用作抗炎药的药物活性化合物的制作方法
【专利摘要】本申请涉及式(I)的药用活性化合物及其作为抗炎药的可能的用途。此外，本申请涉及用于制备式(I)的化合物的方法以及涉及包含式(I)的化合物的药物组合物。
【专利说明】用作抗炎药的药物活性化合物
[0001] 本发明设及式(I)的药用活性化合物及其作为抗炎药的用途。此外，本发明设及用 于制备式(I)的化合物的方法W及设及包含式(I)的化合物的药物组合物。
[0002] 肿瘤坏死因子a(TNF-a)是与全身性炎症有关的脂肪因子(adipokine)并且是刺激 急性期反应的细胞因子组的成员。其主要由活化的巨隧细胞(Ml)产生，尽管其可W由许多 其他细胞类型如CD4+淋己细胞、NK细胞和神经元产生。
[0003] TNF-a的主要作用在于免疫细胞的调控。TNF-a作为内源性致热原能够引起发热、 细胞调亡性细胞死亡、恶病质（cachexia)、炎症，并且能够抑制肿瘤发生和病毒复制，并且 经由产生IL1IL6的细胞对脈毒症（sepsis)响应。TNF-a产生的调节障碍已经与多种人类疾 病有关，包括阿尔茨海默病（Al Zheimer^ S disease)、癌症、重度抑郁症（major depress ion)和炎性肠病（inf IammatoiT bowel disease，I抓）。尽管仍有争议，抑郁症和 I抓的研究目前由TNF-a水平联系起来。重组TNF-a可W在恶性肿瘤的环境中异位产生，并且 在导致继发性高巧血症（Se condaiT hypercalcemia)和在与过度产生（excessive production)相关的癌症方面与甲状旁腺激素相似。
[0004] 因此，为了提供上述疾病的有效治疗，对TNF-a抑制剂存在高的需求。TNF-a抑制剂 是抑制对TNF-a的反应的药学药物。TNF-a的抑制可W，例如，利用单克隆抗体或利用循环受 体融合蛋白如依那西普(61日1161^巧1：)实现。
[0005] 通常W其Enbref的商品名而已知的依那西普由与IgGl的Fc部分连接的两个自然 存在的可溶性人类75-W)a TNF反应器的组合制成。结果是人工改造的二聚体融合蛋白。在 美国，FDA已经批准技lbrel"用于中度至重度类风湿性关节炎(rheumatoid adhritis)、中 度至重度多关节(p〇lya：rti州Iar)幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis， JIA)、银屑病关节炎(psoriatic a;rth;ritis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis， AS)和中度至重度斑块状银屑病(plaque psoriasis)。然而，用Enbref治疗的患者也遭遇 严重的副作用，包括感染或患者已经具有的感染的恶化；乙型肝炎的再活化；神经系统问 题，如多发性硬化(multiple sclerosis)、眼睛神经的发作或炎症;血液问题；屯、力衰竭;银 屑病(psoriasiS);过敏反应；和自身免疫反应，包括狼疮样综合征（Iupus-I化e syn化ome) 和自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)。
[0006] 通常W其Remicade'i的商品名而已知的英夫利昔单抗（infliximab)是在美国被 批准用于治疗银屑病（psoriasis )、克罗恩病（Crohn/ S disease)、强直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis)、银屑病关节炎（psoriatic a;rth;ritis)、类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis)和溃瘍性结肠炎（ulcerative colitis)的TNF-a抑制剂。 是首先在小鼠中作为小鼠抗体开发的人工抗体。因为人对小鼠蛋白具有免疫 反应，所W用相似的人抗体结构域代替小鼠通用结构域。由于小鼠和人抗体氨基酸序列的 组合，其被称为嵌合单克隆抗体。然而，英夫利昔单抗具有对免疫抑制药类中的药物来说常 见的副作用，包括严重的并且有时致命的血液病症;严重感染;淋己瘤和实体组织癌症;严 重肝脏损伤；乙型肝炎的再活化;肺结核的再活化;致死性肝脾T细胞淋己瘤;药物引发的狼 疮；脱髓銷（demyelinating)中枢神经系统病症；银屑病和银屑病样皮肤损伤 (psoriasiform skin lesion)和新发病的白齋风(vitiligo)。
[0007]由于目前市场上的已知的TNF-a抑制剂伴随严重的副作用的事实，部分由于它们 是蛋白质的事实，W及由于它们的高成本，对不遭遇上述不足并且能够克服已知抗体TNF-a 抑制剂的缺点的TNF-a抑制剂仍然存在高的需求。
[000引US 5,506,224描述了径胺的N-酷基-衍生物，其适用于特征如下的病理状态的治 疗处理：由于神经原性和/或免疫原性过度刺激导致的肥大细胞的脱颗粒 (degranulation)。然而，在其中公开的化合物的施用可能会伴随被认为是不利的血液中亚 硝酸盐/硝酸盐水平的增加。
[0009] 因此本发明的目的是提供药用活性化合物，优选起TNF-a抑制剂作用的抗炎药W 及包含其的用于治疗炎性过程、尤其是炎性肠病的药物组合物。
[0010] 本发明的另一个目的是提供药用活性化合物，其施用不导致现有技术的缺点，尤 其是与患者血液中亚硝酸盐/硝酸盐水平相关的缺点。
[0011] 通过提供意外地显示出在炎性过程治疗中的活性的式(I)的化合物解决了本发明 的目的。
[0012]本发明的一个目的因此是式（I)的化合物：
[0013
:[)
[0014」在不受理论约束的情况下，据信，在a碳不存在氨原子增加了式（I)的化合物的化 学和生物稳定性，同时增加的径基数量引起增加的水溶性和增加的结晶倾向，运在根据本 发明的化合物的制造中是有利的。此外，据信，例如与现有技术水平中描述的通常已知的乙 醇胺衍生物相比，酷胺键由于空间位阻而更稳定。
[001引如对于本领域技术人员来说已知的，药物，例如乙酷水杨酸(ASS)在炎性过程的治 疗中的施用可能会导致患者血液中亚硝酸盐/硝酸盐水平的增加。然而，已知亚硝酸盐是有 毒的，因为它们通过影响血红蛋白而阻止血液中氧的运输。此外，亚硝酸盐可W起一氧化氮 的供体的作用，其进而可W导致平滑肌的松弛和血管舒张，结果是血压的大幅降低、循环虚 脱(circulate巧collapse)和甚至休克。现在意外地发现，根据本发明的化合物的施用不 导致与其他药物如ASS结合时经历的亚硝酸盐/硝酸盐水平的预期增加。相反，在用根据本 发明的化合物治疗的动物中，与未处理的对照动物相比，几乎不能检测到亚硝酸盐/硝酸盐 水平的增加。
[0016]在本发明的优选实施方案中，式（I)的化合物作为盐存在。优选地，抗衡离子是有 机或无机性质的药用抗衡离子，如乙酸根、栋桐酸根、巧樣酸根、硫酸根、碳酸根和盐酸根。
[0017] 优选地，式(I)的化合物用于与人或动物身体的炎性过程相关的疾病的治疗和/或 预防，尤其是选自由下列各项组成的组的疾病：炎性肠病、银屑病、克罗恩病、强直性脊柱 炎、关节炎(尤其是银屑病关节炎和类风湿性关节炎）、和溃瘍性结肠炎。
[0018] 意外地发现，式(I)的化合物具有高药用活性，尤其是当在炎性过程的治疗中使用 时。因此本发明的另一个目的是如在本发明中定义的式(I)的化合物的抗炎药。
[0019] 因为仍然存在对有效且价格合理的药物的高需求，本发明的另一个目的是包含式 (I)的化合物的药物组合物
[0020
；1)
[0021] 在更优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含式（I)的化合物或其药用 盐。
[0022] 优选地，根据本发明的药物组合物包含药学上有效量、优选基于所述药物组合物 的总重量在0.001至10重量％范围内的式（I)的化合物或其药用盐。优选地，式（I)的化合物 或其药用盐的量足够高W在药学上有效。
[0023] 已经发现了根据本发明的药物组合物在TNF-a的抑制中的令人惊讶的活性。TNF-a 的增加与炎性过程、尤其是炎性疾病如银屑病、关节炎和炎性肠病相关。
[0024] 此外，已经意外地发现，本发明的化合物降低过氧化物酶活性，运与其他乙酷水杨 酸衍生物如选自由0-乙酷水杨基氨基碳水化合物、0-乙酷水杨基氨基酸和0-乙酷水杨基肤 组成的组的0-乙酷水杨基衍生物相比的优势。
[0025] 此外，已经意外地发现，本发明的化合物降低血浆中高迁移率族蛋白（high-mobility group protein)Bl的浓度，运使得该化合物成为在治疗年龄相关的疾病中的令 人感兴趣的候选物。本发明的化合物正面影响氧化还原平衡。
[0026] 因此，在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物可W用于尤其选自肥胖症、 肌肉减少症（sarcopenia)、代谢综合征(metabolic syn化ome)、痴呆（dementia)、癌症、动 脉粥样硬化(atherosclerosis)和骨质疏松(osteoporosis)的病理性老化的治疗或预防。
[0027] 本发明的另一个方面是其中药物组合物用于炎症的治疗和预防的实施方案。优选 地，药物组合物用于哺乳动物的治疗。更优选的是其中根据本发明的药物组合物用于疼痛 和发热的治疗的实施方案。
[0028] 任何药用活性化合物或组合物需要在完全适当注意的情况下使用，尤其是应在所 有情况下避免过量。因此，药物组合物优选W在每kg体重且每天0.0 Ol至0.3g范围内的剂量 施用。更优选的是其中用于炎症的治疗和预防的药物组合物W在每kg体重且每天0.001至 〇.3g范围内的剂量施用的实施方案。
[0029] 在具体的实施方案中，剂量可W根据患者的病况和待处理的疾病而变化。更优选 的剂量在每kg体重且每天0.005至0.15、更优选0.0 l至0.1或0.05至0.5g的范围内。
[0030] 具体地，其中根据本发明的药物组合物用于选自由下列各项组成的组的疾病的治 疗或预防的本发明的实施方案是优选的：
[003。 a)银屑病，
[0032] b)克罗恩病，
[0033] C)强直性脊柱炎，
[0034] d)关节炎，尤其是银屑病关节炎和类风湿性关节炎，和
[0035] e)溃瘍性结肠炎。
[0036] 更优选的是根据本发明的药物组合物用于炎性肠病的治疗或预防的实施方案。
[0037] 任何施用于罹患疾病的哺乳动物、尤其是人的药物应当具有高生物利用度，从而 保证尽可能有效且快速的治疗。同时，患者所遭遇的应激和不便应当保持最小。
[0038] 因此，在优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物口服和/或肠胃外施用。在 备选的优选实施方案中，根据本发明的药物组合物优选W水包油乳液或油包水乳液的形式 局部(topically)施用至患者。在又一个备选的优选实施方案中，用于根据本发明使用的药 物组合物W片剂或胶囊的形式施用。
[0039] 本发明的化合物也可W与其他药用活性成分组合。在另一个实施方案中，本发明 的药物组合物可W配制为溶液、凝胶、乳液、乳膏、软膏剂、洗发水、喷雾、棒剂（stick)、粉 末、漱口水或漱口剂、阴道凝胶或制剂、或用于皮肤、指甲、毛发、口腔粘膜、阴道粘膜、嘴或 牙銀的其他可接受形式。
[0040] 在优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物用于年龄相关的疾病、尤其是年 龄相关的皮肤疾病的治疗。在更优选的实施方案中，药物组合物W局部施用至皮肤的软膏 剂形式存在。
[0041] 本发明的另一个目的是包含式(I)的化合物的软膏剂。在优选的实施方案中，包含 式(I)的化合物的软膏剂用于年龄相关的皮肤疾病的治疗。优选地，局部施用根据本发明的 软膏剂。
[0042] 药物组合物可W局部、口服、肠胃外施用。优选地，组合物通过注入、输注或经口吸 入来施用。
[0043] 关节炎是一种设及一个或多个关节的炎症的关节病症的形式。患有关节炎的个体 的主要痛苦是关节疼痛。来源于关节炎的疼痛归因于在关节周围发生的炎症等。意外地发 现，根据本发明的化合物减轻与关节炎相关的症状和迹象。因此，在更优选的本发明的实施 方案中，式(I)的化合物用于关节炎的治疗。此外，在本发明的另一个实施方案中，根据本发 明的药物组合物用于关节炎的治疗。
[0044] 根据本发明的药物组合物可W额外包含另外的组分。运些额外组分的性质可W取 决于用于将根据本发明的药物组合物施用至患者的施用形式。运些组分可W是对于本领域 技术人员来说已知的盖仑添加剂（galenic additive),如张度剂、药用溶剂、崩解剂 (di Singrediant)、润滑剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、缓冲剂、张力改性剂、填充剂、增粘剂/ 降粘剂、表面活性剂、馨合剂、佐剂等。根据本发明的药物组合物可W，例如，包含一种或多 种填料，如葡萄糖、甘露糖醇或山梨糖醇，一种或多种粘合剂，如MCC(微晶纤维素）、淀粉、纤 维素酸或明胶，和/或一种或多种爆炸剂如马铃馨淀粉、玉米淀粉、聚乙締化咯烧酬(PVP)、 卡波普(carbopo 1)和过氧化儀。此外，根据本发明的药物组合物可W包含。药物组合物的添 加剂优选根据施用的形式选择。
[0045]本发明的另一个实施方案是式（I)的化合物的制备方法。根据本发明的制备方法 包括W下步骤：
[00461 倘才T 6句从各物
[004- W)
[004f
[00少
[0化（ (III)
[0051] 在式(I)的化合物的形成下反应。
[0052] 特别优选的是其中X选自由面素、-OH和-化组成的组的实施方案。在特别优选的实 施方案中，X是Cl。
[0053] 在更优选的实施方案中，根据本发明的方法包括W下步骤：
[0化4] i)摇化式（TV)的化合物
[00 历
(IV) 12 i i)将式（IV)的化合物的酸基活化； 2 iii)用式(III)的化合物 (III)
[0化引
[0059] 在式(I)的化合物的形成下转化所述式(IV)的化合物的活化的形式。
[0060] 优选地，式(I)的化合物的酸基(-C(O)OH)的活化在碱的存在下进行。
[0061] 更优选的是其中步骤i)和ii)在有机溶剂、优选基本上不含水并且具有足够溶解 性W将反应组分溶解的非质子有机溶剂中进行的根据本发明的方法的实施方案。本发明的 上下文中基本上不含水是指含有小于50化pm、优选小于25化pm和特别优选在0.00Ippm至 10化pm范围内的量的水的溶剂，其中卵m基于重量。
[0062] 在特别优选的实施方案中，根据本发明的方法作为一锅反应(one-pot-reaction) 进行，即步骤i)至iii)在一个反应容器中进行而不分离步骤ii)的产物。
[0063] 更优选的是其中根据本发明的方法的步骤ii)在-25°C至-5°C范围内、优选-20°C 至-10°C范围内的溫度下进行的实施方案。
[0064] 在更优选的实施方案中，根据本发明的方法的步骤iii)在-25°C至30°C范围内、优 选-15°C至25°C范围内的溫度下进行。
[0065] 将在W下实施例中更详细地进一步描述本发明，其不应被理解为W任何形式限制 本发明。 实施例：
[0066] a)式(I)的化合物的制备：
[0067] 将2.8?乙酷水杨酸溶解于150ml无水四氨巧喃中并且冷却至-15°C。在揽拌下加 入2.11111的异下基氯甲酸醋（13〇13叫71油1〇1'〇;1!'〇1'1]1曰16)和2.231111^乙胺。在-15°[揽拌25分 钟之后，加入1.94g的S径甲基氨基甲烧。将反应混合物在0°C揽拌一小时。在室溫下继续揽 拌过夜。将反应混合物过滤，溶剂蒸发并且将所得到的晶体物质用二乙酸-己烧洗涂，得到 式(I)的化合物的形式的纯净产物。
[006引 收率：2.3?化2%)
[0069]
12 Ih NMR(600MHz，DMS0):5 = 2.29(s，3H，CH3)，3.65(d，J = 4.90Hz，6H，3x CH2-OH)， 4.77(t，J = 4.90Hz，3H，CH2-OH)，7.19(d，J = 7.53Hz，lH，H-3)，7.26(s，lH，NH)，7.：M(t，J = 7.53Hz，lH，H-5)，7.52(t，J = 7.53Hz，lH，H-4)，7.69(d，J = 7.53Hz，lH，H-6); 2 "C NMR(150MHz，DMSO): S = 21.3 (CH3 )，60.6 (C出-OH)，63.0 (C-CH2-OH)，123.8(C- 3)，126.4(05)，129.7(01)，130.2(C-6)，131.9(04)，147.9(02)，165.6(C = 0-NH)， 169.4(0-C = 0).
[0072] 通过电喷雾MS和HPLC研究来确认纯度和特性。
[0073] b)比较化合物GM-20的制备
[0074
[0075] 将3.6g乙酷水杨酸溶解于150ml无水THF中并且冷却至-15°C。在揽拌下加入2.6ml 的异下基氯甲酸醋和2.79mlS乙胺。在-15°C揽拌25分钟之后，加入1.2ml的乙醇胺并且将 反应混合物在(TC揽拌额外一小时。继续揽拌过夜。之后将反应混合物过滤、蒸发并且将所 得到的油状物质溶解于乙酸乙醋中并且用水萃取。在溶剂蒸发之后，确定剩余的油作为所 需产物。
[0076] C)临床试验
[0077] 在对大鼠进行的一系列实验中测试根据本发明的化合物和根据本发明的药物组 合物的药用活性。在热中性环境中（2rC±2°C)利用12h暗-亮循环对圈养在塑料笼子中的 雄性Sprague-Dawl巧大鼠（280-320g)进行实验。将W正常饮食和自来水任意饲养的动物根 据喂食方案随机分配至实验组中。
[0078] 对维持在相同条件下的小鼠进行进一步实验。
[0079] I)结肠炎的诱发
[0080] 通过在短暂二乙酸麻醉下经由8cm长的软塑料导管在结肠内施用TNBS(2,4,6-S 硝基苯横酸）（在0.25ml的25%乙醇水溶液中40mg/kg)来诱发结肠炎症。在假手术组，仅施 用TNBS的载体。在灌肠之前12h内，对动物剥夺食物，但是不剥夺水。
[0081 ] 手术准备
[0082] 在灌肠之后1或3天将动物用戊己比妥钢（50mg/kg体重，腹膜内（i.P.))麻醉并且 W仰邸置于加热盘上。进行气管造口术(tracheostomy) W促进自主呼吸，并且在实验期间 用PE-50管插入右颈静脉W用于液体施用和林格氏乳酸盐(Ringer^ S lactate)输注（IOml/ kg/小时）。将热敏电阻头导管(PTH-01 !Experimetria Ltd,Budapest,Hungary)经由右颈总 动脉放置在升主动脉中W通过热稀释技术测量CO。用PE-40管捕入右股动脉W用于平均动 脉压(MAP)和屯、率化R)现慢。
[0083] 血液动力学测量
[0084] 利用计算机化数据获取系统化邱erimetria L化)连续测量并记录压力信号(BPR-02传感器，E邱erimetria L化，Budapest ,Hungary)。通过热稀释技术，使用SPElL Advanced Cardosys 1.4计算机化xperimetria Ldt)检测屯、输出量。利用血液气体分析仪（A化 Compact 2,Graz,Austria)测量动脉血液样品中的气体。
[00化]结肠活组织检查物的制备
[00化]将保持在冰上的结肠活组织检查物在含有50mM Tris-HCl (Reanal ,Budapest, 化ngary)、0.1 mM邸TA、0.5mM二硫苏糖醇、ImM苯基甲基横酷氣、I化g/ml大豆膜蛋白酶抑制 剂、和lOjig/ml亮抑蛋白酶肤（Sigma Al化ich Gm地，Munich ,Germany)的憐酸盐缓冲液(pH 7.4)中均化。将匀浆在4°CW24 ,OOOg离屯、20分钟，并且将上清液加样至离屯、管（Amicon Centricon-IOO; 100,000截留分子量超滤器，Mi Ilipore Coloration ,Be壯ord，MA)中。在 匀浆的球粒(pe 11 et)上测量髓过氧化物酶(MP0)的活性。
[0087] 血浆亚硝酸盐/硝酸盐测量
[0088] 通过Griess反应测量血浆亚硝酸盐/硝酸盐(NOx)、N0的稳定终产物的水平。该测 定取决于硝酸盐到亚硝酸盐的还原，亚硝酸盐之后被转化为在54化m通过分光光度法检测 到的有颜色的偶氮染料化合物。
[0089] 血浆TNF-a的测量
[0090] 将血液样品（0.5ml)从下腔静脉取到预冷却的肝素化的（lOOU/ml)聚丙締管中，W 1 ,OOOg在4°C离屯、30分钟，并且之后在-70°C储存直到测定。借助可商购的酶联免疫吸附测 定（针对大鼠 TNF-a的Quantikine超灵敏酶联免疫吸附测定试剂盒；Biomedica Hungaria Kft ,Budapest ,Hungary)-式两份测定血浆TNF-a浓度。最小可检测水平小于5pg/ml，并且 测定间和测定内的差异系数小于10%。
[0091 ] 黄嚷岭氧化还原酶酶活性
[0092] 通过巧光动力学测定，基于在存在（总X0R)或不存在(黄嚷岭氧化酶活性）电子受 体亚甲基蓝的情况下蝶岭向异黄蝶岭的转化，在超滤、浓缩的上清液中测定XOR活性。
[0093] 组织Mro活性
[0094] 在匀浆的球粒上测量作为组织白细胞浸润的标记物的MPO的活性。简而言之，将球 粒在含有0.5 %六-1，6-双-癸基S乙基漠化锭的KsP化缓冲液(0.05M; pH 6.0)中重悬。在S 次重复的冷冻-解冻操作之后，将材料在4°CW24,000g离屯、20分钟，并且将上清液用于MPO 测定。随后，将0.15ml的3，3/，5，5/ -四甲基联苯胺(溶解于二甲亚讽中，1.6mM)和0.75ml的 过氧化氨(溶解于K3P04缓冲液中，0.6mM)加入至0.1ml的样品中。反应引起四甲基联苯胺的 过氧化氨依赖性氧化，其可W在450nm通过分光光度法检测（UV-1601分光光度计； Siimadzu,Kyoto, Japan)。在37°C测量髓过氧化物酶活性；在5分钟之后通过加入0.2ml的 出S化(2M)停止反应，并且所得到的数据参考蛋白质含量。
[00M] 体内视频显微镜测量
[0096] 将体内垂直偏振光谱成像技术(切tosan A/R;切tometrics，陆iladel地ia，Pa)用 于结肠浆膜的微循环的连续可视化。该技术使用在氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的等吸收 点的波长(548nm)下的反射的偏振光。因为在反射中保持偏振，仅从200至300WI1的深度散射 的光子有助于图像形成。将IOx物镜引入至肠管腔中，并且用S-VHS摄像机(PanasonicAG-TL 700;Matsushi1:a Electric Ind Co Ltd,Osaka,Japan)记录显微图像。通过视频录制的 图像的逐帖分析离线进行微循环评价。借助计算机辅助的图像分析系统（IVM Pictron, Budapest,化ngary)在S个单独的区域中测定毛细血管后微静脉中的毛细血管红细胞速度 (RBCV，皿/s)的变化。由相同的研究人员进行所有微循环评价。
[0097] 高迁移率族蛋白Bl的测定
[009引血浆中的高迁移率族盒蛋白质I (HMGB-1)测量：
[0099] 将血液样品抽出至含有抓TA(lmg/ml)的冷却聚丙締管中并且Wl200g在4°C离屯、 lOmin。之后收集血浆样品并且在-70°C储存直到测定。通过可商购的HMGB-化LISA试剂盒 (Shino-Test Co巧oration，Kanagawa，Japan)测量HMGB-I的血浆浓度。
[0100] 实验方案(图1)
[0101] 对小鼠进行分别关于式（I)的化合物和包含式（I)的化合物的药物组合物(式（I) 的化合物在抑4.8的澄清水溶液)的对没有炎症的胃损伤的效果的第一实验。将48只动物 随机分配至=个组中。A组(n = 16)充当假手术对照。在临床试验的第1天抽取所有动物的样 品。在第2天，将B组(n = 16)的动物强迫喂食乙酷水杨酸(ASS) (1.1 Immol/kg体重）。将C组(n = 16)强迫喂食l.llmmol/kg体重的根据本发明的化合物。A组仅接受相应的溶剂(在水中 25%乙醇）。在填喂（gavage) -天之后，抽取额外的样品。进行巧光共聚焦显微内窥镜检查 (endomicroscopy)W检查微血管和末端结肠粘膜的形态变化，选取全厚组织样品和静脉血 液样品W确定结肠和血浆的生物化学变化。通过体重测量、血液气体分析和活组织检查的 方式确定效果。选择ASS作为比较例，运是由于其结构相似性W及其作为抗炎药的已知活 性。
[0102] 图1示出了 A、B和C组的实验方案I。
[0103] 图2示出了具有胃损伤而没有炎症的试验动物在施用ASS(B组)和根据本发明的化 合物(C组)前后的体重的变化。A组充当假手术对照。如可W从图2中所示的数据看到的，当 施用ASS时，试验动物在一天内遭遇严重的体重损失。相比之下，与不接收任何药物活性化 合物的动物相比，用根据本发明的化合物治疗的动物仅显示出较小的体重损失。此外，数据 明确地显示，本发明的化合物不导致额外的应激并且未显示将会通过体重损失体现的副作 用。
[0104] 图3示出了在A、B和C组中动物的存活率。
[010引图4示出了A、B和C组的动物的胃浆膜中的红细胞速度(RBCV)。
[0106] 图5a和化示出了在试验动物治疗一天之后的髓过氧化物酶(MPO)活性的测定的结 果。图5a反映了从胃组织获得的数据并且图加反映了从动物的十二指肠组织获得的数据。 如可W看到的，与对照组的那些(A组)和用根据本发明的化合物治疗的那些(C组)相比，用 ASS治疗的动物(B组)的Mro活性增加。因为MPO是与炎性过程相关的酶，可W断定的是，用根 据本发明的化合物治疗具有胃损伤的小鼠未进一步增强身体的炎性过程，对于ASS来说也 是一样的情况。
[0107] 图6a和6b示出了通过确定胃和十二指肠组织中黄嚷岭氧化酶的活性获得的结果。 用ASS治疗的动物显示出增加的活性(B组），而与A组的对照动物相比，通过用根据本发明的 化合物治疗的动物(C组)不能确定运样的增加。高的黄嚷岭氧化酶活性可能导致增加的与 痛风有关的脈的产生，W及肝损伤。
[0108] 图7a和7b示出了在试验动物的胃组织（图7a)和十二指肠组织（图7b)中的亚硝酸 盐/硝酸盐水平的测量的结果。与对照A组的动物或用根据本发明的化合物治疗C组的动物 相比，用ASS治疗的动物(B组)显示出亚硝酸盐/硝酸盐水平的明显差异。
[0109] 图8和9示出了 A、B和C组的动物的胃粘膜的宏观损伤。对于每个组，可W确定粘膜 的损伤。
[0110] 图10示出了基于评分系统的粘膜的宏观分析，其中应用并且等同地编写 (writhed) W 下标准：
[0111] 1.出血区域的尺寸(评分:0-2)
[0112] 2.出血区域的数量(评分:0-3)
[0113] 3.溃瘍的扩展(评分:0-2)
[0114] 对于每个组的动物计算S个标准的平均值，其中"0"对于标准1来说意指小或无出 血区域，对于标准2来说意指无出血区域，并且对于标准3来说意指无溃瘍。
[0115] 数字越大，损伤越严重。
[0116] 图10显示，与A和C组的动物相比，B组的动物具有明显的粘膜损伤。
[0117] 实验方案(图11)
[0118] 利用患有如上所述诱发的结肠炎的动物重复上述临床研究。将20只小鼠随机分为 四组，其中D组充当假手术对照，未患有结肠炎，E组充当第二对照，患有结肠炎但是不接受 进一步治疗，F组患有结肠炎并且用l.llmmol/kg体重的ASS治疗，并且G组患有结肠炎并且 用1. llmmol/kg的根据本发明的化合物治疗。在动物接受利用TNBS(40mg/kg i .C.)灌肠之 后一天，其中D组的动物仅接受相应的溶剂，F和G组的动物分别用ASS和根据本发明的化合 物治疗。其他动物再次仅接受相应的溶剂。在灌肠之后两天，通过体重测量、血液气体分析 和活组织检查确定治疗的效果。在诱发结肠炎之后两天，将动物麻醉。进行手术W允许在化 内W化间隔记录血液动力学参数(仅在实验的最后测量屯、输出量[CO]数据）。在实验的最后 进行体内视频显微镜检查W使离盲肠3cm远的浆膜微循环可视化。此外，进行巧光共聚焦显 微内窥镜检查W检查微血管和末端结肠粘膜的形态变化，选取全厚组织样品和静脉血液样 品W确定结肠和血浆的生物化学变化。
[0119] 图11示出了D、E、F和G组的实验方案。
[0120] 图12示出了在D、E、F和G组中小鼠的存活率。
[0121] 图13a和13b描绘了在结肠炎诱发之后3天且治疗之后一天测定的胃组织（图13a) 和结肠组织（图13b)的髓过氧化物酶活性。同样地，可W看到根据本发明的化合物(G组）的 正面效果，结果是当与患有结肠炎而不进行进一步治疗的动物化组）W及患有结肠炎并且 已经用ASS治疗的那些(F组)相比时活性的降低。
[0122] 图14a和14b示出了通过确定胃和结肠组织中黄嚷岭氧化酶的活性获得的结果(分 别是图Ha和14b)。在两种情况中，用ASS治疗的动物(F组）当与未接受药物治疗的那些化 组）相比时，显示出活性的仅仅轻微降低，而已经用根据本发明的化合物治疗的G组的动物 显示出与由D组代表的健康动物可比的酶活性。
[0123] 图15a和15b示出了在试验动物的胃组织（图15a)和结肠组织（图15b)中的亚硝酸 盐/硝酸盐水平的测量的结果。尽管患有结肠炎，用根据本发明的化合物治疗的动物(G组） 显示出与健康动物的那些可比的亚硝酸盐/硝酸盐水平。
[0124] 如可W从图1至15看到的，在小鼠模型上，根据本发明的化合物显示出高药物活 性，尤其是作为TNF-a抑制剂并且在炎性肠病如结肠炎的治疗中。此外，用式(I)的化合物治 疗的试验动物未遭遇在用ASS治疗中观察到的副作用。此外，利用本发明的化合物，粘膜的 损伤减小并且可W降低髓过氧化物酶活性和黄嚷岭氧化酶活性。
[0125] 实验方案(图16)
[0126] 对大鼠进行分别关于式（I)的化合物和包含式（I)的化合物的药物组合物的对没 有炎症的胃损伤的效果的进一步实验。将15只动物随机分配至=个组中。H组(n = 5)充当假 手术对照。在临床试验的第1天抽取所有动物的样品。在第2天，将I组(n = 5)的动物强迫喂 食乙酷水杨酸(ASS) (1. llmmol/kg体重）。将K组(n = 5)强迫喂食1. llmmol/kg体重的根据本 发明的化合物。H组仅接受相应的溶剂(在水中25%乙醇）。在填喂（gavage) -天之后，抽取 额外的样品。进行巧光共聚焦显微内窥镜检查W检查微血管和末端结肠粘膜的形态变化， 选取全厚组织样品和静脉血液样品W确定结肠和血浆的生物化学变化。通过体重测量、血 液气体分析和活组织检查的方式确定效果。选择ASS作为比较例，运是由于其结构相似性W 及其作为抗炎药的已知活性。
[0127] 图16示出了 H、I和K组的在大鼠模型上的实验方案。
[0128] 图17示出了具有胃损伤而没有炎症的试验动物在施用ASS(I组)和根据本发明的 化合物化组)前后的体重的变化。H组充当假手术对照。如可W从图17中所示的数据看到的， 当施用ASS时，试验动物在一天内遭遇严重的体重损失。相比之下，与不接收任何药物活性 化合物的动物相比，用根据本发明的化合物治疗的动物化组)仅显示出较小的体重损失。此 夕h数据明确地显示，本发明的化合物不导致额外的应激并且未显示将会通过体重损失体 现的副作用。
[0129] 图18示出了在分别用ASS和根据本发明的化合物治疗动物之后试验动物的血液中 红细胞比容化aematocrit)的百分数。当与对照组化组）相比时，不能检测到用根据本发明 的化合物治疗的动物化组）的血液中红细胞比容水平的变化。另一方面，用ASS治疗的I组的 动物显示出红细胞比容水平的剧烈变化。
[0130] 基于红细胞比容测量，可W将数据分为两组：
[0131 ] a)高红细胞比容水平，表示具有血浆损失的出血（图19);和
[0132] b)低红细胞比容水平，表示具有血浆和细胞损失的严重出血（图20)。
[0133] 如在图19中所示，施用ASS的试验动物显示出血液中红细胞比容水平的增加，表示 具有血浆损失的增加的出血(I组），而相反地，当与假手术H组相比时，在用根据本发明的化 合物治疗的K组的中不能检测到红细胞比容水平的变化。
[0134] 如可W从图20中所示的数据看到的，当与对照H组相比时，接受ASS的I组的动物的 红细胞比容水平显示出严重下降，表示具有血浆和细胞损失的严重出血。相比之下，在用根 据本发明的化合物治疗的K组的动物中不能检测到变化。
[0135] 图21示出了在分别施用ASS和根据本发明的化合物之后一天试验动物的血浆TNF-a水平的测定的结果。同样地，与对照H组相比，在已经施用了根据本发明的化合物的K组的 动物的情况中，几乎不能检测到变化。然而，用ASS治疗的I组的动物显示出血浆TNF-a水平 的增加，表示除了归因于胃损伤的那些之外的增加的数量的巨隧细胞。
[0136] 图22示出了在第3天时在H、I和K组中的大鼠的血浆中的高迁移率族蛋白Bl的浓 度。K组中的动物的血浆中的浓度可与对照H组中的动物的血浆中的浓度相比。然而，I组的 动物的血浆中的浓度增加。
[0137] 图23a和23b示出了在试验动物治疗之后一天胃组织（图23a)和结肠组织（图23b) 中的髓过氧化物酶(MPO)活性的测定的结果。如可W看到的，与对照组的那些化组)和用根 据本发明的化合物治疗的那些化组)相比，用ASS治疗的动物（I组）的MPO活性增加。因为MPO 是与炎性过程相关的酶，可W断定的是，用根据本发明的化合物治疗具有胃损伤的大鼠未 进一步增强身体的炎性过程，对于ASS来说也是一样的情况。
[0138] 图24a和24b示出了通过确定胃和结肠组织中黄嚷岭氧化酶的活性获得的结果(分 别是图24a和24b)。用ASS治疗的动物显示出增加的活性(I组），而与H组的对照动物相比，通 过用根据本发明的化合物治疗的动物化组)不能确定运样的增加。高的黄嚷岭氧化酶活性 可能导致增加的与痛风有关的脈的产生，W及肝损伤。
[0139] 图25示出了在试验动物的血液中的亚硝酸盐/硝酸盐水平的测量的结果。同样地， 与对照H组的动物或用根据本发明的化合物治疗的I组的动物相比，用ASS治疗的动物(I组） 显示出增加的亚硝酸盐/硝酸盐水平。
[0140] 实验方案(图26)
[0141] 利用患有如上所述诱发的结肠炎的动物重复上述临床研究。将20只动物(大鼠）随 机分为四组，其中L组充当假手术对照，未患有结肠炎，M组充当第二对照，患有结肠炎但是 不接受进一步治疗，N组患有结肠炎并且用l.llmmol/kg体重的ASS治疗，并且0组患有结肠 炎并且用l.llmmol/kg的根据本发明的化合物治疗。在动物接受利用TNBS(40mg/kg i.c.) 灌肠之后一天，其中L组的动物仅接受相应的溶剂，N和0组的动物分别用ASS和根据本发明 的化合物治疗。其他动物再次仅接受相应的溶剂。在灌肠之后两天，通过体重测量、血液气 体分析和活组织检查确定治疗的效果。在诱发结肠炎之后两天，将动物麻醉。进行手术W允 许在化内W化间隔记录血液动力学参数(仅在实验的最后测量屯、输出量[CO]数据）。在实验 的最后进行体内视频显微镜检查W使离盲肠3cm远的浆膜微循环可视化。此外，进行巧光共 聚焦显微内窥镜检查W检查微血管和末端结肠粘膜的形态变化，选取全厚组织样品和静脉 血液样品W确定结肠和血浆的生物化学变化。
[0142] 图27示出了试验动物在临床试验期间遭遇的体重损失。尽管在灌肠日M、N和0组的 动物均显示出相似的体重，M和N组的动物在灌肠之后两天和施用ASS(N组)之后一天经历严 重的体重损失。在用根据本发明的化合物治疗的动物的情况中没有观察到重量损失(0组）。
[0143] 图28描绘了从试验动物的血液中红细胞比容水平的测量得到的数据。如可W看到 的，与患有结肠炎但是不接受进一步治疗的那些(M组)相比，用ASS治疗的动物显示出甚至 更高的水平(N组）。用根据本发明的化合物治疗的D组的动物的红细胞比容水平略微高于L 和M组的那些。
[0144] 图29示出了试验动物的结肠炎症的宏观评分。评分系统基于如在期刊肠胃病学 (Gastroenterology)96:795-803,1989("大鼠结肠中慢性炎症和溃瘍的半抗原诱发的模型 (Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon)")中描述的Morris等人的工作。结果如下分级：
[0145] 0 =无炎症迹象
[0146] 1=红斑
[0147] 2 =红斑、水肿和糜烂
[0148] 3 =两个W上出血性溃瘍、炎症和粘连，
[0149] 4 =严重的溃瘍和/或狭窄W及近侧肠的膨胀。
[0150] 如可W预期的，对照L组的动物未显示出任何炎症迹象，其中M组的动物显示出在3 至4级范围内的症状。用ASS治疗的N组的动物显示出稍不严重的症状，然而用根据本发明的 化合物治疗的O组的动物仅显示出增加的红斑。
[0151] 图30中的数据示出了试验动物的血浆TNF-a水平测定的结果。如可W明确地看到 的，已经用根据本发明的化合物治疗的0组的动物显示出TNF-a水平的明显降低，表明可W 通过施用根据本发明的化合物来缓解由诱发的结肠炎(M组)导致的TNF-a的增加。
[0152] 图31示出了在第3天时在L、M、N和0组中的动物的血浆中的高迁移率族蛋白Bl的浓 度。明显的降低可W利用本发明的化合物的治疗实现并且对于0组示出。
[0153] 图32a和32b描绘了在结肠炎诱发之后3天且治疗之后一天测定的胃组织（图32a) 和结肠组织（图32b)的髓过氧化物酶活性。同样地，可W看到根据本发明的化合物的正面效 果，结果是当与患有结肠炎而不进行进一步治疗的动物(M组）W及患有结肠炎并且已经用 ASS治疗的那些(N组)相比时活性的降低。
[0154] 图33a和33b示出了通过确定胃和结肠组织中黄嚷岭氧化酶的活性获得的结果(分 别是图33a和33b)。而当与未接受药物治疗的那些(M组)相比时用ASS治疗的动物(N组）显示 出活性的仅仅轻微降低。在两种情况中，已经用根据本发明的化合物治疗的0组的动物显示 出与由L组代表的健康动物可比的酶活性。
[0155] 图34示出了在试验动物的血液中的亚硝酸盐/硝酸盐水平的测量的结果。同样地， 与对照L组的动物或M组的动物相比，用ASS治疗的动物(C组）显示出增加的亚硝酸盐/硝酸 盐水平。尽管患有结肠炎，用根据本发明的化合物治疗的动物另一方面显示出与健康动物 的那些可比的亚硝酸盐/硝酸盐水平。
[0156] 图35示出了与比较化合物GM-20相比的进一步实验的结果。根据上述方案进行试 验。将试验动物分为W下组：P组充当假手术对照，未患有结肠炎，R组患有结肠炎并且用 1. llmmol/kg体重的ASS治疗，S组患有结肠炎并且用1. llmmol/kg体重的根据本发明的化合 物治疗，并且T组患有结肠炎并且用l.llmmol/kg体重的比较化合物GM-20治疗。比较化合物 GM-20描述于现有技术，其适用于特征如下的病理性病症的治疗处理：由于免疫原性过度刺 激导致的肥大细胞的脱颗粒(参见US 5,506,224)。如上所述测量亚硝酸盐/硝酸盐水平。如 可W从图35中所示的数据看到的，与对照P组的动物相比，用ASS治疗的试验动物(R组)显示 出增加的亚硝酸盐/硝酸盐水平。此外，用比较化合物GM-20治疗的动物也显示出增加的亚 硝酸盐/硝酸盐水平。运显示，仅引入径基不足W降低亚硝酸盐/硝酸盐水平。该发现进一步 支持了不导致被治疗的动物(S组）中亚硝酸盐/硝酸盐水平的增加的根据本发明的化合物 的令人惊讶的效果。
[0157] 如可W从图17至34看到的，在大鼠模型上，根据本发明的化合物显示出高药物活 性，尤其是作为TNF-a抑制剂并且在炎性肠病如结肠炎的治疗中。此外，用式(I)的化合物治 疗的试验动物未遭遇在用ASS治疗中观察到的副作用。此外，可W降低高迁移率族蛋白Bl浓 度W及过氧化物酶水平。
[0158] 此外，可W降低粘膜的损伤。
[0159] II)胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)
[0160] 利用患有胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)的动物进行进一步临床研究。在运些研究 中，使用小鼠作为试验动物。在八周龄时，利用在5 0 y 1的完全弗氏佐剂（F r e U n d / S adjuvant)中乳化的SOiil的牛胶原蛋白II将动物在尾根部皮内免疫。在3周后进行第二加强 免疫，此时SOiil的不完全弗氏佐剂与或不与相同体积的胶原蛋白II一起施用。将动物随机 分配至实验组中，其中第I组充当不患有关节炎的对照，第2组充当患有关节炎但是不接受 进一步治疗的第二对照，并且第3组患有关节炎并且用根据本发明的化合物治疗。从第一免 疫直到实验结束，将第3组的动物强迫喂食l.llmmol/kg体重的根据本发明的化合物。使用 临床评分系统评价CIA的严重性;利用热刺激检测炎性痛觉过敏化yperalgesia)。
[0161] CIA的临床评价
[0162] W盲试方式由一个研究人员使用基于每个爪中发炎关节数量的化ndakumar的评 分系统进行CIA的评价，炎症被定义为肿胀和泛红（参见化nakumar KS，Svensson L， 化Imdahl ^小鼠中II型胶原蛋白特异性单克隆抗体诱发的关节炎:疾病的描述和年龄、性 别及基因的影响（Collagen type Il-specific monoclodal antibody-induced arthritis in mice：description of the disease and the influence of age，sex,and genes) 化thol.2003,163(5): 1827-37)。简要总结的每个发炎的脚趾或指关节等于 一个点，而腕关节或踩关节等于五个点，得到对于每个爪从0至15个点和对于每只动物0至 60个点的评分。在观察阶段期间每隔两天进行评价。结果总结在图36中。
[0163] 热刺激
[0164] 在试验之前使动物适应实验条件1小时。之后将它们放置在设定为4(TC的加热平 板上W评估它们的热超敏感性。在10分钟之后，根据首先由Attal等人描述的方法（参见 Attal N，Jazat F，Kayser V，Gui化aud G:单侧外周单神经病的模型中的疼痛相关行为的 进一步证据（Further evidence for pain related behaviors in a model of unilateral peri地eral mononeuropathy) ;Pain 1990,41(2) :235-51),在 15分钟的时间 段期间W数字等级将四肢的位置评级3次。评分如下:0,此时爪正常按压至底板；I，此时爪 轻轻地靠在底板上并且脚趾处于腹侧弯曲（ventrof Iexed)位置;2，此时仅爪的内边缘按压 至底板;3，此时仅脚后跟按压至底板并且后爪处于倒置位置;4，此时整个爪抬起;和5，此时 动物祿甜爪。结果总结在图37中。
[0165] 如可W从图36中看到的，在对照第1组中不存在关节炎的临床迹象。CIA的发病率 在患有关节炎的第2和第3组之间区别不明显。发现在两种情况中均为90%。炎症的临床迹 象在第二免疫之后出现并且连续发展直到观察阶段的结束。用根据本发明的化合物治疗的 第3组的动物展现出较不严重的关节炎。在第2组中比在第3组中更多的肢(limb)受到影响， 说明了各组之间的中度炎症差异是统计学上显著的。此外，与CIA有关的炎性过程伴随继发 性痛觉过敏。然而，第3组中的利用根据本发明的化合物的治疗得到了明显较低的热敏感性 (参见图37)。所进行的临床研究的结果明确地显示，利用根据本发明的化合物的治疗明显 地减小了 CIA的严重性并且减少了 CIA相关炎症的迹象和症状。
【主权项】
1. 式α)的化合物：2. 如权利要求1中定义的式(I)的化合物的抗炎药。3. 包含式(I)的化合物的药物组合物4. 根据权利要求3所述的药物组合物，所述药物组合物包含药学上有效量、优选基于所 述药物组合物的总重量在0.001至10重量％范围内的量的所述式(I)的化合物。5. 根据权利要求3或4所述的药物组合物，所述药物组合物用于炎症的治疗和预防。6. 根据权利要求3至5中至少一项所述的药物组合物，其中所述式（I)的化合物以在每 kg体重且每天0.001至0.3g范围内的剂量施用。7. 根据权利要求3至6中至少一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于选自由下列 各项组成的组的疾病的治疗或预防： a) 银肩病， b) 克罗恩病， c) 强直性脊柱炎， d) 关节炎，尤其是银肩病关节炎和类风湿性关节炎;和 e) 溃疡性结肠炎。8. 根据权利要求3所述的药物组合物，所述药物组合物用于炎性肠病和/或年龄相关的 皮肤疾病的治疗。9. 根据权利要求3至8中至少一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是口服的 和/或肠胃外施用的。10. 用于制备根据权利要求1所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤： 使式(Π)的化合物其中X是离去基团； 与式(ΠΙ)的化合物在根据式(I)的化合物的形成下反应。11. 根据权利要求10所述的方法，其中X选自由卤素、-OH和-N3组成的组。12. 根据权利要求10所述的方法，所述方法包括以下步骤： i)提供式(IV)的化合物i i)将式(IV)的化合物的酸基活化； iii)用式(ΠΙ)的化合物在根据式(I)的化合物的形成下转化所述式(IV)的化合物的活化的形式。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述步骤i)至iii)在有机溶剂、优选基本上不含 水的非质子有机溶剂中进行。14. 根据权利要求12和13之一或二者所述的方法，其中步骤i i)在-25 °C至-5 °C范围内、 优选-20 °C至-10 °C范围内的温度下进行。15. 根据权利要求12至14中至少一项所述的方法，其中步骤i i i )在-25 °C至30 °C范围 内、优选-15 °C至25 °C范围内的温度下进行。16. 包含式(I)的化合物的软膏剂。17. 根据权利要求16所述的软膏剂，所述软膏剂用于年龄相关的皮肤疾病的治疗。18. 根据权利要求16或17所述的软膏剂，其特征在于所述软膏剂是局部施用的。
【文档编号】A61K31/616GK105873899SQ201480071869
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年12月17日
【发明人】米克洛什·吉齐
【申请人】帕克斯研究有限责任公司