我国南方多见的传染病，病原体可通过粘膜和皮肤而浸入人体致 病。病人可有高热、畏寒、头疼、眼痛、淋己结肿大、结膜充血和巩膜黄痘等急性表现。急性期 末，病人可发生双眼的葡萄膜炎，其发病率国内报告为27.8%-38.6%。大部分患者除眼部 充血外，还有角膜后的细小沉着物，房水轻度混浊，轻度虹膜后粘连，少部分患者可有玻璃 体混浊，可累及后部葡萄膜导致视力严重下降。
[0005] 目前临床针对螺旋体检测方法主要包括:分离培养、血清学诊断、暗视野显微镜检 查、免疫巧光试验等。运些检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，无 法满足快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术，特别是PCR技术，在微生物快速 鉴定和检测方面的应用，为螺旋体的快速检测开辟了新的途径。但是，PCR存在检测时间长、 易污染、假阳性率高的缺点，使其应用受到限制。环介导等溫扩增技术（loop-mediated isothermal amplification ,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩 增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引 物，在等溫条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测病原螺旋体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种用于检测巧中眼科感染螺旋体的LAMP引物组合及应用。
[0007] 本发明提供了一种引物组合，由引物组I、引物组II和引物组HI组成；
[000引所述引物组I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-I、引物BIP-I、引物LB-I和引物LF-I 组成；
[0009] 所述引物F3-1为如下(al)或(a2):
[0010] (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
[0011] (a2)将序列1经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有 相同功能的DNA分子；
[001^ 所述引物B3-1为如下（日3)或（曰4):
[001引（日3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
[0014] (a4)将序列2经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有 相同功能的DNA分子；
[001引所述引物FIP-I为如下（日5)或（曰6):
[0016] (曰5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
[0017] (a6)将序列3经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有 相同功能的DNA分子；
[001引所述引物BIP-I为如下(曰7)或(曰8):
[0019](日7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
[0020] (a8)将序列4经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有 相同功能的DNA分子；
[0021] 所述引物LB-I为如下(a9)或(alO):
[0022] (a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
[0023] (alO)将序列5经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有 相同功能的DNA分子；
[0024] 所述引物LF-I为如下(all)或(al2):
[0025] (all)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
[0026] (al2)将序列6经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有 相同功能的DNA分子；
[0027] 所述引物组II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF-2组成；
[0028] 所述引物F3-2为如下(bl)或化2):
[0029] (bl)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
[0030] (b2)将序列7经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有 相同功能的DNA分子；
[0031] 所述引物B3-2为如下化3)或化4):
[0032] 化3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
[0033] (b4)将序列8经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有 相同功能的DNA分子；
[0034] 所述引物FIP-2为如下化5)或化6):
[0035] 化5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
[0036] (b6)将序列9经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有 相同功能的DNA分子；
[0037] 所述引物BIP-2为如下化7)或化8):
[003引化7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
[0039] (b8)将序列10经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具 有相同功能的DNA分子；
[0040] 所述引物LB-2为如下化9)或(bio):
[0041 ] 化9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
[0042] (blO)将序列11经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具 有相同功能的DNA分子；
[0043] 所述引物LF-2为如下(bll)或(bl2):
[0044] (bll)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
[0045] (bl2)将序列12经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具 有相同功能的DNA分子；
[0046] 所述引物组III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物 LF-3组成；
[0047] 所述引物F3-3为如下（Cl)或(c2):
[004引 （Cl)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
[0049] (c2)将序列13经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具 有相同功能的DNA分子；
[0050] 所述引物B3-3为如下（c3)或（c4):
[0051 ] (c3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
[0052] (c4)将序列14经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具 有相同功能的DNA分子；
[0053] 所述引物FIP-3为如下（c5)或（c6):
[0054] (c5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
[0055] (c6)将序列15经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具 有相同功能的DNA分子；
[0056] 所述引物BIP-3为如下（c7)或（c8):
[0057] (c7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
[005引（c8)将序列16经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具 有相同功能的DNA分子；
[0059] 所述引物LB-3为如下（c9)或(ClO):
[0060] (c9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
[0061] (ClO)将序列17经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具 有相同功能的DNA分子；
[0062] 所述引物LF-3为如下（Cll)或(cl2):
[0063] (Cll)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
[0064] (cl2)将序列18经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具 有相同功能的DNA分子。
[00化]所述引物组合的用途为如下(dl)至(d6)中的任意一种：
[0066] (dl)鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体；
[0067] (d2)制备用于鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体的试剂盒；
[0068] (d3)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体；
[0069] (d4)制备用于鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体 的试剂盒；
[0070] (d5)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺旋体；
[0071] (d6)制备用于鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩 端螺旋体的试剂盒。
[0072] 本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(dl)至(d6)中的任意一种：
[0073] (dl)鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体；
[0074] (d2)制备用于鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体的试剂盒；
[0075] (d3)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体；
[0076] (d4)制备用于鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体 的试剂盒；
[0077] (d5)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺旋体；
[0078] (d6)制备用于鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩 端螺旋体的试剂盒。
[0079] 本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(el)或(e2) 或(e3):
[0080] (e 1)鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体；
[0081] (e2)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体；
[0082] (e3)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺旋体。
[0083] 本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
[0084] 本发明还保护一种鉴别待测螺旋体为梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体还是钩端螺旋体 的方法，包括如下步骤：
[00化](1)提取待测螺旋体的基因组DNA;
[0086] (2似步骤（1)得到的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合的引物组I、引物 组II和引物组III进行LAMP扩增反应，如果采用引物组I可W实现W所述基因组DNA为模板 的阳性扩增、待测螺旋体为梅毒螺旋体，如果采用引物组II可W实现W所述基因组DNA为模 板的阳性扩增、待测螺旋体为伯氏疏螺旋体，如果采用引物组HI可W实现W所述基因组 DM为模板的阳性扩增、待测螺旋体为钩端螺旋体。
[0087] 所述方法中，所述待测螺旋体为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体。
[0088] 本发明还保护一种鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺 旋体的方法，包括如下步骤：
[0089] (1)提取待测螺旋体的基因组DNA;
[0090] (2似步骤（1)得到的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合的引物组I、引物 组II和引物组III进行LAMP扩增反应，如果采用引物组I可W实现W所述基因组DNA为模板 的阳性扩增、待测螺旋体为梅毒螺旋体，如果采用引物组II可W实现W所述基因组DNA为模 板的阳性扩增、待测螺旋体为伯氏疏螺旋体，如果采用引物组HI可W实现W所述基因组 DNA为模板的阳性扩增、待测螺旋体为钩端螺旋体，如果使用引物组I、引物组II和引物组 III均不能实现W所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测螺旋体为非梅毒螺旋体且非伯氏 疏螺旋体且非钩端螺旋体。
[0091] 本发明还保护一种鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/ 或钩端螺旋体的方法，包括如下步骤：
[0092] (1)提取待测样本的总DNA;
[009引（2似步骤（1)得到的总DNA为模板，分别采用所述引物组合的引物组I、引物组II 和引物组III进行LAMP扩增反应，如果采用引物组I可W实现W所述总DNA为模板的阳性扩 增、待测样品疑似感染了梅毒螺旋体，如果采用引物组II可W实现W所述总DNA为模板的阳 性扩增、待测样品疑似感染了伯氏疏螺旋体，如果采用引物组III可W实现W所述总DNA为 模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了钩端螺旋体，如果使用引物组I、引物组II和引物组 III均不能实现W所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本疑似未感染梅毒螺旋体且疑似未 感染伯氏疏螺旋体且疑似未感染钩端螺旋体。
[0094] W上任一所述方法中，具体可通过如下方法判断"阳性扩增"：用巧光PCR仪检测巧 光信号，如果出现阳性扩增曲线则为阳性扩增。所述阳性扩增曲线具体可为S型扩增曲线。 [00M] 本发明还保护所述引物组I。
[0096] 所述引物组I的用途为如下(fl)或(f2):
[0097] (fl)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体；
[0098] (f2)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体。
[0099] 本发明还保护所述引物组I在制备试剂盒甲中的应用，所述试剂盒甲的用途为如 下(fl)或(f2):
[0100] (fl)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体；
[0101] (f2)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体。
[0102] 本发明还保护含有所述引物组I的试剂盒甲，所述试剂盒甲的用途为如下（fl)或 (f2)：
[0103] (fl)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体；
[0104] (f2)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体。
[0105] 本发明还保护所述引物组II。
[0106] 所述引物组II的用途为如下(f3)或(f4):
[0107] (f3)鉴定待测螺旋体是否为伯氏疏螺旋体；
[0108] (f4)鉴定待测样本是否感染了伯氏疏螺旋体。
[0109] 本发明还保护所述引物组II在制备试剂盒乙中的应用，所述试剂盒乙的用途为如 下的)或(f4):
[0110] (f3)鉴定待测螺旋体是否为伯氏疏螺旋体；
[0111] (f4)鉴定待测样本是否感染了伯氏疏螺旋体。
[0112] 本发明还保护含有所述引物组II的试剂盒乙，所述试剂盒乙的用途为如下(f3)或 (f4)：
[0113] (f3)鉴定待测螺旋体是否为伯氏疏螺旋体；
[0114] (f4)鉴定待测样本是否感染了伯氏疏螺旋体。
[0115] 本发明还保护所述引物组III。
[0116] 所述引物组HI的用途为如下(巧)或(f6):
[0117] (f5)鉴定待测螺旋体是否为钩端螺旋体；
[0118] (f6)鉴定待测样本是否感染了钩端螺旋体。
[0119] 本发明还保护所述引物组III在制备试剂盒丙中的应用，所述试剂盒丙的用途为 如下(f5)或(f6):
[0120] (f5)鉴定待测螺旋体是否为钩端螺旋体；
[0121] (f6)鉴定待测样本是否感染了钩端螺旋体。
[0122] 本发明还保护含有所述引物组III的试剂盒丙，所述试剂盒丙的用途为如下（f5) 或(f6):
[0123] (f5)鉴定待测螺旋体是否为钩端螺旋体；
[0124] (f6)鉴定待测样本是否感染了钩端螺旋体。
[0125] W上任一所述待测样本具体可为眼部临床样本培养物、眼液体或抽吸物。
[01%] W上任一所述采用引物组I进行LAMP扩增的反应体系中，引物组I中引物混合物的 浓度为：〇.5iiM F3-l、0.5iiMB3-l、2iiM FIP-IJyM BIP-I、化M LF-I、化M LB-I。
[0127] W上任一所述采用引物组II进行LAMP扩增的反应体系中，引物组II中引物混合物 的浓度为:〇.5iiM F3-2、0.5iiMB3-2、2iiM FIP-2、2iiM BIP-2、化M LF-2、化M LB-2。
[012引 W上任一所述采用引物组III进行LAMP扩增的反应体系中，引物组III中引物混合 物的浓度为:0.5iiM F3-3、0.5iiMB3-3、2iiM FIP-3、2iiM BIP-3、化M LF-3、化M LB-3。
[01巧]W上任一所述采用引物组I进行LAMP扩增的反应体系具体可为：^LlOX ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜碱，0.1 化 50mg/ml BSA，0.4化 IOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen,0.1扣L IOOmM dNTPs，0.化L洲/ml Bst DNA聚合酶大片段，1化引物混合物 (F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1 和LB-I的混合物），50pg-50ng模板DNA，用d地2〇补足至IOy L。
[0130] W上任一所述采用引物组11进行LAMP扩增的反应体系具体可为：1 iiL 10 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜碱，0.1 化 50mg/ml BSA，0.4化 IOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen,0.1扣L IOOmM dNTPs，0.化L洲/ml Bst DNA聚合酶大片段，1化引物混合物 巧3-2、83-2少1?-2、81?-2、1。-2和1^8-2的混合物），5化旨-50雌模板0魁，用(1地2〇补足至10化 (待修改）。
[0131] W上任一所述采用引物组111进行LAMP扩增的反应体系具体可为= ^LlOX 化6脚〇?〇18扯'6'，1.化151甜菜碱，0.1化50111旨/1111654,0.4化10011111旨504,0.3化20 XEvaGreen，0.1扣L100mMdNTPs，0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段，l化引物混合物 巧3-3、83-3少1?-3、81?-3、1。-3和1^8-3的混合物），5化旨-50雌模板0魁，用(1地2〇补足至10化 (待修改）。
[0132] W上任一所述LAMP扩增的反应程序具体可为:65°C恒溫50min。反应过程中，采用 巧光PCR仪检测巧光信号。
[0133] 本发明提供了用于检测3种眼科感染螺旋体的LAMP引物及方法。本发明提供的 LAMP引物共3套，每种螺旋体1套，每套包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP W及环引物LF和 LB，每套均可特异性识别祀序列上的六个独立区域进行扩增，具有高特异性。应用本发明的 方法可快速、准确的检测出梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体。
【附图说明】
[0134] 图1为实施例2的LAMP扩增曲线图。
[0135] 图2为实施例6的LAMP扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0136] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置=次重复实验，结果取平 均值。
[0137] pGEM-T Easy Vector载体：购自promega公司，产品货号A1360。
[0138] 实施例1、引物设计及制备
[0139] 进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋 体的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定梅 毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体的立套LAMP引物组。
[0140] 用于鉴定梅毒螺旋体的引物组，包括2条外引物(F3-1、B3-1)，2条内引物(FIP-1、 BIP-1)和2条环引物(口^-1、18-1)，各条引物序列如下所示(5'^3'）：
[0141] F3-1 (序列表的序列 1): CTTTTGCCTATCCTAGCCG;
[0142] B3-U序列表的序列2) :GCGGTAAATGTAATTCTTGAGG;
[01 伯]巧P-I (序列表的序列3): TCTGAAAAAGATCGAGTGAGCTGACGTATGGAAGAAGTGGGGAAA;
[0144] BIP-U 序列表的序列 4):ATCCAGCAGTACGAGCACTGTCTGCAGTTGCTTCGGTG;
[0145] LF-U序列表的序列5) :CACAACATCCTTACGTAAAAAAATG;
[0146] LB-U序列表的序列6) :TATTTTTTCTCTTGCCGGTCATGGA。
[0147] 用于鉴定伯氏疏螺旋体的引物组，包括2条外引物(F3-2、B3-2)，2条内引物(FIP-2、BIP-2)和2条环引物(LF-2、LB-2)，各条引物序列如下所示(5'^3'）：
[014引 F3-2(序列表的序列7) :TACCAGGGCTTGACATCT;
[0149] B3-2(序列表的序列8) :ATTTGACGTCATCCTCACTG;
[0150] FIP-2(序列表的序列9): ACTTAACCCAACACCTCACAGTCTATATACAGGTGCTGCATGGGG; [0151 ] BIP-2(序列表的序列 10) :AACGAGCGCAACCCTTCACCGGCAGTCTTATCTGAGGC;
[0152] LF-2(序列表的序列11) :ACGAGCTGACGACAGC;
[0153] LB-2(序列表的序列 12) :TGTTACCAGCATGTAATGGTC。
[0154] 用于鉴定钩端螺旋体的引物组，包括2条外引物(F3-3、B3-3)，2条内引物(FIP-3、 BIP-3)和2条环引物(LF-3、LB-3)，各条引物序列如下所示(5'^3'）：
[01 巧]F3-3(序列表的序列 13) :AATTACTGTGTTAGTTCTCCTTCT;
[0156] B3-3(序列表的序列 14) :CGATAAAACTGGAACCTTCAT;
[0157] 円P-3(序列表的序列 15): CCTTCTTTATCTTTCGGGMTACTATTTAGGAMTTGCGCAGCTACAGG;
[0158] BIP-3(序列表的序列 16): ACTTCAGAMTTCCTCGGMCMCGMMTTGCTTCCCAMGACTGC;
[0159] LF-3(序列表的序列 17) :GAATACCGGATATTCTACATGG;
[0160] LB-3(序列表的序列 18) :GTTTGGCAGTTGAACCTCCTAAG。
[0161] 用于鉴定梅毒螺旋体的引物组命名为引物组I。
[0162] 用于鉴定伯氏疏螺旋体的引物组命名为引物组II。
[0163] 用于鉴定钩端螺旋体的引物组命名为引物组III。
[0164] 引物组I、引物组II和引物组III组成引物组合。
[01化]实施例2、检测方法建立
[0166] 1、提取待测螺旋体的基因组DNA或提取待测生物样本的总DNA。
[0167] 2、取步骤1得到的DNA，作为模板，采用实施例1中制备的引物组I进行LAMP扩增。
[016 引 LAMP 扩增的反应体系：1 化 IOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜碱，0.I^SOmg/ ml BSA，0.4化 IOOmM MgS04,0.3]iL 20 X EvaGreen，0.1化1 IOOmM dNTPs，0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段，I化引物混合物巧3-1、83-1少1?-1、81?-1、口^-巧化8-1的混合物）， 2ng模板DNA，用d地2〇补足至10化。反应体系中各引物的浓度如下：0.5iiM F3-1、0.5iiMB3-l、 化M FIP-I、化M BIP-I、化M LF-I、化M LB-1。
[0169] LAMP扩增的反应程序：65°C恒溫50min。反应过程中，采用巧光PCR仪检测巧光信 号。
[0170] 3、取步骤1得到的DNA，作为模板，采用实施例1中制备的引物组II进行LAMP扩增。
[0171] LAMP 扩增的反应体系：1 化 IOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜碱，0.I^SOmg/ ml BSA，0.4化 IOOmM MgS〇4,0.3]iL 20 X EvaGreen，0.1化1 IOOmM dNTPs，0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段，I化引物混合物巧3-2、83-2少1?-2、81?-2、口^-2和1^8-2的混合物）， 2ng模板DNA，用d地2〇补足至10化。反应体系中各引物的浓度如下：0.5iiM F3-2，0.5iiMB3-2， 化M FIP-2,化M BIP-2,化M LF-2,化M LB-2。
[0172] LAMP扩增的反应程序：65°C恒溫50min。反应过程中，采用巧光PCR仪检测巧光信 号。
[017引 4、取步骤1得到的DNA，作为模板，采用实施例1中制备的引物组III进行LAMP扩增。
[0174] LAMP 扩增的反应体系：1 化 IOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜碱，0.I^SOmg/ ml BSA，0.4化 IOOmM MgS〇4,0.3]iL 20 X EvaGreen，0.1化1 IOOmM dNTPs，0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段，I化引物混合物巧3-3、83-3少1?-3、81?-3、口^-3和1^8-3的混合物）， 2ng模板DNA，用d地2〇补足至10化。反应体系中各引物的浓度如下：0.5iiM F3-3，0.5iiMB3-3， 化M FIP-3,化M BIP-3,化M LF-3,化M LB-3。
[0175] LAMP扩增的反应程序：65°C恒溫50min。反应过程中，采用巧光PCR仪检测巧光信 号。
[0176] 如果采用引物组I可W得到阳性扩增曲线，表明待测螺旋体为梅毒螺旋体;如果采 用引物组II可W得到阳性扩增曲线，表明待测螺旋体为伯氏疏螺旋体;如果采用引物组III 可W得到阳性扩增曲线，表明待测螺旋体为钩端螺旋体。
[0177] 如果采用引物组I可W得到阳性扩增曲线，表明待测样本感染了梅毒螺旋体;如果 采用引物组II可W得到阳性扩增曲线，表明待测样本感染了伯氏疏螺旋体;如果采用引物 组III可W得到阳性扩增曲线，表明待测样本感染了钩端螺旋体。
[017引实施例3、参考品质粒构建
[0179] 梅毒螺旋体参考品质粒:将序列表的序列19所示的双链DNA分子插入pGEM-T化sy Vector载体的ApaI和SacI酶切位点之间，得到参考品质粒。
[0180] 伯氏疏螺旋体参考品质粒：将序列表的序列20所示的双链DNA分子插入pGEM-T Easy Vector载体的ApaI和SacI酶切位点之间，得到参考品质粒。
[0181] 钩端螺旋体参考品质粒:将序列表的序列21所示的双链DNA分子插入pGEM-T化sy Vector载体的ApaI和SacI酶切位点之间，得到参考品质粒。
[0182] 实施例4、特异性
[0183] 待测样本分别为:梅毒螺旋体参考品质粒DNA、伯氏疏螺旋体参考品质粒DNA、钩端 螺旋体参考品质粒DNA。
[0184] 采用实施例2的检测方法进行检测。
[0185] 结果见图1。图1中，横坐标为循环数，纵坐标为巧光信号强度，其中，A为采用引物 组I时各个待测样本的扩增曲线，B为采用引物组II时各个待测样本的扩增曲线，C为采用引 物组HI时各个待测样本的扩增曲线。由图IA可见，梅毒螺旋体样本得到S型扩增曲线，扩增 结果为阳性，伯氏疏螺旋体样本和钩端螺旋体样本均没有得到S型扩增曲线，扩增结果为阴 性。由图IB可见，伯氏疏螺旋体样本得到S型扩增曲线，扩增结果为阳性，梅毒螺旋体样本和 钩端螺旋体样本均没有得到S型扩增曲线，扩增结果为阴性。由图IC可见，钩端螺旋体样本 得到S型扩增曲线，扩增结果为阳性，梅毒螺旋体样本和伯氏疏螺旋体样本均没有得到S型 扩增曲线，扩增结果为阴性。结果表明，实施例1制备的引物组合均具有很高的特异性。
[0186] 实施例5、灵敏度
[0187] 待测样本为分别为:梅毒螺旋体参考品质粒DNA、伯氏疏螺旋体参考品质粒DNA、钩 端螺旋体参考品质粒DNA。
[0188] 1、用无菌水稀释各待测样本，得到各稀释液。
[0189] 2、分别取步骤1得到的各稀释液作为模板，采用实施例2的检测方法进行检测。
[0190] 由于采用的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
[0191 ]反应体系1中，参考品质粒DNA的初始含量为:10000个拷贝；
[0192] 反应体系2中，参考品质粒DNA的初始含量为:1000个拷贝；
[0193] 反应体系3中，参考品质粒DNA的初始含量为:500个拷贝；
[0194] 反应体系4中，参考品质粒DNA的初始含量为:100个拷贝。
[01M]每种病毒参考品质粒分别按上述4个体系进行检测。
[0196]结果表明，：梅毒螺旋体参考品质粒、伯氏疏螺旋体参考品质粒、钩端螺旋体参考 品质粒的DNA含量为500-10000个拷贝时均得到S型扩增曲线，梅毒螺旋体参考品质粒、伯氏 疏螺旋体参考品质粒、钩端螺旋体参考品质粒的DNA浓度为100个拷贝时均没有得到S型扩 增曲线。该结果表明本发明所提供的用于检测3种眼科感染螺旋体的LAMP引物组合具有较 高的灵敏度。
[0197] 实施例6、临床样本检测
[0198] 待测样本为:经过临床鉴定为梅毒螺旋体阳性的眼部抽吸物样本、经过临床鉴定 为伯氏疏螺旋体阳性的眼部抽吸物样本、经过临床鉴定为钩端螺旋体的眼部抽吸物样本和 经过临床鉴定不存在梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体的健康者的样本。
[0199] 采用实施例2的检测方法进行检测。
[0200] 结果见图2。图2中，横坐标为循环数，纵坐标为巧光信号强度，其中，A为采用引物 组I时各个待测样本的扩增曲线，B为采用引物组II时各个待测样本的扩增曲线，C为采用引 物组III时各个待测样本的扩增曲线。由图2A可见，只有梅毒螺旋体阳性样本得到S型扩增 曲线(经测序，如序列表的序列19所示），伯氏疏螺旋体阳性样本和钩端螺旋体阳性样本均 没有得到S型扩增曲线，与临床鉴定结果相符。由图2B可见，只有伯氏疏螺旋体阳性样本得 至化型扩增曲线(经测序，如序列表的序列20所示），梅毒螺旋体阳性样本和钩端螺旋体阳性 样本均没有得到S型扩增曲线，与临床鉴定结果相符。由图2C可见，只有钩端螺旋体阳性样 本得到S型扩增曲线(经测序，如序列表的序列21所示），梅毒螺旋体阳性样本和伯氏疏螺旋 体阳性样本均没有得到S型扩增曲线，与临床鉴定结果相符。结果表明，使用实施例1制备的 引物组合进行螺旋体鉴定，结果准确可靠。健康组织不显示阳性S型扩增曲线，证明=个引 物组对于人正常基因组来说不存在非特异性扩增。
【主权项】
1.引物组合，由引物组I、引物组II和引物组III组成； 所述引物组I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1组 成； 所述引物F3-1为如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-1为如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6): (a5)序列表的序列3所不的单链DNA分子； (a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8): (a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子； (a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LB-1为如下(a9)或(alO): (a9)序列表的序列5所不的单链DNA分子； (alO)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LF-1为如下(all)或(al2): (all)序列表的序列6所不的单链DNA分子； (al2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同 功能的DNA分子； 所述引物组II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF-2组 成； 所述引物F3-2为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列7所示的单链DNA分子； (b2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-2为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列8所示的单链DNA分子； (b4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-2为如下(b5)或(b6): (b5)序列表的序列9所不的单链DNA分子； (b6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-2为如下(b7)或(b8): (b7)序列表的序列10所示的单链DNA分子； (b8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-2为如下(b9)或(blO): (b9)序列表的序列11所示的单链DNA分子； (blO)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-2为如下(bll)或(bl2): (bll)序列表的序列12所示的单链DNA分子； (bl2)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相 同功能的DNA分子； 所述引物组III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物LF-3组 成； 所述引物F3-3为如下(cl)或(c2): (cl)序列表的序列13所示的单链DNA分子； (c2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相 同功能的DNA分子； 所述引物B3-3为如下(c3)或(c4): (c3)序列表的序列14所示的单链DNA分子； (c4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相 同功能的DNA分子； 所述引物FIP-2为如下(c5)或(c6): (c5)序列表的序列15所不的单链DNA分子； (c6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相 同功能的DNA分子； 所述引物BIP-3为如下(c7)或(c8): (c7)序列表的序列16所不的单链DNA分子； (c8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-3为如下(c9)或(clO): (c9)序列表的序列17所示的单链DNA分子； (clO)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-3为如下(ell)或(cl2): (ell)序列表的序列18所示的单链DNA分子； (cl2)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相 同功能的DNA分子。2. 权利要求1所述引物组合的应用，为如下(dl)至(d6)中的任意一种： (dl)鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体； (d2)制备用于鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体的试剂盒； (d3)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体； (d 4)制备用于鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体的试 剂盒； (d5)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺旋体； (d6)制备用于鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺 旋体的试剂盒。3. 含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下（el)或（e2)或 (e3)： (e 1)鉴别梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体； (e2)鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体； (e3)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺旋体。4. 权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。5. -种鉴别待测螺旋体为梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体还是钩端螺旋体的方法，包括如 下步骤： (1) 提取待测螺旋体的基因组DNA; (2) 以步骤（1)得到的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的引物组 I、引物组II和引物组III进行LAMP扩增反应，如果采用引物组I可以实现以所述基因组DNA 为模板的阳性扩增、待测螺旋体为梅毒螺旋体，如果采用引物组II可以实现以所述基因组 DNA为模板的阳性扩增、待测螺旋体为伯氏疏螺旋体，如果采用引物组III可以实现以所述 基因组DNA为模板的阳性扩增、待测螺旋体为钩端螺旋体。6. -种鉴定或辅助鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体或伯氏疏螺旋体或钩端螺旋体 的方法，包括如下步骤： (1) 提取待测螺旋体的基因组DNA; (2) 以步骤（1)得到的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的引物组 I、引物组II和引物组III进行LAMP扩增反应，如果采用引物组I可以实现以所述基因组DNA 为模板的阳性扩增、待测螺旋体为或候选为梅毒螺旋体，如果采用引物组II可以实现以所 述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测螺旋体为或候选为伯氏疏螺旋体，如果采用引物组 III可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测螺旋体为或候选为钩端螺旋体，如 果使用引物组I、引物组II和引物组III均不能实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待 测螺旋体为非梅毒螺旋体且非伯氏疏螺旋体且非钩端螺旋体。7. -种鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体和/或伯氏疏螺旋体和/或钩端螺旋体的 方法，包括如下步骤： (1) 提取待测样本的总DNA; (2) 以步骤（1)得到的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的引物组I、引 物组II和引物组III进行LAMP扩增反应，如果采用引物组I可以实现以所述总DNA为模板的 阳性扩增、待测样品疑似感染了梅毒螺旋体，如果采用引物组II可以实现以所述总DNA为模 板的阳性扩增、待测样品疑似感染了伯氏疏螺旋体，如果采用引物组III可以实现以所述总 DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了钩端螺旋体，如果使用引物组I、引物组II和引 物组III均不能实现以所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本疑似未感染梅毒螺旋体且疑 似未感染伯氏疏螺旋体且疑似未感染钩端螺旋体。8.引物组I或引物组II或引物组III; 所述引物组I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1组 成； 所述引物F3-1为如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-1为如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6): (a5)序列表的序列3所不的单链DNA分子； (a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8): (a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子； (a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LB-1为如下(a9)或(alO): (a9)序列表的序列5所不的单链DNA分子； (alO)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LF-1为如下(all)或(al2): (all)序列表的序列6所不的单链DNA分子； (al2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同 功能的DNA分子； 所述引物组II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF-2组 成； 所述引物F3-2为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列7所示的单链DNA分子； (b2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-2为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列8所示的单链DNA分子； (b4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-2为如下(b5)或(b6): (b5)序列表的序列9所不的单链DNA分子； (b6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-2为如下(b7)或(b8): (b7)序列表的序列10所示的单链DNA分子； (b8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-2为如下(b9)或(blO): (b9)序列表的序列11所示的单链DNA分子； (blO)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-2为如下(bll)或(bl2): (bll)序列表的序列12所示的单链DNA分子； (bl2)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相 同功能的DNA分子； 所述引物组III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物LF-3组 成； 所述引物F3-3为如下(cl)或(c2): (cl)序列表的序列13所示的单链DNA分子； (c2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相 同功能的DNA分子； 所述引物B3-3为如下(c3)或(c4): (c3)序列表的序列14所示的单链DNA分子； (c4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相 同功能的DNA分子； 所述引物FIP-2为如下(c5)或(c6): (c5)序列表的序列15所不的单链DNA分子； (c6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相 同功能的DNA分子； 所述引物BIP-3为如下(c7)或(c8): (c7)序列表的序列16所不的单链DNA分子； (c8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-3为如下(c9)或(clO): (c9)序列表的序列17所示的单链DNA分子； (clO)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-3为如下(ell)或(cl2): (ell)序列表的序列18所示的单链DNA分子； (cl2)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相 同功能的DNA分子。9. 权利要求8所述引物组I在制备试剂盒甲中的应用，或，所述引物组II在制备试剂盒 乙中的应用，或，所述引物组III在制备试剂盒丙中的应用； 所述试剂盒甲的用途为如下(Π )或(f2): (Π )鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体； (f2)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体； 所述试剂盒乙的用途为如下(f3)或(f4): (f3)鉴定待测螺旋体是否为伯氏疏螺旋体； (f4)鉴定待测样本是否感染了伯氏疏螺旋体； 所述试剂盒丙的用途为如下(f5)或(f6): (f5)鉴定待测螺旋体是否为钩端螺旋体； (f6)鉴定待测样本是否感染了钩端螺旋体。10. 含有权利要求8所述引物组I的试剂盒甲，或，含有权利要求8所述引物组II的试剂 盒乙，或，含有权利要求8所述引物组III的试剂盒丙； 所述试剂盒甲的用途为如下(Π )或(f2): (Π )鉴定待测螺旋体是否为梅毒螺旋体； (f2)鉴定待测样本是否感染了梅毒螺旋体； 所述试剂盒乙的用途为如下(f3)或(f4): (f3)鉴定待测螺旋体是否为伯氏疏螺旋体； (f4)鉴定待测样本是否感染了伯氏疏螺旋体； 所述试剂盒并的用途为如下(f5)或(f6): (f5)鉴定待测螺旋体是否为钩端螺旋体； (f6)鉴定待测样本是否感染了钩端螺旋体。
【文档编号】C12Q1/04GK105861727SQ201610403954
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】陶勇
【申请人】首都医科大学附属北京朝阳医院