一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述引物对包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：上游引物：5’?TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG?3’；下游引物：5’?RGGCAACACAGCCTCCAR?3’。本发明针对小鼠腺病毒的NC_012584.1Murine adenovirus 3pIIIa序列，设计了小鼠腺病毒特异性的引物对，利用该引物对结合荧光探针的荧光定量PCR检测方法对小鼠腺病毒的检测下限为4.5copies/μL DNA，大大提高了检测灵敏性。
【专利说明】
-种用于检测小鼠腺病毒的引物对、黄光定量PCR试剂盒及其 应用
技术领域
[0001] 本发明设及动物病毒检验检疫技术领域，特别是设及一种用于检测小鼠腺病毒的 引物对、巧光定量PCR试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为=类;一类为人 兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物;二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养 的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性;=类病毒在自然条件下仅感染动 物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。
[0003] 现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的 病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》=部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8 种鼠源病毒，其中小鼠腺病毒(Mouse Adenovirus,MAdV)属于II类，目前尚无迹象表明感染 人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性。鼠源性病毒 检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。
[0004] 小鼠腺病毒是20世纪60年代从小鼠体内分离出的一种双链DNA病毒，为腺病毒科 哺乳动物腺病毒属的成员。MAdV已被确定分类地位的株型有2个血清型：I型化株和n型K87 株。小鼠腺病毒感染常呈隐性，病毒侵入栋色脂肪、肾上腺、屯、肌和肾等处，对裸鼠致病性较 强，可W引起死亡。小鼠腺病毒也可损害人类屯、血管组织，被怀疑为人类屯、脏损害的一种病 原。
[0005] 药典规定的鼠源病毒检测方法有:细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。 运些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操 作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。
[0006] 目前小鼠腺病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法:免疫巧光（IFA)、 酶联免疫吸附试验化LISA)、酶免疫分析法化IA)等。传统的检测方法存在成本高、耗时长、 假阳性等问题。随着分子生物学的快速发展，越来越多的分子检测技术应用到腺病毒检测 中。王吉等(王吉、付瑞、卫礼等，小鼠腺病毒PCR检测方法的建立及初步应用，实验动物与比 较医学，2014，：34( 1): 35-41)针对小鼠腺病毒建立PCR检测法，检测敏感性为1.67pg/iiL MAdV DM。姚新华等(姚新华、郭英飞，实时巧光定量PCR快速检测腺病毒方法的建立与评 价，解放军预防医学杂志，2015,33(2):127-129)针对人腺病毒化xon基因建立巧光定量 I^qMan PCR检测法，最低可检测到lOcopies/化。
[0007] 而目前发展十分成熟的实时巧光定量PCR技术(Real Time PCR)检测灵敏度高，简 单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司 推出，是在PCR反应体系中加入巧光基团，利用巧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通 过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产 生W来，不断发展完善，特别是随着Taqman巧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非 常成熟。Taqman巧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同 时还加入一个特异性的巧光探针，该探针为一寡核巧酸，两端分别标记一个报告巧光基因 和一个泽灭巧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的巧光信号被泽灭基因吸收，扩增时 随着化q酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5 '-3 '外切核酸酶活性将探针酶切降 解，报告巧光基团与泽灭巧光基团分离，从而巧光检测系统可W监测到巧光信号，模板每复 制一次，就有一个探针被切断伴随一个巧光信号的释放。由于被释放的巧光基团数目和PCR 产物数量是一对一关系，所W信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一 条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可W得到一条标准曲线，根据该标准曲线W 及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。
[0008] 实时巧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异 性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分 析、细菌、病毒检测等多个领域。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种小鼠腺病毒特异性的引物对，利用该引物对结合巧光探针可W 对小鼠腺病毒进行巧光定量PCR检测，该检测方法能特异、灵敏地检测出小鼠腺病毒。
[0010] 引物对，包括上游引物和下游引物，核巧酸序列为：
[0011] 上游引物：5 ' -TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG-3 ' ；
[0012] 下游引物:5' -RGGCAACACAGCCTCCAR-3'。
[0013] 该引物对是根据小鼠腺病毒的NC_012584. IMurine adenovirus化111日序列设计 的，扩增目的片段大小为74bp。该引物对的上下游引物序列具有一定的简并性，序列中的Y 为C或T; K为G或T; S为C或G; M为A或C; R为A或G。
[0014] 本发明又提供了所述的引物对在制备检测小鼠腺病毒试剂盒中的应用。
[0015] 本发明还提供了一种用于检测小鼠腺病毒的巧光定量PC时式剂盒，包含所述的引 物对。
[0016] 所述一种用于检测小鼠腺病毒的巧光定量PCR试剂盒，其探针为：5'-R-ACCRTGGTTTACTAGACGMGAYGCMA-Q-3'，其中，5'端的R为巧光报告基团；3'端的Q为巧光泽灭 基团。探针的核巧酸序列具有一定的简并性，其中核巧酸序列中的R为A或G;M为A或C;Y为C 或T。所述探针中巧光报告基团可选自FAM、J0E、皿X中的任意一种，优选为FAM;所述巧光泽 灭基团选自TAMRA或Eclipse,优选为TAMRA。
[0017]所述一种用于检测小鼠腺病毒的巧光定量PC时式剂盒，包含阳性对照DNA。
[0018] 优选的，所述阳性对照DNA为包含如SEQ ID No.4所示核巧酸序列的重组质粒。该 核巧酸序列为使用本发明引物对扩增单一的小鼠腺病毒株所获得的扩增产物，大小为 74bp〇
[0019] 优选的，所述阳性对照DNA为包含如SEQ ID No.4所示核巧酸序列的重组PMD18-T 载体。PMD18-T载体为常用的商业化的克隆载体。
[0020] 本发明还提供了所述的巧光定量PC时式剂盒在检测动物制品或动物实验废弃物中 小鼠腺病毒残留中的应用。
[0021] 本发明还提供了一种检测小鼠腺病毒的巧光定量PCR方法，W待检测样品的DNA为 模板，利用所述的引物对进行巧光定量PCR反应。
[0022] 所冰巧化吿量PCR的巧府化系为：
[0023]
[0024] 所述巧光定量PCR的反应条件为:50°C培育2min;95°C预变性10min;95°C变性15s， 60 °C退火Imin，共40个循环。
[00巧]本发明针对小鼠腺病毒的NC_012584. IMurine adenovirus化111日序列，设计了 小鼠腺病毒特异性的引物对，利用该引物对结合巧光探针的巧光定量PCR检测方法对小鼠 腺病毒的检测下限为4.5copies/]iL DNA，大大提局了检测灵敏性。
【附图说明】
[0026] 图1为MAD-3引物对和探针特异性检测扩增曲线图；
[0027] 图2为MAD-3引物对和探针扩增目的基因标准曲线图；
[0028] 图3为MAD-3引物对和探针标准曲线的扩增曲线图；
[0029] 图4为MD-3引物对和探针灵敏性检测扩增曲线图，扩增曲线从左到右依次为:4.5 X l〇7copies/]iL、4.5 X l〇6copies/]iL、4.5 X l〇5copies/]iL、4.5 X l〇4copies/]iL、4.5 X l〇3copies/]iL、4.5 X l〇2copies/]iL、4.5 X l〇icopies/]iL、4.5 X 10°copies/]iL;
[0030] 图5为MAD-3引物对和探针实际检测应用扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1引物对及探针的设计与筛选
[0032] 从NCBI下载小鼠腺病毒（Murine adenovirus A和Murine adenovirus 3)基因组 序列，进行比对后，发现有S个基因有较好的相似性，其中，IVa2的一致性（identities)为 75% ;Hexon-致性为75% ;PlIIa-致性为71 %，因此选择此S个基因作为候选的检测基 因。
[0033] 分别针对上述S个基因设计引物和探针，引物和探针如表1所示。其中，引物和探 针序列均具有一定的简并性，序列中的Y为C或T; K为G或T; S为C或G; M为A或C; R为A或G; W为A 或T。
[0034] 表 1
[0035]
[0036] 用表1所设计的S组引物对，不使用探针，进行普通PCR扩增。PCR反应体系为：
[0037]
[003引反应条件为:95°C预变性5min;95°C变性153,60。(：退火203,72。(：延伸303，共40个 循环;72°C延伸7min JCR产物经电泳检测，S组引物对均能扩出相应目的片段。
[0039] 使用S组引物对和探针(MD-1~3 )，对小鼠腺病毒标准株DNA进行巧光定量PCR扩 增。其巧光定量PCR反应体系为：
[0040]
[0041]
[0042] 反应条件为:50°C培育2min;95°C预变性10min;95°C变性15s，60°C退火延伸Imin, 共40个循环。巧光定量PCR结果显示MAD-I引物对和探针效率不佳，检测不到目的基因。MD-2和MD-3引物对和探针扩增效果较好。
[0043] 将使用MAD-2和MAD-3引物对进行普通PCR扩增的产物割胶回收并纯化后，连接 pMD:驳18-T质粒载体制备标准品，并进行标准曲线的扩增。两组引物对所建立的标准曲线 相关系数均为0.999;扩增效率分别为:95%和94%。
[0044] 将 MAD-2 巧.5Xl〇9copiesAiL)和 MAD-3(4.5Xl〇9copiesAiL)对应的标准品克隆质 粒依次稀释直到5.5 XicA^opiesAiL和4.5XicA^opiesAiL，在40个PCR循环内，MAD-2可W检 ^i至化.5X10*^copiesA^L，MAD-3可W检测到4.5Xl(A3opiesA^L，灵敏性均较好。
[0045] 综上所述，本发明采用扩增效率及灵敏性均较好的MAD-3引物对及探针来检测小 鼠腺病毒。
[0046] 实施例2MAD-3引物对及探针的特异性检测
[0047] 使用MAD-3引物对及探针，W不含任何病毒株的水为阴性对照，W稀释至4.5 X IO4CopiesAiL的质粒标准品为阳性对照，分别对猴腺病毒-1、猴腺病毒-20、小鼠腺病毒、禽 腺病毒I型、禽腺病毒m型、树駒呼肠孤病毒、犬瘤疹病毒、猫瘤疹病毒、伪狂犬病毒、猴巨细 胞病毒、水痘带状瘤疹病毒、树駒腺病毒、小鼠巨细胞病毒、人单纯瘤疹病毒I型、人单纯瘤 疹病毒n型、小鼠肝炎病毒A59、小鼠肝炎病毒JHM、脑屯、肌炎病毒、淋己脉络丛脑膜炎病毒、 仙台病毒、汉坦病毒等21个病毒种类的样品DNA或者CDNA进行巧光定量PCR检测(样本编号1 ~21)。
[0048] 反应体系和条件同实施例1。结果如图1和表2所示。通过检测，小鼠腺病毒阳性样 本中可W检测到目的基因，3号鼠腺病毒中检测到腺病毒目的基因，空白对照和其他样品中 未检测到腺病毒目的基因。证明MAD-3引物对及探针特异性较好。
[0049] 表 2
[(K)加 ]
[0化1 ]
[0052] 注:N/A表示未检测到，即低于检测下限。
[0053] 实施例3MAD-3引物对及探针的灵敏性检测
[0054] (1)标准曲线的建立
[0055] 将MAD-3引物对扩增基因重组质粒进行10倍梯度稀释，即从4.5 X IO9CopiesAiL稀 释至4.5 X 10*^。〇口163/化，从中选取4.5 X 1〇7。〇口163/化至4.5 X 1〇1。〇口163/化的质粒标准 品，进行化qman探针巧光定量检测，用于制作标准曲线。横坐标是WlO为底的质粒拷贝数的 对数值，纵坐标是循环阔值Ct，从标准曲线得出重组质粒拷贝数(Copy number)与循环阔值 (Ct)之间的线性关系表达式为:y = -3.471ogx+42.18;相关系数R2为0.999;扩增效率为 94%。标准曲线见图2,标准曲线扩增曲线见图3。
[0056] (2)探针灵敏性检测
[0化7] 将MAD-3引物对扩增基因重组质粒进行10倍梯度稀释，从4.5 X IO9CopiesAiL稀释 至4.5 X 10*^。〇口163/化，从中选取4.5 X 1〇7(3〇口163/化至4.5 X 10*^。〇口163/化的质粒标准品进 行灵敏性检测。结果见表3和图4，在40个循环内，140-3最小可^检测到10*\探针灵敏性较 好。
[0化引 表3 [0化9]
[0060] 注:N/A表示未检测到，即低于检测下限。
[0061 ]实施例4稳定性和重复性实验
[0062] 取DNA及同一批PCR检测试剂保存于-20°C冰箱，每隔一段时间取检测样品和检测 试剂，利用MAD-3引物对和探针进行qPCR检测，连续测3次。每次试验各做3个重复，PCR扩增 体系和反应程序实施例1，扩增结果见表4,说明本发明检测试剂和检测方法稳定性和重复 性均较好。
[0063] 表 4
[0064]
[0065] 实施例5实际检测应用
[0066] 应用MAD-3引物对及探针，W不含任何病毒的水作为阴性对照，W小鼠腺病毒DNA 为阳性对照，分别对6个沙鼠肝脏(G1~G6)、6个沙鼠肺脏(FI~F6)、27个沙鼠粪便(FB-61~ 87)、5个野鼠肝脏化Z-C-I，监-C-2,监-d-1，监-6-1，S册-d-1)、3个野鼠粪便化N-a-1，細2-a-1，S册-a-1 )DNA样本进行化qMan探针巧光定量检测，结果见表5和图5，运些动物样本中均 未检测到小鼠腺病毒。
[0067]表 5
[006引
[0069
[0070] 注:N/A表示未检测到，即低于检测下限。
【主权项】
1. 引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，核苷酸序列为： 上游引物：5 ' -TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG-3 ' ； 下游引物:5 ' -RGGCAACACAGCCTCCAR-3 '。2. 如权利要求1所述的引物对在制备检测小鼠腺病毒试剂盒中的应用。3. -种用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所 述的引物对。4. 如权利要求3所述的用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，探针 为:5'-R-ACCRTGGTTTACTAGACGMGAYGCMA-Q-3'，其中，5'端的R为荧光报告基团；3'端的Q为 荧光淬灭基团。5. 如权利要求3所述的用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含 阳性对照DNA。6. 如权利要求5所述的用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述 阳性对照DNA为包含如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重组质粒。7. 如权利要求3~6任一所述的荧光定量PCR试剂盒在检测动物制品或动物实验废弃物 中小鼠腺病毒残留中的应用。8. -种检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于，以待检测样品的DNA为模板， 利用如权利要求1所述的引物对进行荧光定量PCR反应。9. 如权利要求8所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应体系为： 2><TaqMan Gox Master Mix 1:2.5 :μ[ 10 μΜ的上游引物 0.5 μL 10 μΜ的下游引物 0.5 ,UL 5 μΜ的探针 1.0 μL 10 tig/pL 的模板 DMA 1.0 .uL 补水3、: 25 ,uL。10. 如权利要求8所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应条件为:50 。(:培育2min;95°C预变性10min;95°C变性15s，60°C退火lmin，共40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK105861751SQ201610324075
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】戴方伟, 杜江涛, 周莎桑, 宋晓明, 吕宇, 萨晓婴, 褚晓峰
【申请人】浙江省医学科学院