过滤系统和其使用

过滤系统和其使用
【专利摘要】本发明涉及一种过滤系统，其用于在确定液体样品中的细胞，例如，活细胞的存在和/或数量的方法中使用，且涉及使用和制造此类过滤系统的方法。所述过滤系统包括具有上部部分和环部部分的杯体，其中所述环部部分可分离地联接至所述上部部分。
【专利说明】过滤系统和其使用
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2013年11月4日提交的美国临时专利申请N0.61/899,436的权益和优先权，所述申请的全部公开内容全文以引用的方式并入本文中。
发明领域
[0003]本发明一般来说涉及用于收集液体样品中的细胞(例如，活细胞)以用于稍后分析的过滤系统，且涉及使用和制造此类过滤系统的方法。
【背景技术】
[0004]例如由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌(例如，酵母菌和霉菌)引起的微生物污染可导致严重疾病，且在一些情况下甚至导致人类和动物受试者死亡。某些行业(例如，食品、水、化妆品、制药和医疗装置行业)的制造商必须符合严格的标准以证明其产品不含有将危害消费者或接受者健康的微生物污染物水平。这些行业需要对微生物污染物的存在进行频繁的、准确的和敏感的测试以符合某些标准，例如由美国食品和药品管理局或环境保护局施加的标准。
[0005]取决于情形，在活细胞与非活细胞之间进行区分的能力也可以是重要的。举例来说，在医药品和生物制品的制造期间，重要的是在制造过程中所使用的水是无菌的且没有污染物。此外，重要的是，例如经由非肠胃途径向受试者给药的药品(例如，液体医药品和生物剂型，例如可注射剂型)和液体(例如，盐水)中含有的水也是无菌的且没有污染物。另一方面，一些活的微生物按某个点存在于饮用水中可以是可接受的。为了成为便携式的，饮用水必须符合严格的标准。即使微生物可存在于供水中，水仍可被接受用于人类饮用。然而，一旦细胞数超过阈值水平，水就不再被认为可安全地供人类饮用。此外，某些食品产品(例如，新鲜产品)和饮料(例如，牛奶)中存在某个预定水平的微生物可以是可接受的。然而，一旦已超过那些水平，食品或饮料就可被认为已变质且不再可安全地供人类食用。
[0006]用于评定微生物污染的存在和/或微生物污染的程度的传统细胞培养方法可需要几天来执行，这可取决于所测试的生物体。在这个时段期间，可对被怀疑的产品(例如，食品、饮料或药品)进行检疫直到可获得结果和可释放产品为止。因此，需要用于快速地检测(例如，在几小时或更短时间内)样品中的微生物污染物(明确地说，活的微生物污染物)的存在和/或数量的系统和方法。过程的一个重要部分是捕获将要分析的细胞，这必须用快速、安全和一致的方式完成以实现整个检测系统和方法的效率。
发明概要
[0007]本发明至少部分基于改进的过滤系统(本文中也称作细胞捕获系统)的发现，所述过滤系统可与细胞检测系统一起使用以确定含有细胞的样品中的活细胞的存在。过滤系统可粘合光学检测系统使用，光学检测系统检测样品中的细胞(例如，活细胞)的存在。结果可用以测量所关注的特定样品的生物负荷(例如，以测量活细胞的数量和/或百分比和/或分数)。
[0008]本文中描述的过滤系统提供许多优于现有过滤系统的优点。举例来说，过滤系统将捕获细胞的薄膜周围的流体样品泄漏的风险减到最小，进而降低不注意地污染过滤系统的被用户触碰或处置或放置在细胞检测系统内的一部分的风险。此外，过滤系统比现有过滤系统更方便使用，因为其在用户操作期间需要较少操纵步骤，这在每个额外操纵步骤有可能将污染物引入至正被分析的样品中或正被分析的流体样品可能不注意地污染用户或周围环境的情况下可能是有利的。这将污染用户、检测系统或周围环境的风险减到最小。
[0009]在一个方面，本发明提供一种用于收纳流体样品的过滤系统(细胞捕获系统)。所述系统包括具有上部部分和环部的杯体，所述环部具有周边。上部部分可分离地联接至环部。杯体还包括流体可渗透薄膜，所述薄膜附接至所述周边以在薄膜与环部之间产生流体密封。薄膜的一部分适合于将细胞截留于其上面。所述系统还包括被配置用来收纳环部的基底。
[0010]所述薄膜部分可:(i)界定平均直径小于约Ιμπι的多个孔隙，以便准许流体横越薄膜的第二部分，同时将细胞截留于其上面，且(ii)在暴露于波长在约350nm至约100nm的范围内的光时为基本上非自发荧光的。此外，薄膜部分可具有达约100μπι(β卩，在±50μπι内)的平面度公差。在一些实施方案中，所述杯体适合于在流体被引入至上部部分中时将流体朝所述薄膜部分引导。
[0011]在某些实施方案中，环部与杯体的上部部分一体地形成。环部利用易碎连接可分离地联接至上部部分，易碎连接可以是在上部部分与环部的交叉处的薄壁。易碎连接(例如，薄壁交叉)可界定周向凹槽。在施加足以破坏易碎连接的力后，易碎连接也可界定上部部分与环部之间的分割面。在其它实施方案中，环部经由螺纹连接、卡口连接和干涉配合中的至少一者可分离地联接至上部部分。
[0012]在一些实施方案中，环部具有周向配准特征。环部在环部的周边周围可包括多个突起，且多个突起中的一者具有与其它突起中的每一者不同的宽度、高度、厚度和间距中的至少一者，所述突起可充当空间配准器。在某些实施方案中，薄膜经由以下中的至少一者连接至环部:粘着、粘合、热焊接和超声波焊接。
[0013]基底可包括用于收纳环部的圆柱形壁。在某些实施方案中，圆柱形壁界定与环部的多个突起相适配的多个槽口。槽口中的一者可适合于收纳多个突起中的一者，所述一者具有与其它突起中的每一者不同的宽度、高度、厚度和间距中的至少一者，所述突起可便于空间配准。圆柱形壁可界定周向开口，所述开口适合于在环部安置在基底内时提供对环部的接近，且还可界定适合于收纳薄膜支撑体的凹口。凹口可界定适合于准许流体通过的多个开口。在一个实施方案中，基底包括配准特征，所述配准特征可包括由基底的表面界定的凹部。
[0014]杯体可进一步包括至少一个闩锁，所述闩锁适合于将杯体联接至基底以在杯体与基底之间提供适当的摩擦配合，以便准许适当水平的扭矩有助于将环部(具有相关联的薄膜)与杯体的上部部分分离，但也准许随后将环部(具有相关联的薄膜)从基底移去。闩锁可适合于阻止杯体与基底在垂直于分割面的平面上分离，但不阻止杯体相对于基底的旋转。
[0015]在另一方面，本发明提供一种在细胞存在于流体样品中时收集细胞的方法。所述方法包括将流体样品引入至上述杯体的上部部分中；以及准许流体通过薄膜部分。在一些实施方案中，所述方法包括在施加流体之后使上部部分与环部分离。使上部部分与环部分离可包括施加足以将环部与上部部分拆开的力，所述力可通过相对于基底扭转杯体来施加。所述方法还可包括在施加流体之后将插塞紧固至基底的底部。
[0016]在又一方面，本发明提供一种制造上文描述的细胞捕获系统的方法。所述方法包括:提供具有周边的环部;将流体可渗透部件紧固至周边以在薄膜与环部之间产生流体密封；以及将紧固有薄膜的环部定位于被配置用来收纳环部的基底内。在一些实施方案中，所述方法包括在产生流体密封之前，将环部可分离地联接至上部部分。所述定位步骤可包括使杯体与基底在预定周向定向上相适配。在一个实施方案中，在将杯体定位于基底内之前，所述方法包括将多孔支撑体放置在形成于基底中的凹口中。
[0017]附图简述
[0018]在附图中，相同的参考符号一般在所有不同视图中指相同部件。而且，附图未必按比例绘制，而是一般将重点放在说明本发明的原理上。在以下描述中，参照以下附图描述本发明的各种实施方案，附图中:
[0019]图1A和图1B分别是示例性细胞捕获系统的示意性俯视透视图和仰视透视图；
[0020]图1C、图1D和图1E是图1A和图1B的示例性细胞捕获系统的示意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0021]图1F是沿着图1D的线F-F截取的示例性细胞捕获系统的示意性截面图；
[0022]图2A和图2B分别是示例性杯体的示意性俯视透视图和仰视透视图，杯体是图1A至图1F的示例性细胞捕获系统的一部分；
[0023]图2C、图2D和图2E是图2A和图2B的示例性杯体的示意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0024]图2F是沿着图2D的线F-F截取的示例性杯体的示意性截面图；
[0025]图3A和图3B分别是不例性基底的不意性俯视透视图和仰视透视图，基底是图1A至图1F的示例性细胞捕获系统的一部分；
[0026]图3C、图3D和图3E是图3A和图3B的示例性基底的示意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0027]图3F是沿着图3D的线F-F截取的示例性基底的示意性截面图；
[0028]图4A和图4B分别是示例性基底组合件的示意性俯视透视图和仰视透视图，基底组合件包括图3A至图3F的示例性基底；
[0029 ]图4C、图4D和图4E是图4A和图4B的示例性基底组合件的示意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0030]图4F是沿着图4D的线F-F截取的示例性基底组合件的示意性截面图；
[0031 ]图5A是示例性细胞捕获系统的示意性俯视透视图；
[0032]图5B至图5D分别是图5A的示例性细胞捕获系统的示意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0033]图5E是沿着图1D的线D-D截取的示例性细胞捕获系统的示意性截面图；
[0034]图5F是图5A的示例性细胞捕获系统的示意性仰视透视图；
[0035]图6A是示例性杯体的示意性俯视透视图，杯体是图5A至图5F的示例性细胞捕获系统的一部分；
[0036]图6B至图6D分别是图6A的不例性杯体的不意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0037]图6E是沿着图6D的线D-D截取的示例性杯体的示意性截面图；
[0038]图6F是图6A的示例性杯体的示意性仰视透视图；
[0039]图7A是不例性基底的不意性俯视透视图，基底是图5A至图5F的不例性细胞捕获系统的一部分；
[0040]图7B至图7D分别是图7A的不例性基底的不意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0041 ]图7E是沿着图7C的线C-C截取的示例性基底的示意性截面图；
[0042]图7F是图7A的不例性基底的不意性仰视透视图；
[0043]图8A是用于与具有薄膜的杯体的环部一起使用的示例性适配器的示意性俯视透视图；
[0044]图8B至图8D分别是图8A的示例性适配器的示意性侧视图、俯视图和仰视图；
[0045]图SE是图8A的示例性适配器的示意性仰视透视图。
[0046]图9A是用于与图8A的示例性适配器一起使用的示例性透镜的示意性仰视透视图；
[0047]图9B至图9D分别是图9A的示例性透镜的示意性侧视图、俯视图和仰视图；以及[0048I图9E是图9A的示例性透镜的示意性俯视透视图。
【具体实施方式】
[0049]本发明涉及一种过滤系统(细胞捕获系统)、一种在所述过滤系统中捕获/收集细胞(包括活细胞)的方法，以及一种用于制造所述过滤系统的方法。可单独地或组合地使用细胞捕获系统和相关方法，以捕获/收集细胞以用于稍后分析，例如以确定所关注的特定样品的生物负荷(例如，以测量样品中的活细胞的数量和/或百分比和/或分数)。
[0050]细胞捕获系统可用以从多种来源捕获细胞(例如，微生物细胞，例如细菌、酵母菌或真菌细胞)，所述来源包括液体样品(例如，水样品)、可食用流体(例如，葡萄酒、啤酒、牛奶、婴儿配方奶粉等等)、体液(例如，血液、淋巴液、尿液、脑脊髓液等等)、培养基、通过从所关注的来源收集细胞(例如，经由拭子)且接着使所收集的细胞分散和/或悬浮而产生的液体样品，以及液体(例如，缓冲介质或培养基)。
[0051]下文将详细论述本发明的各方面和某些实施方案中的每一者。
[0052](I)细胞捕获系统
[0053]本文中所描述的细胞捕获系统可与光学检测系统一起使用，光学检测系统检测活细胞的存在。结果可用以测量所关注的特定样品的生物负荷(例如，以测量样品中的活细胞的数量和/或百分比和/或分数)。例如在2010年11月3日提交的国际专利申请N0.PCT/IB2010/054965、2011年2月24日提交的美国专利申请序列Νο.13/034，402、2010年11月3日提交的国际专利申请N0.PCT/IB2010/054966、2011年2月24日提交的美国专利申请序列%.13/034，380、2010年11月3日提交的国际专利申请如上(:1'/182010/054967和2011年2月24日提交的美国专利申请序列N0.13/034，515中描述了示例性检测系统。
[0054]本文中描述的细胞捕获系统提供许多优于现有细胞捕获系统的优点。举例来说，本文中描述的细胞捕获系统将薄膜周围的流体样品泄漏的风险减到最小，且因此，表征的流体必须通过薄膜。这降低了不注意地污染细胞捕获系统的被用户触碰或处置或放置在检测系统内的一部分的风险。此外，本文中描述的细胞捕获系统比其它系统更方便使用，因为其减少在用户操作期间的后续操纵步骤的数量，这在每个额外操纵步骤有可能将污染物引入至正被分析的样品中或正被分析的流体样品可能不注意地污染用户或周围环境的情况下可能是有利的。这将对用户或检测系统或周围环境的污染减到最小。此外，因为薄膜附接至环部的周边，所以薄膜基本上是平面的且可被形成以具有在期望的平面度公差内的平面度，期望的平面度公差是在操作期间将薄膜保持在某些光学检测器的检测系统的聚焦平面内所必要的。
[0055]如图1A至图1F示意性地示出的细胞捕获系统100的一个实施方案包括杯体105和基底110。任选地提供用于覆盖杯体105的盖115。盖115可在杯体105使用之前(诸如在将被施加的流体的运输或准备期间)保护杯体105的内部。细胞捕获系统100可用例如组装好的准备使用状态进行运输，如图1A至图1F中所描绘，从而允许用户在没有额外组合件的情况下快速地捕获或收集细胞，如下文更详细地描述。下文更详细地描述细胞捕获系统100的个别组件。
[0056]杯体105包括上部部分230、环部235和流体可渗透薄膜240，如图1F和图2A至图2F中所描绘。上部部分230大体上被配置用来将其中施加的流体朝杯体105的下部部分引导，环部235和薄膜240安置在所述下部部分。环部235可分离地联接至上部部分230，使得在需要时，环部235和薄膜240保留而单独丢弃上部部分230。环部235和相关联的薄膜240接着可转移至光学检测系统以用于对薄膜进行分析。
[0057]在一些实施方案中，上部部分230和环部235—体地形成在一起(例如，通过模制)，其中可分离性通过易碎连接245而实现。易碎连接245可采用许多形式，包括在上部部分230与环部235的交叉处的局部变薄的壁部分(例如，厚度为约0.25mm(0.0098英寸)而不是杯体105的其它部分的1.5mm(0.059英寸))。变薄的壁部分可类似于此交叉处的凹槽，且易碎连接245可形成凹槽，即使壁部分没有局部变薄。易碎连接245界定分割面250(见图2C)，在施加足够力(例如，大约5至20英寸镑(0.56至2.26牛顿米)或更大的扭矩)后，上部部分230与环部235沿着分割面250分开。可在杯体105和/或基底110上提供握把252以有助于用于施加必要的力而不打滑。握把252可以具有多种形式，诸如所描绘的条带，或将增大用户的握力的另一表面特征，诸如凸起点。在其它实施方案中，上部部分230与环部235分离地形成，接着后来通过另一连接(诸如螺纹连接、卡口连接和/或干涉配合)接合在一起。
[0058]在所描绘的实施方案(见图2F)中。薄膜240例如经由热焊接或超声波焊接在环部绕开口 255的环部的周边周围连接至环部235。薄膜240可以其它方式粘着或粘合至环部235的周边，诸如借助机械紧固件或粘合剂。连接可以是或可以不是永久的。期望形成流体密封以限制杯体105内的任何流体从杯体而不是通过薄膜240流出或排出。平面薄膜240具有暴露的第一表面(即，面向环部235的内部的侧面)，第一表面的至少一部分适于将细胞截留于其上面。薄膜部分可:(i)界定平均直径小于约IMi的多个孔隙，以便准许流体横越薄膜的所述部分，同时将细胞截留于其上面;和/或(i i)在暴露于波长在约350nm至约100nm的范围内的光时为基本上非自发荧光的。任选地，薄膜部分还可具有达约ΙΟΟμπι的平面度公差。平面度公差指定两个平行平面界定的公差范围，表面必须位于所述公差范围内。举例来说，在上文描述的平面度公差达约ΙΟΟμπι的实施方案中，薄膜240的部分上的每个点都落在隔开ΙΟΟμπι的两个平行平面之间。
[0059]薄膜240可以具有多种形状中的任一者，例如圆形、环部形、卵形、正方形、矩形、椭圆形等，且可使一个侧面的一部分或全部暴露以用于细胞截留。在一个实施方案中，薄膜240可以是盘的形状，例如，基本上平面盘。在某些实施方案中，多孔薄膜240的用于捕获细胞和/或粒子的部分大于400mm2、500mm2、600mm2、700mm2、800mm2、900mm2或 I，000mm2。在某些实施方案中，多孔薄膜240的用于捕获细胞和/或粒子的部分大于0.5cm2，例如从0.5cm2到300cm2，从0.5cm2到10cm2，从0.5cm2到50cm2，从Icm2到300cm2，从Icm2到10cm2，从Icm2到50cm2，从5cm2到300cm2，从5cm2到10cm2，从5cm2到50cm2。薄膜240(例如，以盘的形式)的厚度可在选自由以下各范围组成的群组的范围内:大约从Iym至3，000μηι，从ΙΟμπι至2，000μηι，和从10(^111至1，00(^111。在某些实施方案中，薄膜可具有约0.020”的厚度。
[0060]多孔薄膜240界定平均直径小于约Ιμπι的多个孔隙，以便准许流体横越薄膜240，同时将细胞截留于其上。在某些实施方案中，平均孔隙直径是大约或小于大约0.9μm、0.8μm、0.7μηι、0.6μηι、0.5μηι、0.4μηι、0.3μηι、0.2μηι、0.Ιμπι或0.05μηι。在某些实施方案中，平均孔隙直径是大约0.2μπι，且在其它实施方案中，平均孔隙直径是大约0.4μπι。合适的薄膜240可由尼龙、硝化纤维、聚碳酸酯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)(ΡΜΜΑ)、聚酯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乙烯和氧化铝制成。
[0061 ]另外，多孔薄膜240在暴露于波长在约350nm至约I ,OOOnm的范围内的光时是基本上非自发荧光的。如本文中关于多孔薄膜240所使用，将术语“在暴露于波长在约350nm至约I，000nm”的范围内的光束时是基本上非自发荧光的”理解为意指多孔薄膜240在用具有足以使细胞或粒子发射荧光的波长、注量、辐照度的光束照射时，与安置于薄膜上的具有荧光标记的细胞或荧光粒子相比发射较少荧光。应理解，用户和/或检测器应能够易于和可靠地将由荧光粒子或具有荧光标记的细胞引起的荧光事件与从多孔薄膜240发出的背景荧光进行区分。选择多孔薄膜240使得其可能检测安置于此多孔薄膜240上的荧光粒子或具有荧光标记的细胞或使所述荧光粒子或具有荧光标记的细胞可视化。在某些实施方案中，在相同条件下(例如，使用具有相同波长、注量和/或辐照度的光束)测量时，从用光束照射的多孔薄膜240的区域(例如，与正被可视化的细胞或细胞群体或粒子具有大致相同的表面积的区域)发射的荧光可能不大于从荧光粒子或具有荧光标记的细胞发射的荧光的大约30% (例如，小于30 %、小于27.5 %、小于25 %、小于22.5 %、小于20 %、小于17.5 %、小于15 %、小于12.5%、小于10%、小于7.5%、小于5%或小于2.5%)。
[0062]非自发荧光的合适的薄膜240可由薄膜，例如浸渍有碳黑或用惰性金属(诸如但不限于金、锡或钛)溅镀的尼龙、硝化纤维、聚碳酸酯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚酯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、或聚乙烯薄膜制成。具有适当的孔隙大小的基本上非自发荧光的薄膜240包括(例如)IS0P0RE?薄膜(Merck Millipore)、NUCLE0P0RE?径迹蚀刻薄膜(Whatman)、ipBLACK径迹蚀刻薄膜(由宾西法尼亚州匹兹堡AR Brown经销)，和聚碳酸酯(PCTE)薄膜(Sterlitech)。
[0063]在某些实施方案中，环部235具有周向配准特征以确保环部235恰当地定位于基底110中，而且这也提供薄膜240的一致定向。具有一致定向允许参照薄膜240上的细胞(例如，活细胞)截留在薄膜240的至少一部分上的特定位置。对于盘形薄膜，极坐标(S卩，径向“r”和角度“Θ”坐标位置)可以是合适的。在一些实施方案中，配准特征包括多个突起260(见图2A和图2C)，例如在环部235的周边周围间隔开的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个突起。在一个实施方案中，环部界定至少四个突起。为了恰当地将环部235定向，且进而将薄膜240定向，突起中的一者260’可与其它突起不同，诸如具有不同宽度、高度、厚度和/或间距(例如，与另一突起260间隔60度而不是90度)。基底上的对应特征(更多细节见下文)类似地设计大小以收纳突起260，包括独特的突起260’，使得环部235与基底110仅可在一个定向上联接。突起260也可以基本上对称的布局提供，使得多个定向是可能的。
[0064]图3A至图3F中所描绘的基底110具有用于收纳环部235的圆柱形壁265。尽管在所描绘的实施方案中是圆柱形的，但壁265可以具有与环部235的形状互补的多种形状，使得环部235可收纳在壁265内。壁265界定多个槽口 270，槽口 270被设计大小且适合于与突起260相适配。独特的槽口 270’可被设计大小或定位以收纳独特的突起260’，进而实现一致的参照系。突起260和槽口 270还可被设计尺寸以提供足够的摩擦配合，以便在相对于杯体230的上部部分将适当的扭矩施加至环部235/基底110时保持啮合，此时环部235沿着分割面250与杯体230的上部部分脱离。大约0.787mm(0.030英寸)的重叠可为足够的，但更大的和更小的重叠也可起作用。壁265还界定周向开口 275，开口 275在环部235安置在基底110内时(如图3A、图3D、图4A和图4F中所描绘)提供对环部235的接近。举例来说，取决于情况，用户可通过经由开口 275插入工具(例如，钳子)将环部235与薄膜240—起移去来移去环部。
[0065]基底110进一步界定用于收纳流体可渗透薄膜支撑体285的凹口280(见图3F)，支撑体285任选地是基本上平面的。薄膜支撑体285是可渗透的且适合于在环部235安置在基底110中时与薄膜240的底表面接触。例如呈光滑的平面的多孔塑料熔块的形式的流体可渗透支撑体285截留足够流体以维持在邻近可渗透支撑体285安置的多孔薄膜240中的湿度，这在某些实施方案中对于维持截留在多孔薄膜240上的细胞的成活力可以是重要的。支撑体285的厚度可在选自由以下各范围组成的群组的范围内:大约从0.1mm至10mm，从0.5mm至5mm，和从Imm至3mm。凹口 280界定开口 290以准许流体通过开口 290。
[0066]为了便于对所捕获的细胞进行准确检测和计数估计，在细胞检测期间薄膜240基本上是平面的(例如，基本上无皱折)是有益的(在一些例子中甚至是必要的，这取决于检测系统的配置和能力)。如本文中所使用，将术语“基本上平面的”理解为意指物品具有小于大约100μπι(β卩，在±50μπι内)的平面度公差。这是因为高度瑕疵(例如，皱折)可干扰光学检测/测量系统，从而导致错误的结果。因此，多孔薄膜240在干的和/或湿的时且取决于检测状况)在检测系统的检测能力内保持相对紧密的平面度公差可以是重要的。
[0067]在某些情况下，取决于所使用的检测系统，薄膜(和安置在其中的细胞)维持在紧密的平面度公差内(例如，在达约100μηι( ±50μηι)，例如，达约10μηι( ±5μηι)，达约20μηι( ± 10μm)，达约30μηι( ± 15μηι)，达约40μηι( 土 20μηι)，达约50μηι( 土 25μηι)，达约60μηι( ±30μηι)，达约70μηι( ±35μηι)，达约80μηι( ±40μηι)，达约90μηι( ±45μηι)的平面度公差内)，使得细胞可易于由检测系统在窄的聚焦平面内可视化。如果使用动态聚焦系统，那么预期可容许大于ΙΟΟμπι的平面度公差。因此，使用将薄膜和任何所捕获的细胞维持于基本上平面的定向中和适当紧密的平面度公差内以准许可靠检测的支撑系统可以是优选的。取决于检测系统和检测后要求，支撑系统可适合于在使含有细胞的溶液经由安置在固体支撑体内的孔隙通过固体支撑体之后在细胞已被捕获在固体支撑体上之后在薄膜为干的时和/或湿的/潮的时呈现和/或维持薄膜的平面性。
[0068]下文描述的各种方法允许多孔薄膜240在来自样品流体的细胞被捕获在薄膜上之后保持基本上平坦的，且基于本文中的论述，其它方法对于本领域技术人员来说可以是显而易见的。
[0069]在一个实施方案中，当多孔薄膜240被弄湿时，薄膜240与薄膜支撑体285之间的表面张力使薄膜240的底表面与支撑体285的上部适配表面相符合。举例来说，在一个实施方案中，薄膜支撑体285可以是流体可渗透的、固体的、基本上平面的元件，其在例如薄膜240被弄湿时将薄膜240保持于基本上平面配置。支撑体285是多孔的，且上部适配表面是基本上平坦的和光滑的。在另一实施方案中，支撑体285涂布有无毒粘合剂，例如聚异丁烯、聚丁烯类化合物、丁基橡胶、苯乙烯嵌段共聚物、硅橡胶、丙烯酸共聚物，或其某一组合。当例如从真空施加向下的压力时，多孔薄膜240变得松散地粘着至支撑体285，这导致多孔薄膜240与支撑体285的表面相符合。支撑部件285是多孔的，且上部适配表面是基本上平坦的和光滑的。举例来说，在一个实施方案中，表面具有达约10ym的平面度公差。
[0070]支撑体285的直径大致与薄膜240的用于收纳细胞的部分相同，且优选地支撑体285具有基本上均匀的厚度。支撑体285的厚度可在选自由以下各范围组成的群组的范围内:大约从0.1mm至10mm，从0.5mm至5mm，和从Imm至3mm。适合用于制造多孔支撑部件285的材料包括塑料、聚碳酸酯、高密度聚乙烯(HDPE)、玻璃和金属。在一个实施方案中，支撑部件285通过以下过程制成:烧结由聚(甲基丙烯酸甲酯)制成的平均直径为0.15至0.2mm的塑料粒子，塑料粒子保持在粒子熔点附近的温度下和足以使粒子烧结的压力下以使其一起熔化并形成均匀的结构。
[0071]尽管将薄膜240和支撑体285描绘为圆形的，但这仅仅是说明性的。在其它实施方案中，薄膜240和/或支撑体285可成形为正方形的、矩形的、椭圆形的等。一般来说，选择支撑体285(如果它被使用的话)的形状和表面积，使得支撑体285的表面与薄膜240的用于收纳安置于其上的细胞的部分具有大致相同的大小或稍小于薄膜240的所述部分。
[0072]在将样品流体倒至薄膜240上之前，将表面240安置成与支撑部件285的基本上平坦的光滑表面接触。在将样品流体排干之后，大体上平坦的表面有助于将薄膜240保持为基本上平坦的。支撑体285还可用作通过薄膜240的流体的储液器，以提供防止薄膜240和安置在其上的活细胞在检测过程期间变干的额外益处。变干对于被截留在薄膜240上的细胞的成活力可为有害的。
[0073]基底110还包括配准特征295以确保基底110恰当地且一致地定位于细胞检测系统中。在一个示例性实施方案中，配准特征295是基底110的外表面上的缺口。当基底110插入至具有适配特征的对应结构(例如，弹簧加载滚珠轴承)中时，当基底110 “锁定”至适当位置时，用户将知道基底已恰当地定位，或某一其它反馈被提供给用户。可使用其它配准技术，包括上文关于环部235与壁265之间的接合而描述的技术。
[0074]在另一实施方案中，细胞捕获系统500(如图5A至图5F中所描绘)在很大程度上类似于细胞捕获系统100，包括具有类似的组件，诸如杯体505、基底510和盖515。细胞捕获系统500还包括安置在杯体505底部的薄膜540，薄膜540被设计以与支撑部件585接合以有助于维持薄膜540(见图5E)的平面性。由于细胞捕获系统500的组件与细胞捕获系统100的组件有许多共同之处(通过使用共同编号而指示)，且具有如上文关于细胞捕获系统100描述的相同的或类似的性质，因此下文描述组件的各方面的唯一差别。
[0075]如关于细胞捕获系统100所论述，突起260和槽口270也被设计尺寸以提供足够的摩擦配合，以便在相对于杯体230的上部部分将适当的扭矩施加至环部235/基底110时保持啮合，此时环部235沿着分割面250与杯体230的上部部分脱离。然而，如果环部235与基底110之间的摩擦配合过大，那么随后可能难以将环部235从基底110移去以用于随后进行分析。使用附接至与基底110配合的杯体的闩锁(见图5至图7)可以解决这个问题。闩锁准许适当程度的摩擦配合以使环部235与杯体230的上部部分分开，但不需要此摩擦使得用户难以将环部235与基底110分离。参照图5至图7更详细地论述这些特征。
[0076]在图5A、图5B和图6A至图6F中分开描述的杯体505包括从杯体505的外边缘向下延伸的多个闩锁592。闩锁592被配置用来与基底510上的对应突起594(见图7A和图7C)啮合。尽管描述了两个闩锁592，但可使用少至一个，其中上限仅仅由闩锁的大小和安装闩锁592的表面的圆周指定。闩锁592可以是弹性的，使得当杯体505最初与基底510啮合时，闩锁592在与突出部分594的下部部分重新啮合之前在突出部分594周围弯曲。由于闩锁592与突出部分594的下部部分而不是其侧面啮合，因此闩锁592限制杯体505与基底510的纵向分离，但不限制或增大将杯体505与环部535分离的扭矩要求。与环部135—样，环部535具有突起660，，所述突起660，与其它突起660相比尺寸不同以充当配准特征。突起660，可相对较长且延伸至基底510中的空间中以在环部535的移去期间允许较易于抓住(例如，借助钳子)。用于啮合突起660’的这个空间在基底510具有邻近周向开口775的平坦表面796的实施方案中可能甚至更大，如图7A和图7B中所描绘。握把552示出在杯体505和基底510的外表面上(见图5F)，其可有助于用户产生适当的力或扭矩而不会打滑以将环部535与杯体505的上部部分分呙。
[0077]具有闩锁592的布置可有助于增大细胞捕获系统500在运输期间的稳定性，且限制杯体505在预期使用之前的任何时间变得与基底510分离的可能性。如果闩锁592提供额外稳定性，可能不需要环部535像在其它实施方案中一样紧紧地安插在基底510内。这可减小在细胞捕获之后将环部535从基底510移去所需的力，从而减小在移去期间环部535变得受损或薄膜变形至例如超出所需平面度公差之外的可能性。另外，增加较长突起660’和较宽的空间可能因为需要较小力将环部535从基底510移去而对用户有所帮助。
[0078]在图7A和图7C中，示出没有流体可渗透薄膜支撑体的基底510。在图5E中，可渗透部件585示于细胞捕获系统中安置在薄膜540下面。
[0079]在某些实施方案中，细胞捕获系统，明确地说是多孔薄膜240具有小于10—6、10—7、10一8或10—9的无菌保证水平。这可例如通过经由本领域已知的技术(例如，经由高压蒸消毒、暴露于电离性辐射，例如γ辐射，或暴露于杀菌流体或气体，例如环氧乙烷或汽化过氧化氢)对细胞捕获系统100或500杀菌而实现。细胞捕获系统100在杀菌之前、期间或之后可封闭在容器(例如，袋)内。细胞捕获系统100在最终杀菌(例如，经由暴露于电离性辐射)之前可放置在容器(例如，袋)内且被密封(例如，气密的)。
[0080](11)细胞捕获系统的制造和组装
[0081]可使用已知技术(包括注射模制和机械加工)来制造和组装细胞捕获系统100和500，以及其各种组件。尽管下文关于细胞捕获系统100描述技术，但相同技术可用于细胞捕获系统500和其组件。杯体105和基底110可由能够被杀菌的任何基本上刚性材料制成。举例来说，杯体可由本领域已知的材料(例如，塑料和金属)制造，这可取决于许多因素(例如，制造的容易程度、成本和所使用的联接系统)而变化。举例来说，当上部部分230和环部235是杯体的通过易碎连接隔开的一体组件时，上部部分和环部可使用聚合物材料(例如，聚乙烯或聚丙烯)来模制(例如，注射模制)。
[0082]在一种方法中，具有上部部分230和环部235的杯体110可以被制造成一个或多个部件。在将杯体105定位于基底110内之前，可将薄膜240在环部235的周边周围紧固至环部235。然而，应理解，取决于实施方案和紧固机构，可在将环部235附接至杯体的上部部分230之前将薄膜附接至环部的周边。此后，可接着经由连接(诸如螺纹连接、卡口连接或干涉配合连接)将所得的环部和薄膜组合件附接至杯体的上部部分。
[0083]各种组件可以具有广泛多种大小，但仍在本发明的范围内。在某些实施方案中，细胞捕获系统100的高在约I英寸与5英寸之间(例如，大约3英寸)，其中直径在约I英寸与3英寸之间(例如，大约2.25英寸)。可将细胞捕获系统100的大小设计成容纳从约10mL至约200mL的流体样品，但不同大小可用以容纳更多或更少流体。
[0084]如上文所描述，可以使用环部235与基底110之间的配准特征，因此将杯体105定位于基底110中的步骤将杯体105置于相对于基底110的预定周向定向。如果包括支撑体285，那么应在将杯体105定位于基底110中之前将支撑体285放置在凹口 280中。
[0085](I II)细胞捕获方法
[0086]如上文所描述，图1A至图1F描绘示例性细胞捕获系统100的组件，且图5A至图5F描绘示例性细胞捕获系统500的类似组件。下文关于使用细胞捕获系统100的方法的描述也适用于细胞捕获系统500。杯体105通过环部235与基底110之间的接合联接至基底110。可在杯体105的顶部提供盖115以保护杯体105的内部以防被污染。
[0087]在使用期间，为了捕获/收集细胞，将流体样品施加(例如，倒入)至杯体105中。由于上部部分105是楔形的，流体使薄膜240变湿且通过薄膜240。流体通常朝着基底110通过薄膜组合件(例如，通过薄膜240，和支撑体285，如果使用支撑体的话)。负压力(例如，真空)可用以抽吸流体通过薄膜240至开口 290，且有助于将薄膜240保持为基本上平坦的。流体施加步骤可在施加真空之前、同时或之后发生。预期基本上非自发荧光的薄膜240准许在约5托或约1托的真空下通过其的流速为至少5mL/cm2/分钟或至少1mL/cm2/分钟。
[0088]在抽吸流体通过细胞捕获系统100之后，流体中不能通过薄膜240的任何粒子和/或细胞截留在薄膜240的上暴露表面上。在将流体倒入至杯体组合件100中之后，可借助图4A至图4F中所描绘的所得组合件(具有任选的盖405和插塞410)将上部部分230与环部235分呙。
[0089]为了将上部部分230与环部235分离，用户可施加足够力以破坏连接。当上部部分230与环部235—体地形成时，如在示例性实施方案中，用户可相对于基底110扭转杯体105。基于突起260与槽口 270之间的重叠提供对此旋转的阻力，上部部分230将沿着分割面250与环部235分离。所需的力取决于许多因素，包括易碎连接245的厚度，且通常对细胞捕获系统100进行设计而需要至少5至20英寸镑(0.56至2.26牛顿米)。在将基底110转移至检测系统时，或在对含有薄膜240的基底110进行培育(例如)持续15分钟至8小时以准许所捕获的活细胞增殖时，可将盖405放置在基底110的顶部，以保护变潮的薄膜240和支撑体285以防被污染。可例如经由指状突起295将插塞410紧固至基底110底部，以便尤其在将基底110插入至其它设备中(例如，插入至本身被引入至检测系统中的台架)时防止残余流体的任何泄漏。
[0090]在另一实施方案中，可在将环部235、535从相应细胞捕获系统100或500移去之后将环部235、535放置到适配器800(见图8A至图8E)上。适配器800可具有与基底110、510类似的槽口 270，从而允许紧固地固持环部235、535。对于槽口 270可使用许多不同图案，包括在基底110、510中所描绘的图案，但可使用与环部235、535上的突起260、660互补的任何图案。如上文所描述，独特槽口 270’可用以在环部235、535安置在适配器800上时使环部235、535唯一地定向。配准特征895(例如，突起)可对适配器800进行定位以在适配器800放置于扫描系统中时定向适配器800(例如，借助匹配图案与台架相适配以确保恰当定向)。由于可将环部235、535唯一地定向在适配器800内，且可将适配器800唯一地定向在扫描系统内，因此薄膜240、540在扫描期间可具有一致且已知的定向。另外，凸起部分885可与支撑部件285、585类似地起作用，即，通过提供薄膜240、540的下表面(S卩，没有细胞的一侧)可接合的表面以在扫描期间维持薄膜240、540的上表面(S卩，有细胞的一侧)的平面性而实现。
[0091]类似于盖405(在图4A中用虚线描绘)，透镜905(图9A至图9E中所描绘)可与适配器800—起使用以覆盖其中的内容(例如，薄膜240、540)以防止污染。在一些实施方案中，透镜905可在扫描期间移去，而在其它实施方案中，透镜905在扫描期间可保留在适配器800上。透镜905的下表面可具有用于与适配器800相适配的一个或多个特征，诸如图9A至图9C中所描绘的壁。壁可置于适配器800的内壁与外壁之间的空间中，从而有助于确保在扫描期间透镜900的稳定性和薄膜240、540的全覆盖。透镜900的上表面可以是基本上平坦的或弓形的，且可受控制以确保恰当的扫描结果。
[0092]可在捕获之后的任何时刻用活性染色剂或活性染色系统(例如，如美国专利申请序列N0.13/875,969中所论述)对细胞进行染色，使得有可能选择性地检测活细胞并将活细胞与非活细胞进行区分。可任选地用生理上可接受的盐溶液和/或缓冲溶液对细胞进行洗涤以去除残余的非特异性结合的荧光染料和/或淬灭剂。
[0093]一旦已将细胞捕获系统用来捕获流体样品中最初存在的细胞，且适当地已对细胞染色，就可将所得薄膜(仍附接至环部)插入至台架(见美国专利申请序列N0.13/875,969)中以便插入至合适的检测系统中。例如在2010年11月3日提交的国际专利申请N0.PCT/IB2010/054965、2011年2月24日提交的美国专利申请序列Νο.13/034，402、2010年11月3日提交的国际专利申请N0.PCT/IB2010/054966、2011年2月24日提交的美国专利申请序列%.13/034，380、2010年11月3日提交的国际专利申请如上(:1'/182010/054967和2011年2月24日提交的美国专利申请序列N0.13/034,515中描述了示例性检测系统。涉及此类系统的其它专利申请包括美国专利公开案 N0.US2013/0316394、US2013/0309686、US2013/0323745和US2013/0316363。
[0094]以引用的方式并入
[0095]本文中引用的或在附录中附至本文的专利文献和科学文章中的每一者的全部公开内容出于所有目的以引用的方式并入。美国临时专利申请序列N0.61/641，805;61/641，809; 61/641,812; 61/784,759; 61/784,789 和 61/784,807 以及美国专利申请序列N0.13/875,914; 13/875,936; 13/875,969和13/886,004的全部描述出于所有目的以引用的方式并入本文中。
[0096]等效形式
[0097]在不脱离本发明的精神或基本特性的情况下，本发明可以其它特定形式实施。因此上述实施方案在所有方面应视作说明性的，而不是限制本文中所描述的本发明。可以各种组合和排列使用不同实施方案的各种结构元件和各种公开的方法步骤，且所有此类变体都视作本发明的形式。本发明的范围因此由所附权利要求书而不是以上描述指示，且落入权利要求书的等效性含义和范围内的所有改变都意在涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种用于收纳流体样品的细胞捕获系统，所述系统包括: (a)杯体，其包括: (i)上部部分， (ii)环部，其具有周边，其中所述上部部分可分离地联接至所述环部，以及 (iii)流体可渗透薄膜，其附接至所述周边以在所述薄膜与所述环部之间产生流体密封，其中所述薄膜的一部分适合于将细胞截留于其上面;以及 (b)基底，其被配置用来收纳所述环部。2.如权利要求1所述的系统，其中所述薄膜部分(i)界定平均直径小于约IMi的多个孔隙，以便准许流体横越所述薄膜的第二部分，同时将细胞截留于其上面，且(ii)在暴露于波长在约350nm至约100nm的范围内的光时为基本上非自发荧光的。3.如权利要求1或2所述的系统，其中所述薄膜部分具有达约ΙΟΟμπι的平面度公差。4.如权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述杯体适合于在流体被引入至所述上部部分中时将所述流体朝所述薄膜部分引导。5.如权利要求1至4中任一项所述的系统，其中所述环部与所述上部部分一体地形成。6.如权利要求5所述的系统，其中所述环部利用易碎连接可分离地联接至所述上部部分。7.如权利要求6所述的系统，其中所述易碎连接包括在所述上部部分与所述环部的交叉处的薄壁。8.如权利要求7所述的系统，其中所述薄壁交叉处界定周向凹槽。9.如权利要求6至8中任一项所述的系统，其中所述易碎连接界定周向凹槽。10.如权利要求6至9中任一项所述的系统，其中在施加足以破坏所述易碎连接的力后，所述易碎连接界定在所述上部部分与所述环部之间的分割面。11.如权利要求1至4中任一项所述的系统，其中所述环部经由螺纹连接、卡口连接和干涉配合中的至少一者可分离地联接至所述上部部分。12.如权利要求1至11中任一项所述的系统，其中所述环部包括周向配准特征。13.如权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述环部在所述环部的所述周边周围包括多个突起。14.如权利要求13所述的系统，其中所述多个突起中的一者具有与其它突起中的每一者不同的宽度、高度、厚度和间距中的至少一者。15.如权利要求1至14中任一项所述的系统，其中所述薄膜经由以下中的至少一者连接至所述环部:粘着、粘合、热焊接和超声波焊接。16.如权利要求1至15中任一项所述的系统，其中所述基底包括用于收纳所述环部的圆柱形壁。17.如权利要求16所述的系统，其中所述圆柱形壁界定与所述环部的多个突起相适配的多个槽口。18.如权利要求17所述的系统，其中所述槽口中的一者适合于收纳所述多个突起中的一者，所述多个突起中的所述一者具有与所述其它突起中的每一者不同的宽度、高度、厚度和间距中的至少一者。19.如权利要求16至18中任一项所述的系统，其中所述圆柱形壁界定周向开口，所述开口适合于在所述环部安置在所述基底内时提供对所述环部的接近。20.如权利要求1至19中任一项所述的系统，其中所述基底界定适合于收纳薄膜支撑体的凹口。21.如权利要求20所述的系统，其中所述凹口界定适合于准许流体通过的多个开口。22.如权利要求1至21中任一项所述的系统，其中所述基底包括配准特征。23.如权利要求22所述的系统，其中所述配准特征包括由所述基底的表面界定的凹部。24.如权利要求1至23中任一项所述的系统，其中所述杯体进一步包括适合于将所述杯体联接至所述基底的至少一个闩锁。25.如权利要求24所述的系统，其中所述至少一个闩锁适合于阻止所述杯体与所述基底在垂直于分割面的平面上分离。26.一种在细胞存在于流体样品中时收集细胞的方法，所述方法包括: a)将所述流体样品引入至如权利要求1至25中任一项所述的杯体的所述上部部分；以及 b)准许所述流体通过所述薄膜部分。27.如权利要求26所述的方法，其进一步包括在施加所述流体之后将所述上部部分与所述环部分离。28.如权利要求27所述的方法，其中将所述上部部分与所述环部分离包括施加足以将所述环部与所述上部部分拆开的力。29.如权利要求28所述的方法，其中施加所述力包括相对于所述基底扭转所述杯体。30.如权利要求24至29中任一项所述的方法，其进一步包括在施加所述流体之后将插塞紧固至所述基底的底部。31.—种制造如权利要求1至25中任一项所述的细胞捕获系统的方法，所述方法包括以下步骤: (a)提供具有周边的环部； (b)将流体可渗透部件紧固至周边以在所述薄膜与所述环部之间产生流体密封；以及 (c)将紧固有所述薄膜的所述环部定位于被配置用来收纳所述环部的基底内。32.如权利要求31所述的方法，其中在步骤(b)之前，将所述环部可分离地联接至所述上部部分。33.如权利要求31所述的方法，其中所述定位步骤包括使所述杯体与所述基底在预定周向定向上相适配。34.如权利要求31、32或33所述的方法，其进一步包括在将所述杯体定位于所述基底内之前，将多孔支撑体放置在形成于所述基底中的凹口中。
【文档编号】C12M3/06GK105874052SQ201480072096
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年11月4日
【发明人】诺尔曼·R·温赖特, 德纳·M·尼特尔, 埃里克·斯廷普森, 艾尔·福克斯, 托马斯·普赖德尔
【申请人】查尔斯河实验室公司