检测寨卡病毒的巢式rt-pcr方法、引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了两组引物对，其中一组引物对包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，另一组引物对包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，本发明还提供了所述两组引物对在制备检测寨卡病毒的产品中的应用，同时本发明还提供了含有该两组引物对的试剂盒及应用。经实验证明，本发明的两组引物对特异性好、灵敏度高且重复性好，且基于该两组引物对建立的寨卡病毒的检测方法，可灵敏、准确、稳定和快速的检测寨卡病毒的存在，对我国的寨卡病毒临床快速诊断和公共防控都具有重要的意义。
【专利说明】
检测寨卡病毒的巢式RT-PCR方法、引物及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及生物检测领域，特别设及检测寨卡病毒的巢式RT-PCR方法、引物及试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)于1947年首次在乌干达从恒河猴体内被发现，1952 年在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到病毒。ZIKV通过受到感染的伊蚊属蚊虫叮咬传播到 人，运主要设及热带地区的埃及伊蚊。它与传播登革热、基孔肯雅热和黄热病的蚊虫相同。 然而，已有两例寨卡病毒通过性传播的病例，在另一例病例中发现精液中存在寨卡病毒。
[0003] 近年来ZIKV感染病例和暴发疫情的国家及地区增加明显，2007年首次在太平洋岛 国密克罗尼西亚的雅浦岛出现寨卡病毒暴发疫情，2013年和2015年又分别在法属波利尼西 亚和己西发生大型疫情。已有的研究表明寨卡病毒病可能会造成神经和自身免疫系统并发 症，在己西出现的疫情中，当地卫生当局发现在普通民众中寨卡病毒感染和吉兰-己雷综合 征同时有所上升，目前研究人员正在对吉兰-己雷综合征病例激增与寨卡病毒感染之间潜 在的但尚未证实的联系进行研究。另外越来越多的证据表明寨卡病毒与小头症之间存有关 联。2015年5月，己西报告首例寨卡病毒病病例，同年10月，己西报告新生儿小头崎形明显上 升，时空分布与寨卡病毒流行区相吻合。然而，在能够更好地解释婴儿小头症与寨卡病毒之 间的关系之前仍需要做出更多调查，目前对其它可能病因还在开展进一步调查。
[0004] 寨卡病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，为单链正义RNA 病毒，基因组全长约10.8化。寨卡病毒粒子呈球形，直径约40-70nm。分子生物学和生物信息 学分析表明，寨卡病毒主要存在非洲型和亚洲型两个亚型，在系统发生树上与同为黄病毒 属的登革病毒、日本脑炎病毒及西尼罗病毒相近。寨卡病毒基因组只有一个开放读码框 (open reading frame，0RF)，所编码的蛋白前体经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切割成不同的 功能蛋白，包括3个结构蛋白（C、prM/M、E)和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B、NS5)。
[0005] 2016年2月9日，国家卫生和计划生育委员会通报中国确诊第一例输入性寨卡病毒 感染病例，此后输入性感染病例时有报告发生，说明我国针对寨卡病毒的防控形势严峻。目 前还没有针对寨卡病毒的巢式RT-PCR检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高和重复性好的巢式RT-PCR检测寨卡病毒的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高和重复性好的 两组引物对和含有该两组引物对的试剂盒及应用。
[0007] 本发明第一方面提供了两组引物对，其中一组引物对包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列，另一组引物对包含SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的核巧酸序 列。
[0008] 本发明第二方面提供了所述的两组引物对在制备检测寨卡病毒的产品中的应用。
[0009] 在一优选例中，所述检测寨卡病毒的产品还包括PCR扩增试剂。
[0010] 本发明第=方面提供了一种试剂盒，包括所述的两组引物对。
[0011] 在一优选例中，还包括PCR扩增试剂。
[001^ 在一优选例中，所述PCR扩增试剂包括来自TaKaRa公司的货号为RR019A的！'aKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒所包含的5XPCR Buffer和Ex hq服DNA聚合酶。
[OOU] 在一优选例中，还包括阳性对照和阴性对照。
[0014] 在一优选例中，还包括RNA提取试剂。
[001引在一优选例中，所述RNA提取试剂包括来自QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒所包含的试剂。
[0016] 在一优选例中，还包括逆转录试剂。
[0017] 在一优选例中，所述逆转录试剂包括来自^KaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒所包含的试剂。
[001引在一优选例中，所述来自TaKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 试剂盒所包含的试剂为 MgCl2、dNTP Mixture、R化 Se Inhibi tor、AMV Reverse Transc;rip1:ase XL、Random 9mers和RNase Rree 地20中的至少一种。
[0019] 本发明第四方面提供了所述的试剂盒在制备检测寨卡病毒的产品中的应用。
[0020] 本发明第五方面提供了一种筛选易患寨卡病毒病的生物样品的系统，包括：
[0021] 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；
[0022] 巢式RT-PCR装置，所述巢式RT-PCR与所述核酸提取装置相连，适用于采用权利要 求1所述的两组引物对所述核酸样本进行巢式RT-PCR反应；W及
[0023] 判断装置，所述判断装置与所述巢式RT-PCR装置相连，W便基于巢式RT-PCR反应 的结果，判断所述生物样品是否易患寨卡病毒病。
[0024] 在一优选例中，所述核酸提取装置进一步包括：
[0025] RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本;W及
[0026] 逆转录单元，所述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行 逆转录反应，W便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
[0027] 在一优选例中，所述生物样品为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为质 粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂。
[002引在一优选例中，当生物样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片 段的试剂，或为质粒时，将其直接作为核酸样本与所述两组引物对进行巢式RT-PCR反应。
[0029] 在一优选例中，当生物样品为含有DNA和/或RNA的血液、尿液、细胞或组织，或为 mRNA，或为含有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、CDNA或CDNA片段的核酸样本再与所述两组 引物对进行巢式RT-PCR反应。
[0030] 在一优选例中，所述巢式RT-PCR反应的反应体系如下：
[0031] 第一轮反应体系：
[0032] 5 XPCR Buffer 10化
[003；3] Ex化9服DNA聚合酶0.2化1
[0034] 引物对沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2浓度为IOiiM，各0.化1
[0035] DNA或cDNA或cDNA片段I X IO3-I X IO9拷贝/化，化L
[0036] 加入无核酶水至总反应体积为SOiiL得到巢式RT-PCR第一轮反应的PCR产物；
[0037] 第二轮反应体系：
[0038] 5 X PCR Buffer 10化
[0039] Ex hq 服 DNA聚合酶 0.2^iL，
[0040] 引物对沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4浓度为IOiiM，各0.化1
[0041 ] 巢式RT-PCR第一轮反应的PCR产物化L
[0042] 加入无核酶水至总反应体积为SOiiL
[0043] 所述5XPCRBuffer和Exl'aqHSDNA聚合酶来源于l'aKaRa公司的货号为RR019A 的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒。
[0044] 在一优选例中，所述第一轮反应的程序如下：94°C45s，50°C45s，72°C Imin，35个循 环;所述第二轮反应的程序如下:94°C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35个循环。
[0045] 本发明有如下有益效果：
[0046] (1)本发明针对寨卡病毒设计的引物特异性好、灵敏度高且重复性好。
[0047] (2)本发明建立的寨卡病毒的巢式RT-PCR方法，可对寨卡病毒进行定性检测。
[0048] (3)本发明建立的寨卡病毒的巢式RT-PCR方法特别适用于临床样品的检测，其检 测的灵敏度可达到IXIO 3拷贝AiL的病毒分子，操作简易，结果稳定，对我国的寨卡病毒临 床快速诊断和公共防控都具有重要的意义。
【附图说明】
[0049] 图1为本发明两组引物对、试剂盒W及检测方法对寨卡病毒的巢式RT-PCR特异性 验证的琼脂糖凝胶电泳图，共有八条泳道:其中M为marker化2000，1为插入ZIKV E蛋白基 因 CDNA的阳性质粒对照的巢式RT-PCR扩增产物，2为ZIKVl的巢式RT-PCR扩增产物，3为 ZIKV2的巢式RT-PCR扩增产物，4为登革热病毒的巢式RT-PCR扩增产物，5为基孔肯雅病毒的 巢式RT-PCR扩增产物;6为黄病毒的巢式RT-PCR扩增产物;7为用无核酶水作为阴性对照的 巢式RT-PCR扩增产物。
[0050] 图2为本发明两组引物对、试剂盒W及检测方法对寨卡病毒的巢式RT-PCR灵敏性 验证的琼脂糖凝胶电泳图，共有十一条泳道:其中M为marker化2000,1-9分别为浓度依次 为lXl〇9拷贝/化、lXl〇8拷贝/化、lXl〇7拷贝/化、lXl〇6拷贝/化、lXl〇5拷贝/化、lXl〇4 拷贝AiUl X IO3拷贝/化、1 X IO2拷贝AiL和1 X 1〇1拷贝AiL的质粒，10为无核酶水阴性对照。
[0051] 图3为本发明第一组引物对针对寨卡病毒的RT-PCR反应的灵敏性验证的琼脂糖凝 胶电泳图，共有^^一条泳道:其中M为marker化2000,1-9分别为浓度依次为IX IO9拷贝Ai L、1X108拷贝/化、1X107拷贝/化、1X106拷贝/化、1X105拷贝A^L、1X104拷贝/化、1X103 拷贝AiUl X IO2拷贝AiL和1 X 1〇1拷贝AiL的质粒，10为无核酶水阴性对照。
【具体实施方式】
[0052] 除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
[0053] 下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，运些实施例仅仅 是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领 域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂 商者，均为可W通过市购获得的常规产品。
[0化4] 实施例1
[0055]本实施例提供了一种检测寨卡病毒的两组引物对及其应用。
[0化6] 两组引物对的设计:利用GenBank中现有的71条ZIKV全基因组序列进行多序列比 对，选择ZIKV包膜蛋白（envelope protein)的保守区域（536bp，SEQ. ID.No.5)作为祀序列 设计两组引物对。
[0057] 两组引物对的具体序列如表1所示：
[0化引 表1
[OOWl
[0060] 表1中，ZIKV/lst/F代表巢式RT-PCR第一轮反应的上游引物，ZIKV/lst/R代表巢式 RT-PCR第一轮反应的下游引物，ZIKV/化d/F代表巢式RT-PCR第二轮反应的上游引物，ZIKV/ 2nd/R代表巢式RT-PCR第二轮反应的下游引物。引物序列中的M代表A或C，R代表A或G，Y代表 C或T，S代表C或G。
[0061 ] 所述SEQ.ID.No.5的具体序列为：
[0062] acaggccttgacttttcagatttgtattacttgactatgaataacaagcactggttggttcacaaggagtggttcca Cg曰C曰ttcc曰tt曰CCttggC曰CgctggggC曰g曰C曰CCgg曰曰Ctcc曰C曰Ctgg曰曰C曰曰C曰曰曰g曰曰gc曰Ctggtegsgt tC曰曰gg曰CgC曰C曰tgCC曰曰曰曰ggC曰曰曰CtgtCgtggttcteggg3gtC33g33gg3gC3gttC3C3CggCCCttgCt 邑邑曰邑Ctct邑邑曰邑邑Ct邑曰邑曰t邑邑曰t邑邑t邑C曰曰曰邑邑邑曰曰邑邑Ct邑tcctct邑邑CC曰Ctt邑曰曰曰t邑tc邑CCtgsssstggs taaacttagattgaagggcgtgtcatactccttgtgtaccgcagcgttcacattcaccaagatcccggctgaaacac t邑C曰C邑邑邑曰C曰邑tc曰C曰邑t邑邑曰邑邑t曰C曰邑t曰C邑C曰邑邑邑曰C曰邑曰t邑邑曰CCtt邑C曰曰邑邑ttcc曰邑CtcsgstggCggtg g曰C曰tgc曰曰曰ctctg曰CCCC曰gttggg曰ggttg曰t曰曰CCgCt曰曰CCCCgt曰曰tc曰Ctg曰曰曰gc曰Ctg曰g曰曰etc
[0063] 上述两组引物对均由上海生工生物工程有限公司合成。
[0064] 上述两组引物对可应用于在制备检测寨卡病毒的产品，所述检测寨卡病毒的产品 还包括PCR扩增试剂。
[00化]实施例2
[0066] 本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
[0067] (1)实施例1的两组引物对；
[0068] (2)PCR 扩增试剂。
[0069] 所述PCR扩增试剂包括来自TaKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR KitVer.3.0试剂盒所包含的5XPCR Buffer及Ex hq服DNA聚合酶。
[0070] 实验证明，上述PCR扩增试剂与两组引物对的联合使用，效果更加优越，具体表现 在可重复性好、特异性强，灵敏度高的特点。
[0071] 所述试剂盒还可W进一步包括：
[0072] (3)阳性对照和阴性对照；
[0073] (4)RNA 提取试剂；
[0074] (5)逆转录试剂。
[00巧]所述阳性对照为插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA(上海生工生物工程股份有 限公司合成）的质粒。
[0076] 所述RNA提取试剂包括来自QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒所包含的试剂;所述逆转录试剂包括来自化KaRa公司的货号为RRO19A 的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒所包含的试剂，例如MgCl2、dNTP Mixture、 RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase XL、Random 9mers、RNase Free d出0。
[0077] 上述试剂盒可应用于检测寨卡病毒。
[007引实施例3
[0079] 本实施例提供了一种检测寨卡病毒的方法，例如检测生物样品中寨卡病毒的存 在，该方法使用了实施例1的两组引物对及实施例2的试剂盒。
[0080] 上述生物样品为包含有DNA和/或RNA的血液、尿液、细胞或组织，或为质粒，或为 DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂。
[0081 ] 当生物样品为DNA、cDNA或CDNA片段，或为含有DNA、cDNA或CDNA片段的试剂，或为 质粒时，将其直接作为模板与所述两组引物对进行巢式RT-PCR反应。
[00剧当生物样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA,或为含有mRNA的 试剂时，将其转化为DNA、CDNA或CDNA片段再与所述两组引物对进行巢式RT-PCR反应。
[0083] 检测寨卡病毒的方法包括如下步骤：
[0084] 1.巢式RT-PCR扩增反应
[0085] 巢式RT-PCR第一轮反应：取hKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒所包含的5XPCR Buffer ^化，虹化q服DNA聚合酶0.25化，实施例1中的 IOiiM的ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R各0.扣L，化L DNA或cDNA片段（lXl〇3-lXl〇9拷贝/化），加 入无核酶水至总反应体积为50化，同时设阴性对照和阳性对照，阴性对照为去离子水，阳性 对照为插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的质粒，进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序如 下：94 °C 45s，50 °C 45s，72 °C Imin，35个循环，得到巢式RT-PCR第一轮反应PCR产物。
[00化]巢式RT-PCR第二轮反应：取hKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 试剂盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，实施例 1中的IOiiM的ZIKV/2nd/F和ZIKV/2nd/R各0.扣L，1化巢式RT-PCR第一轮反应PCR产物，加入 无核酶水至总反应体积为50化，同时设阴性对照和阳性对照，阴性对照为去离子水，阳性对 照为插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的质粒，进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序如下： 94 °C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35个循环，得到巢式RT-PCR第二轮反应PCR产物。
[0087] 2.判断生物样品中寨卡病毒的存在
[0088] 取化L巢式RT-PCR第二轮反应的PCR产物进行琼脂糖电泳分析，在凝胶成像系统上 观察结果。
[0089] 所述巢式RT-PCR扩增的结果判断的标准为：
[0090] 若所述巢式RT-PCR扩增得到的巢式RT-PCR扩增产物含有大小约为35加 P的片段， 代表生物样品中含有寨卡病毒，为阳性;若所述巢式RT-PCR扩增得到的巢式RT-PCR扩增产 物不含有大小约为35化P的片段，代表生物样品中未含有寨卡病毒，为阴性。
[0091] 如果上述生物样品还未转化为DNA、CDNA或CDNA片段，上述方法步骤1巢式RT-PCR 扩增反应之前还可W包括使用QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒中的试剂按照试剂盒说明书对生物样品中的RNA进行提取，W及用来自 hKaRa公司的货号为RR019A的！'aKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒所包含的试剂对 提取的RNA进行逆转录的步骤。
[0092] 实施例4
[0093] 本实施例对实施例1的两组引物对、实施例2的试剂盒W及实施例3的检测方法进 行了有效性或可靠性验证，具体包括如下步骤：
[0094] 1.样品制备
[00M]所用的供试材料如下：两例输入性ZIKV感染者的血清(均来自中国科学院微生物 研究所）W及20份临床疑似低热病人的血清(来自深圳市第=人民医院检验科血常规检查 后剩余的血液样本，"疑似"代表怀疑为ZIKV感染者但经检测后却不为ZIKV感染者），用 QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒中的试剂按照 试剂盒说明书进行RNA提取，然后对提取的RNA进行逆转录，逆转录采用TaKaRa公司的货号 为RR019A的化KaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒中的试剂按照说明书进行，逆转录体 系如下：
[0096]
[0097] 其中MgCl2、dNTP Mixture、脚ase Inhibitor'AMV Reverse Transcriptase XL、 Random 9mers、脚ase Free 加 2〇均来自TaKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver .3.0试剂盒。所述逆转录反应条件如下:42°C反应30min，95°C5min终止反应； 逆转录后得到CDNA。
[0098] 2.巢式RT-PCR扩增反应
[0099] 巢式RT-PCR第一轮反应：取hKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver. 3.0 试剂盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，实施例 1中的IOiiM的ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R各0.扣L，化L步骤1得到的cDNA，加入无核酶水至总 反应体积为50yL，同时设阴性对照和阳性对照，阴性对照为去离子水，阳性对照为插入人工 合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的质粒，进行PCR扩增，得到巢式RT-PCR第一轮反应的PCR产物， 所述PCR扩增的程序如下：94°C 45s，50 °C 45s，72 °C Imin，35个循环。
[0100] 巢式RT-PCR第二轮反应：取hKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 试剂盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，实施例 1中的IOiiM的ZIKV/2nd/F和ZIKV/2nd/R各0.扣L，化L DNA(巢式RT-PCR第一轮反应的PCR产 物，即祀序列），加入无核酶水至总反应体积为50yL。同时设阴性对照和阳性对照，阴性对照 为去离子水，阳性对照为插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的质粒，进行PCR扩增，所述 PCR 扩增的程序如下：94°C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35 个循环。
[0101] 3.判断生物样品中寨卡病毒的存在
[0102] 取化L巢式RT-PCR第二轮反应的PCR产物进行琼脂糖电泳分析，在凝胶成像系统上 观察结果。
[0103] 结果显示只有插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的质粒阳性对照和两例ZIKV 感染者的血清都可W检测到ZIKV，而其余20份临床疑似样本及阴性对照均没有检测到 ZIKV，说明本发明所设及的两组引物对、实施例2的试剂盒W及实施例3的检测方法是可靠 且有效的。
[0104] 实施例5
[0105] 本实施例对实施例1的两组引物对、实施例2的试剂盒W及实施例3的检测方法进 行了特异性验证，具体包括如下步骤：
[0106] 1.样品制备
[0107] 所用的供试材料如下：两株ZIKV和一株登革热病毒活病毒(均来源于中国科学院 微生物研究所），ZIKV阳性对照为人工合成ZIKV E蛋白基因的CDNA(上海生工生物工程股份 有限公司），人工合成基孔肯雅病毒或黄病毒的基因组全长CDNA用于引物特异性检测，合成 cDNA经克隆分别保存在T载体(Promega公司货号A3610的pCiEM⑥-T Vector System II) 中。
[010引用QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒中 的试剂按照试剂盒说明书提取RNA，然后对提取的RNA进行逆转录，逆转录按照化KaRa公司 的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书进行，逆转录体系如 下：
[0109] 10 X RT Biiffer 1 jiL
[0110]
[0111]其中MgCl2、dNTP Mixture、脚ase Inhibitor'AMV Reverse Transcriptase XL、 Random 9mers、脚ase Free 加 2〇均来自TaKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 试剂盒。
[0112] 所述逆转录的反应条件如下：42°C反应30min，95°C5min终止反应;逆转录后得到 cDNA。
[0113] 2.巢式RT-PCR扩增反应
[0114] 巢式RT-PCR第一轮反应：取hKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 试剂盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，实施例 1中的IOiiM的ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R各0.扣L，化L步骤1得到的cDNA，加入无核酶水至总 反应体积为50yL，同时设阴性对照和阳性对照，阴性对照为去离子水，阳性对照为插入人工 合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的质粒，进行PCR扩增，得到PCR产物，所述PCR扩增的程序如下： 94°C45s，50°C45s，72°Clmin，35 个循环。
[0115] 巢式RT-PCR第二轮反应：取hKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 试剂盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，实施例 1中的IOiiM的ZIKV/2nd/F和ZIKV/2nd/R各0.化L，化L DNA(巢式RT-PCR第一轮反应得到的 PCR产物，即祀序列），加入无核酶水至总反应体积为50化。同时设阴性对照和阳性对照，阴 性对照为去离子水，阳性对照为插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的质粒，进行PCR扩 增，所述PCR扩增的程序如下:94°C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35个循环。
[0116] 3.判断生物样品中寨卡病毒的存在
[0117] 取化L巢式RT-PCR第二轮反应的PCR产物进行琼脂糖电泳分析。在凝胶成像系统上 观察结果。
[0118] 结果如图1所示，从图中可W看出，只有ZIKV阳性对照及两株ZIKV血清样本的巢式 RT-PCR或巢式RT-PCR扩增产物在约35化P处有条带，可W被特异性地扩增，均呈阳性;而登 革热病毒、基孔肯雅病毒、黄病毒W及阴性对照的巢式RT-PCR或巢式RT-PCR扩增产物在约 355bp处均无条带，不能被特异性地扩增，均呈阴性。由此证明本发明实施例1的两组引物 对、实施例2的试剂盒均具有高特异性;进一步的，本发明基于实施例1的引物和实施例2的 试剂盒建立的检测方法能够准确的对寨卡病毒进行检测。
[0119] 实施例6
[0120] 本实施例对实施例1的两组引物对、实施例2的试剂盒W及实施例3的检测方法进 行了灵敏性验证，具体包括如下步骤：
[0121] 1.样品准备
[0122] 将SEQ. ID.No.5(巢式第一轮PCR产物）插入T载体（Promega公司货号A3610的 pGEM?-T Vector System II)构建质粒，将所构建的质粒进行10倍稀释，共计8个梯度， 使其浓度为1 X IO9-I X 1〇1拷贝/化。
[0123] 2.巢式RT-PCR扩增反应
[0124] W上述样品为模板，进行巢式RT-PCR扩增反应，巢式RT-PCR扩增反应的方法和条 件同实施例5。
[0125] 结果如图2所示，本发明所设计的巢式RT-PCR检测方法可W检测到的最低浓度是1 X103拷贝每微升。而仅用ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R直接进行普通RT-PCR扩增（即仅进行巢 式RT-PCR第一轮反应），可W检测到的最低浓度为IX IO5拷贝/化，结果如图3所示。W上结 果说明本发明所设计的巢式RT-PCR检测方法比普通RT-PCR灵敏度高100倍。
【主权项】
1. 两组引物对，其特征在于，其中一组引物对包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的 核苷酸序列，另一组引物对包含SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的两组引物对在制备检测寨卡病毒的产品中的应用； 任选的，所述检测寨卡病毒的产品还包括PCR扩增试剂。3. -种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的两组引物对。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于:还包括PCR扩增试剂； 所述PCR扩增试剂包括来自TaKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒所包含的5XPCR Buffer和Ex Taq HS DNA聚合酶； 任选的，还包括阳性对照和阴性对照； 任选的，还包括RNA提取试剂； 任选的，所述RNA提取试剂包括来自QIAGEN公司的货号为 52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒所包含的试剂； 任选的，还包括逆转录试剂； 任选的，所述逆转录试剂包括来自TaKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0试剂盒所包含的试剂； 任选的，所述来自TaKaRa公司的货号为RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试 剂盒所包含的试剂为MgCl2、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase XL、Random 9mers和RNaseFree dH2〇中的至少一种。5. 权利要求4所述的试剂盒在制备检测寨卡病毒的产品中的应用。6. -种筛选易患寨卡病毒病的生物样品的系统，其特征在于，包括： 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本； 巢式RT-PCR装置，所述巢式RT-PCR与所述核酸提取装置相连，适用于采用权利要求1所 述的两组引物对所述核酸样本进行巢式RT-PCR反应;以及 判断装置，所述判断装置与所述巢式RT-PCR装置相连，以便基于巢式RT-PCR反应的结 果，判断所述生物样品是否易患寨卡病毒病。7. 根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括： RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本；以及逆转录单元，所 述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得 cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。8. 根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述生物样品为包含有DNA和/或RNA的血 液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或 cDNA片段的试剂； 任选的，当生物样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或 为质粒时，将其直接作为核酸样本与所述两组引物对进行巢式RT-PCR反应； 任选的，当生物样品为含有DNA和/或RNA的血液、尿液、细胞或组织，或为mRNA，或为含 有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段的核酸样本再与所述两组引物对进行巢 式RT-PCR反应。9. 根据权利要求8所述的系统，其特征在于： 所述巢式RT-PCR反应的反应体系如下： 第一轮反应体系： 5XPCR Buffer 10yL Ex Taq HS DNA聚合酶 0.25yL 引物对SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2浓度为ΙΟμΜ，各0.5yL DNA 或 cDNA 或 cDNA 片段 1 X 103-1 X 109拷贝 AiL，2yL 加入无核酶水至总反应体积为50yL;得到巢式RT-PCR第一轮反应的PCR产物； 第二轮反应体系： 5XPCR Buffer 10yL Ex Taq HS DNA聚合酶 0.25yL， 引物对SEQIDN0:3和SEQIDN0:4浓度为10μM，各0.5μL 巢式RT-PCR第一轮反应的PCR产物lyL 加入无核酶水至总反应体积为50yL; 所述5XPCR Buffer和Ex Taq HS DNA聚合酶来源于TaKaRa公司的货号为RR019A的 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒。10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于:所述第一轮反应的程序如下：94 °C45s，50 °C45s，72°Clmin，35 个循环； 所述第二轮反应的程序如下:94°C45s，55 °C45s，72 °C lmin，35个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK105861753SQ201610353475
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】高福, 刘映霞, 王强, 毕玉海, 杨扬, 郑海霞
【申请人】深圳市第三人民医院