经有性杂交产生木霉菌节段性非整倍体(san)菌株之方法及所制得的san菌株的制作方法

文档序号:10517476阅读:585来源:国知局
经有性杂交产生木霉菌节段性非整倍体(san)菌株之方法及所制得的san菌株的制作方法
【专利摘要】本发明系关于一种提供木霉菌节段性非整倍体后代菌株之技术。具体而言,本发明关于一种藉由有性杂交两种带有染色体杂合性(例如,一个具有支架M及支架33,另一个具有支架F及支架X)之亲代单倍体菌株,以产生木霉菌节段性非整倍体后代菌株之方法;较佳地,至少其中一者包含一个非同源性末端接合(non?homologous end joining;NHEJ)基因。本发明亦关于因此产生之一种稳定的木霉菌节段性非整倍体后代菌株,具体而言该菌株具有增强的醣类活性酵素(carbohydrate?active enzymes;CAZymes)基因表现或活性,以及更具体的,可避免该菌株经一段时间后恢复成整倍体。
【专利说明】经有性杂交产生木霉菌节段性非整倍体(SAN)菌株么方法及 所制得的SAN菌株
[0001] 相关申请案
[0002] 依据35U. S. C. § 119(e),本申请案享有美国临时申请案的优先权(申请日:2013年 10月2号;申请号:61/886,043),其中所有内容皆引入本文W参酌。
技术领域
[0003] 本发明关于一种产生木霉菌节段性非整倍体后代菌株之技术。具体而言,本发明 关于一种藉由有性杂交两个带有染色体杂合性之亲代单倍体菌株,W产生木霉菌节段性非 整倍体后代菌株之方法;尤其其中一者进一步包含一个非同源性末端接合(NHEJ)基因缺 失。本发明亦关于一种因此产生之稳定的木霉菌节段性非整倍体后代菌株,该菌株具有增 强的醋类活性酵素(CAZymes)基因表现或活性,W及更具体的,可避免该菌株经一段时间后 恢复成整倍体。
【背景技术】
[0004] 木霉属之真菌可存在于泥±及其他多样之栖息地。其对于植物而言,也是一种有 益的共生伙伴,尤其是农作物。木霉菌会分泌纤维素酶及半纤维素酶,W分别降解e-葡聚醋 及木聚醋,木质纤维素生物原料的主要结构成份,W形成葡萄醋及木醋。迄今多种使用中之 高量酵素生产菌株(如QM9414、Rut-C30)系藉由化学诱变剂及/或福射处理木霉菌QM6a菌株 W产生的,并广泛应用于工业中。然而,经过多次化学及/或物理突变,该等高分泌性之突变 体之基因组存在太多的突变、缺失及重组[1-3],进而导致基因组的不稳定性。再者,该等工 业菌株所分泌之木聚醋降解半纤维素酶的量较e-葡聚醋降解纤维素酶的量少。
[0005] 木霉菌是泛热带子囊菌红褐肉座菌的无性型[4]。红褐肉座菌CBS999.97野生分离 株进行一种异宗配合的生殖周期,W产生CBS999.97( 1-1)及CBS999.97( 1-2)单倍体,并分 别带有MATl-I及MT1-2交配型基因座。QMfe带有MAT1-2交配型基因座,且亦可与CBS999.97 (1-1)单倍体交配W形成子实体,其含有子囊及16颗之子囊抱子[5]。
[0006] 减数分裂是一种特殊形式的细胞分裂,其可使得有性生殖之生物体可产生基因的 多样性。计划性DNA双股断裂(doub 1 e-strand breaks;DSBs)系为整个基因组中藉由减数分 裂特定Spoil核酸内切酶W自然产生的[6]。于模式生物体,像是酵母及老鼠,该Spoil诱发 的DSBs可藉由无错误同源重组方式W进行修复,进而确保同源染色体准确的分离,及基因 组之稳定性。相反地,先前研究显示非整倍体,或节段性非整倍体(SAN)的减数分裂产物,系 于部分丝状真菌中产生的。例如,真菌的人类病原菌新隐球菌,于减数分裂过程中会进行大 型的节段性复制,其系藉由与两个不同染色体间,进行端粒-端粒融合及染色体转位[7、引。 植物的病原菌真菌禾生球腔菌(小麦叶枯病菌的无性型)产生之子囊抱子,其具有高达8个 非必要之染色体[9、10]。植物致病性真菌红球丛赤壳菌交配世代VI (茄镶抱菌的无性型)之 部分子囊抱子分离株含有「过多的」染色体,称作「条件式之非必要的」染色体[11-13]。值得 注意的是,红球丛赤壳菌交配世代VI,于较老的麦角菌目中,与木霉菌属于基因近似之品种
[13、14]。
[0007] 目前仍有需要发展一种技术,W得到新颖的木霉菌菌株,其具有增强的醋类降解 酵素之表现或活性,尤其是半纤维素酶。

【发明内容】

[0008] 在本发明中,意外发现可存活的节段性非整倍体后代,其可藉由将两个带有染色 体杂合性(一者具有支架M及支架33,另一者具有支架F及支架X)之单倍体之木霉菌菌株进 行有性生殖,经减数分裂及后减数的有丝分裂而产生,其中所得到之SAN后代,包含一约长 度为SOOMbp之复制的染色体片段(如下述之D片段),其可增强各种不同之醋类降解酵素之 表现或活性。此外,亦发现一非同源性末端接合(N肥J)基因之缺失(tku70或连接酶IV tmus53)可稳定片段之复制,即预防SAN后代转变回整倍体,运表示负责整倍体之复原是 畑E J而不是同源性重组。吾人进而应用此技术W产生稳定的SAN菌株,其可产生较抓T-C30 (一种广泛使用的工业菌株,系用于木质纤维素生物原料之降解)更多之半纤维素酶。
[0009] 因此,于一方面中,本发明提供一种用于制备木霉菌节段性非整倍体菌株之方法, 包含下列步骤:
[0010] (a)辨识及挑选木霉菌第一菌株,其具交配能力,且其基因组中带有支架33及支架 M;
[0011] (b)辨识及挑选木霉菌第二菌株,其具交配能力,可与步骤(a)之第一菌株交配,且 其基因组中带有支架F及支架X;
[0012] (C)有性杂交步骤(a)之第一菌株与步骤(b)之第二菌株;
[0013] (d)从步骤(C)中辨识及挑选节段性非整倍体(SAN)后代,其之基因组中具有D复制 片段。
[0014] 于部分具体实施例中,该第一菌株具有MATl-I基因座,及第二菌株具有MAT1-2基 因座,或该第一菌株具有MT1-2基因座,及第二菌株具有MTl-I基因座。
[0015] 于部分具体实施例中,于步骤(a)中,该第一菌株系藉由进行一聚合酶链锁反应 (polymerase chain reaction;PCR)分析来辨识,藉此判定其基因组中支架33及支架M之存 在与否。
[0016] 于部分具体实施例中,于步骤(b)中,该第二菌株系藉由进行一聚合酶链锁反应 (PCR)分析来辨识,藉此判定其基因组中支架F及支架X之存在与否。
[0017] 于部分具体实施例中,于步骤(d)中,该SAN后代系藉由比较基因组杂交 (comparative genomic hybridization;CGH)分析或南方墨点分析来辨识,藉此判定D复制 片段。
[0018] 于特定具体实施例中,该SAN后代具有一个或多于一个之编码醋类活化酵素 (CAZyme)之基因,其基因表现系增强的。
[0019] 于部分具体实施例中,该第一菌株或第二菌株进一步包含非同源性末端接合 (NHEJ)基因缺失,该所得之SAN后代,系由第一菌株及第二菌株进行有性杂交所生成,其之 基因组中经辨识及挑选,确认具有D复制片段及NHEJ基因缺失。
[0020] 于部分实例中,该NHEJ基因为tku70或tmu巧3。
[0021] 于再一方面中,本发明提供一种制备稳定之木霉菌节段性非整倍体菌株之方法, 包含:
[0022] (a)将两个具有染色体杂合性之单倍体可交配之木霉菌菌株进行有性杂交,其中 该两个菌株中至少一者包含一 NHEJ基因缺失;及
[0023] (b)从步骤(a)中辨识及挑选出一后代,其为节段性非整倍体(SAN)且具有NHEJ基 因缺失。
[0024] 本发明亦提供一稳定之木霉菌节段性非整倍体菌株,系藉由本文所述方法制得。
[0025] 本发明一种或多种具体实施例之细节系于W下说明中详述之。其他本发明之特征 或优点,可藉由W下各种具体实施例之详细说明W及所附之申请专利范围得W明了。
【附图说明】
[0026] 先前的摘要,W及之后本发明之详细说明,阅读时配合所附之图式得W更佳的了 解。为了阐述本发明之目的,于图式中所示之具体实施例仅为较佳者。然应可理解的是,本 发明不局限于该等所示之准确组成及达成方式。
[0027] 图式中:
[0028] 图1显示十六颗子囊抱子之分离及其结果。(A)上图,基质;下图,发育中之子囊,其 含有16颗子囊抱子。每一颗子囊抱子根据其位于子囊之位置予W编码。从十六颗子囊抱子 来的16颗抱子接着将之分离,并于个别IOOmm之麦芽萃取洋菜胶(malt-extract aganMEA) 盘上生长。分离从一颗子囊抱子生成之单一聚落,并将之个别转移到一 60mm之马铃馨葡萄 糖洋菜培养基(potato dextrose agar;PDA)盘上。(B)将野生分离株CBS999.97(1-1)与 CBS999.97(l-2)(n> 20)、QM6a(n> 10)、抓T-C30(n> 10)或QM9414(n> 10)进行有性杂交, W于持续黑暗中生成十六颗子囊抱子。于持续黑暗中生成16颗野生型子囊抱子。该16颗单 一子囊抱子聚落系根据子囊抱子之顺序W依序排列。无法存活的子囊抱子系W哭脸符号表 /J、- O
[0029] 图2显示基因型鉴定之结果。基因组PCR分析于所有16颗存活之子囊抱子之matl- l、matl-2及tactl(肌动蛋白)基因,该抱子系由CBS999.97野生分离二倍体及一tku70A二 倍体所生成。该亲源野生分离单倍体菌株,CBS999.97 (1-1)及CBS999.97 (1-2),作为对照 组。
[0030] 图3显示微数组比较基因组杂交法(aCGH)之结果。CBS999.97(1-1)基因组DNA作为 一标准,W测量DNA套数的改变。于图谱中每一条线代表一个寡核巧酸及其位于QM6a及 CBS999.97 (1-2)基因组序列中之位置。该QM6a基因组组合包含89个支架。S个连续的支架 (27,28,36)重组成一较大的支架M。该寡核巧酸包含87个支架之正规化平均值如图所示。该 87个支架根据其长度依序从左到右排列。支架M之长度稍微较支架11短。该两个亲源野生分 离单倍体(A)及该野生分离株(B-F)之代表性子囊抱子聚落之基因套数,显示于左边。数据 可于基因表达库登录码GSE-40850取得。该带有复制片段之5个菌株(D1-D5)及7个整倍体之 对照菌株(N0-N6)亦如图所示。
[0031] 图4显示经红褐肉座菌子囊抱子形成/成熟期间之四次核分裂之影像。(A-G)手工 剖解发育中之子囊,WDAPI染色,接着W巧光显微镜观察。DIC及DAPI巧光染色影像如图标。 核(N)系W白色箭头标示。化)发育中之子囊的DIC影像显示8个核(8N)同步分裂成16个核 (16N)〇
[0032] 图5显示代表性微数组比较基因组杂交法(aCGH)结果,显示可存活的节段性非整 倍体(SAN)后代。该寡核巧酸包含支架25-37之正规化平均值如图所示。该等支架系根据其 长度由左至右排序。
[0033] 图6显示于减数分裂期间,经由同源性重组,可存活的SAN子囊抱子及无法存活的 子囊抱子之假设的形成模式。该染色体杂合性加速形成节段性非整倍体。
[0034] 图7显示于QM6a及CBS999.97基因组中之差别染色体之构成。(A)于QM6a及野生分 离株CBS999.97(l-2)基因组中之支架33及支架M。支架27、28、33及36系分别W墨绿色、蓝 色、黑灰色、及绿色箭头表示。支架28系位于靠近端粒(黑色)之位置,由于支架M之3'端系与 一重复的六核甘酸序列(TTAGGG)相连,其为QM6a之端粒重复。该支架化片段)之5'端系W亮 灰色表示。新颖基因(ID: 112288)之S个外显子化1、E2、E3)系如图所示。该第一外显子巧1) 仅存在于QMfe基因组中。(B)支架F及支架X存在于野生分离株CBS999.97( 1-1)基因组中。
[0035] 图8显示于减数分裂中,是染色体杂合性,而非N肥J,系与节段性非整倍体后代之 形成有关。图8(A)阐述分别用于进行支架(M、F、33及X)基因型鉴定之PCR引子对(A、B、C、及 D)之位置。图8(B)显示所示之单倍体菌株之PCR基因型鉴定。CBS999.97(1-1)、CBS999.97 a-2)及Q^ffia作为对照组。两个新的单倍体,CBS999.97(l-l,M,33)及CBS999.97(l-2,F,X), 系从该两亲源单倍体CBS999.97(1-1,F,X)及CBS999.97(1-2,M,33)之后代中被找到。吾人 发现所有从有性杂交CBS999.97(1-2,F,X)及CBS999.97(1-2,F,X)或有性杂交CBS999.97 (1-1,1,33)及〔85999.97(1-2,1,33)所生成之16颗子囊抱子皆为可存活的。再者,无论将 tku70或tmus53缺失皆不会影响各种相关菌株之减数分裂、子囊抱子数目或子囊抱子之存 活。请参阅实例2.2之表6。
[0036] 图9显示结果,于两亲源CBS999.97菌株之支架M(27+28+36)及支架33中,3个存 活的节段性非整倍体(SAN)子囊抱子、1颗存活的整倍体子囊抱子及2颗恢复成整倍体 (retu;rn-t〇-euploid;RTU)之菌株,指出于该存活的节段性非整倍体(SAN)子囊抱子中L片 段是不存在的。该结果显示于该两亲源CBS999.97菌株之支架M(27+28+36)及支架33中, 3个存活的节段性非整倍体(SAN)子囊抱子、1颗存活的整倍体子囊抱子及2颗恢复成整倍体 (RTU)之菌株。该3个SAN子囊抱子含有两个D片段,遗失了 L片段,然而,该2个RTU菌株具有一 个D片段及没有L片段。
[0037] 图10显示节段性非整倍体(SAN)后代可产生较高程度之木聚醋酶。(A)所述菌株之 木聚醋酶及纤维素酶活性(每Img之菌丝体中之活性单位(U))系W木聚醋酵素 AX锭及Azo-CM-纤维素分别作为受质来测量。实验WS重复进行,且W标准偏差呈现。(B)由热图产生, 比较基因组野生型转录图谱,5株菌株带有复制片段(D1-D5)及7个整倍体对照菌株(N0-N6) (P<0.05)。基因表达库登录码为GSE-41965d(C)全身性转录之基因套数之影响。5株带有节 段性复制之菌株(D1-D5)及7个整倍体对照组菌株(N1-N6)之基因组野生型mRNA量之平均比 率(上图)及基因套数(下图),如图示。所有测量系WS重复进行(P<0.05)。
[003引图11显示NHEJ基因之缺失,可稳定节段性复制及增强生长优势。(A)两个野生型 SAN(D2、D3)、tku70 A SAN及tmus53 A SAN(WTH1994)后代之aC細结果。于含葡萄糖之麦芽萃 取洋菜胶(MEA)培养基中子囊发芽后天数,如图右所示。基因表现库之登录码为GSE-42359。 (B)于木聚醋为主之Mandels An化oeotti培养基中,该SAN菌株较CBS999.97整倍体菌株或 恢复成整倍体菌株产生更多的生物原料。实验系W两个不同的聚落,进行=次试验,并W平 均值±SEM(误差线)表示。(C)该SAN(D2)突变株较亲源整倍体菌株于稻杆上长的更好。(D) 该Amu巧3SAN(Wrai994)菌株可维持高量之木聚醋酶活性长达50天。化、F)相较于RTU-C30, 一种广泛使用之木霉菌过度分泌型突变株,该tmus53 A SAN突变株(WTH1994)显示约~2倍 之专一木聚醋酶活性及~0.8倍专一纤维素酶活性。实验系W=次重复试验进行,且W平均 值± SEM(误差线)表示。
[0039] 图12显示在RTU前后,两个D片段之南方墨点分析。BsmBI限制酶位置及用于南方墨 点分析之DNA探针系如右图所示。于支架F及支架M之D片段的限制酶切片段,长度约分别为 ~400-bp及~1500-bp。该两个亲源半倍体菌株,CBS999.97( 1-1)及CBS999.97(1-2),作为 阳性对照组。
【具体实施方式】
[0040] 除非另有定义,所有本文所使用之技术及科学性术语与属于本发明领域之具有通 常技艺者所习知之意义相同。
[0041] 本文所用之术语「一」及「一种」系指一种或多于一种(即至少一种)本文章之语法 对象。举例而言,「一种组件」意旨一种组件或多于一种组件。
[0042] 本文所用之「约」或「近乎」或「大约」乙词系指所给之数值或范围之±20% W内,较 佳地为± 15 % W内,更佳地为± 10 % W内,W及最佳地为± 5 % W内。
[0043] 「多核巧酸」或「核酸」乙词系指一由核巧酸单元所组成之聚合物。多核巧酸包含自 然存在之核酸,像是脱氧核醋核酸(DNA)及核醋核酸(RNA) W及核酸相似物,包含该等具有 非天然存在之核巧酸。多核巧酸可被合成,例如,使用自动化DNA合成仪。「核酸」乙词典型地 系指大型多核巧酸。可被理解的是当一核巧酸序列WDNA序列(即A、T、G、C)代表,或包含RNA 序列(如A、U、G、C),其中「U」取代了「T」。「cDNA」乙词系指一DNA为互补的或与一mRNA相同,无 论是单股或双股的形式。
[0044] 「互补」乙词系指拓扑兼容性或两多核巧酸之交互作用表面可吻合。因此,该两分 子可被称为互补,且进一步该接触表面特征与另一者的为互补的。若第一多核巧酸之核巧 酸序列与第二多核巧酸之多核巧酸结合对象之核巧酸序列相同,则第一多核巧酸与第二多 核巧酸为互补的。因此,该多核巧酸之序列5/ -TATAC-3/系与一多核巧酸序列5/ -GTATA-3/ 为互补的。
[0045] 「编码」乙词系指一多核巧酸中之核巧酸之特定序列与生俱来的特性(如一基因、 一 cDNA、或一 mRNA),可于生物反应中作为合成其他聚合物及大分子之模板,其具有一特定 之核巧酸序列(如rRNA、tRNA及mRNA)或一特定之胺基酸序列及其所衍生之生物特性。因此, 若一基因所产生之mRNA转录及转译,可于细胞或其他生物系统中产生蛋白,则称该基因编 码蛋白质。具有技艺者可知的是多种不同的多核巧酸及核酸可编码相同的多胜肤,其为基 因密码之简并性。该等具有技艺者亦知,可使用常规技术W进行核巧酸取代,而不会影响由 前述之多核巧酸所编码之多胜肤序列,W对应出任何特定宿主生物体之密码子利用性来表 现该多胜肤。因此,除非另有定义,「一核巧酸序列编码一胺基酸序列」包含所有核巧酸序 列,其为彼此之简并形式,且编码相同的胺基酸序列。核巧酸序列编码蛋白及RNA可包含内 含子。
[0046] 本文所用之「整倍体」乙词系指所指之物种特征之染色体正常套数。「节段性非整 倍体」乙词系指一生物体基因组之状态,其中部分染色体片段呈现不正常之套数,例如,于 染色体特定区域发生复制。
[0047]该领域习知,提及基因组定序,主要序列数据都是短序列读取的。许多该等序列与 彼此重迭,且可被结合W产生较长的邻近序列,如片段重迭群。邻近的片段重迭群可为导向 的,有序的及互相连结成较长的支架,其多被安置于染色体上。木霉菌QM6a已被报告有89个 支架(套数或次序及具方向的片段重迭群)W产生约34Mbp之基因组序列[1]。该基因组序列 可于美国联合基因组研究所之木霉菌基因组数据库V2.0中取得化**口:/八61101116〇邑1-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)〇
[004引本文所用之「同源重组」乙词意指两DNA分子或染色分体间之DNA片段,于具有同源 性核巧酸序列之区域,发生交换。
[0049] 本文所用之「同源」乙词意指DNA序列之结构特征,与对照序列相比,具有至少约 70%序列相同性,相比于对照序列,具体上至少约85%序列相同性,更具体为至少约95%序 列相同性,更加具体为约99%序列相同性,最具体为约100%序列相同性。可理解的是同源 序列之核巧酸序列中可具有插入、缺失及置换。因此,若部分核巧酸残基不会完全对应或对 准,该核巧酸之线性序列可被认为本质上彼此相同。该对照序列可为一组较长的序列,像是 一基因或邻近序列的一部份、或染色体重复的一部分。
[0050] 为了决定两个核巧酸或胺基酸序列之相同百分比,将该等序列对准W进行适化的 比较(如可于第一序列之序列中引入沟道W与第二序列适化对准)。计算百分比相同性时, 一般完全吻合者会被计算。两序列间之百分比同源性或相同性之判定,可藉由使用该领域 所习知之数学算法进行,例如BLAST及Gapped BLAST程序、NBLAST及XBLAST程序、或ALIGN程 序。
[0051] 本文所用之真菌「有性杂交」乙词是指真菌提供者及真菌接受者间之杂交,其可进 行交配。该真菌提供者及真菌接受者一般为相同品种但具有不同的交配类型(MAT)基因座 或基因,其编码可能的交配型无性形及/或性基因。例如,该真菌提供者可能具有一种MAT基 因座类型,W及该真菌接受者可能具有相反的MAT基因座类型,其中该提供者之MAT基因座 可与真菌接受者之MAT基因座互补,W使该真菌接受者进行有性周期。一般说来,丝状的子 囊抱子真菌可具有两种交配型,MATl-I及MAT1-2, W及例如于具有MATl-I基因座之第一菌 株可与带有互补基因座(即MAT1-2基因座)之第二菌株发生有性杂交。
[0052] 本发明提供经由有性杂交W产生节段性非整倍体木霉菌后代菌株之技术,及其产 生之菌株。
[0053] 于一方面中,本发明提供一种产生节段性非整倍体木霉菌后代菌株之方法,其包 含辨识及挑选具有染色体杂合性之两个亲源可交配的单倍体菌株,例如其中一者具有支架 M及支架33,另一者具有支架F及支架X,接着将该两个亲源菌株进行有性杂交,并从有性杂 交中辨识及挑选出一节段性非整倍体后代,其具有D复制片段于其基因组中。
[0054] 如本文所述,存在于木霉菌(QM6a及CBS999.97)基因组中之支架M、33、F及X及D片 段,如图6及图7所示。
[0055] 具体上,本文所用之支架33包含:
[0056] (i)支架33之5'端,约33化(称作L片段),及
[0057] (ii)支架33之3'端,约17化b(称作33(3,)片段);
[0化引支架M包含:
[0059] (i)D片段,包含:
[0060] 支架28之3'端,长度约37化(称作28(3')片段),
[0061 ]全长的支架27,长度约42化P,及
[0062] 支架36之5'端,长度约52化(称作36(5')片段),W及
[0063] (ii)-非D片段,包含:
[0064] 支架36之3'端,长度约83化(称作36(3')片段),W及
[0065] 支架28之5'端,长度约370kb(称作28(5,)片段);
[0066] 支架F包含:
[0067] (i)D 片段及
[006引(ii)33(3')片段;及
[0069] 支架X包含:
[0070] Q化片段及
[0071] (ii)非 D 片段。
[0072] 表1显示根据本发明之特定具体实施例之第一菌株及第二菌株之基因组特征。
[0073] 表 1
[00751
[0076] *该4个支架(M、33、X、F)之核巧酸序列可上网取得:
[0077] http://be.imb.sinica.edu.tw/~Iab229/Text_f ile_Tl_4.rar.
[0078] 本文所述可用于判定木霉菌株之基因组特征之不同方法皆为该领域可知之方法。 具体而言,该方法可利用一种或多种寡核巧酸探针或引子,包含,例如,用于聚合酶连锁反 应(PCR)之引子对,其可专一地与支架序列的目标区域杂合。例如,(1)第一引子对(引子C及 引子B)可被设计W标祀界于L片段及支架33之3'端间的桥接区域,W判定支架33之存在与 否;(2)第二引子对(弓斤A及引子D)可被设计W标祀界于D片段及非D片段间之桥接区域(如 横跨该断裂位置,支架36:54323-54324),W判定支架M之存在与否;(3)第=引子对(引子A 及引子B)可被设计W标祀界于D片段及支架33之3'端间之桥接区域,W判定支架F之存在与 否;及(4)第四引子对(引子C及引子D)可被设计W标祀界于L片段及非D片段间之桥接区域, W判定支架X之存在与否。请参阅图8A所示,显示用于鉴定支架基因型之PCR引子A、B、C及D 之位置。表2-3显示引子A、B、C及D之特定序列,W作为一示例。
[0079] 表 2
[0080]
[i
[i
[00831
[0084] 根据本发明,该第一菌株及第二菌株为具交配能力的,且可与彼此交配,即其中一 者为一种交配型,另一者为相反之交配型。于一具体实施例中,该第一菌株具有MATl-I基因 座,及第二菌株具有MAT1-2基因座。于另一具体实施例中,第一菌株具有MAT1-2基因座,及 第二菌株具有MATl-I基因座。
[0085] 当第一具交配能力之菌株(含有支架33及支架M)及第二具交配能力之菌株(含有 支架F及支架X)被找到及挑选出来后,将两者进行有性杂交。可使用常规方法将木霉菌株进 行有性杂交。具体而言,可W使用含有适合的培养基之洋菜胶盘,如麦芽萃取洋菜胶(MEA)。 为了进行有性杂交,将第一菌株及第二菌株接种在洋菜胶盘上,彼此间间隔适当距离。适合 诱发有性杂交之环境为25°C持续黑暗2-3周、或置于12小时的光周期(12小时光/暗周期)达 8-10天。经培养后,分析盘上有性结构之生成情形。将有性结构(基质或子实体)从盘上取 出,于无菌水进行清洗。接着,将其切开,并将子囊抱子释放出来,W置于个别的麦芽萃取洋 菜胶盘(MEA)上W判定抱子存活与否。将每一个从一颗子囊抱子来的存活的聚落分离出来, 并将之转移到马铃馨葡萄糖洋菜培养基(PDA)盘上。进而分析其特征,包含聚落型态、聚落 颜色、基因型及/或基因组野生型之基因套数。
[0086] 接着,从经有性杂交后之存活的子囊抱子中挑选出其基因组中具有D复制片段之 节段性非整倍体后代。该D片段为约0.5Mbp之核巧酸片段,5 '端至3 '端包含:支架28之3 '端, 长度约37化、全长支架27,长度约42化P、及支架36之5 '端,长度约52化。该D片段可藉由aCGH 技术或南方墨点分析确认。
[0087] 根据本发明,该木霉菌SAN后代具有D复制片段,且具有许多有益特征,包含增强的 基因表现、或酵素活性、或对于产生生物原料之有益的生长优势。
[0088] 于一具体实施例中,藉由本发明之方法所产生之具有D复制片段的木霉菌SAN后 代,具有一种或多种编码醋类活性酵素(CAZyme)基因表现增强之特征,不仅是位于D片段 者,亦包含该等非位于D片段者。
[0089] 具体而言,该CAZyme编码基因系选自由:位于支架27之内源-0-1,4-木聚醋酶基因 Uyn2; ID: 123818)、位于支架28之0-甘露糖巧酶基因(ID: 69245)、位于支架2之CtA-阿拉伯 巧喃糖酶基因(GH54,ID: 55319)、位于支架5之細71a-l,3-心葡聚糖巧酶基因(GH71,ID: 120873)、及位于支架5之0-1,3寸-葡聚糖巧酶基因(cel3d,G册,10:46816)所组成之群组。
[0090] 于部分实例中,本发明之木霉菌SAN后代具有增强的木聚醋酶活性。
[0091] 于另一具体实施例中,本发明之木霉菌SAN后代可于木聚醋为主的培养基上产生 更多的生物原料。
[0092] 如本文所用者,当提及本发明木霉菌SAN后代之一种或多种有益特性,「增强的」、「 增加的」、或「更高的」等词是可互换使用的,是用于比较本发明木霉菌SAN后代之有益特征 与对照木霉菌菌株(例如一亲源菌株或一整倍体后代菌株,其不含有D复制片段)之对应特 征之差异。例如,一种或多种基因之「增强的」基因表现程度,酵素活性之「增加的」程度、或 本发明木霉菌SAN后代之「较高的」生物原料产量,意指该程度增加20%或更多、30%或更 多、50%或更多、75%或更多、100%或更多、2倍或更多、3倍或更多、5倍或更多、或10倍或更 多,相较于对照菌株而言,如一亲源菌株或一整倍体后代菌株,其不含有D复制片段。该增加 或强化可藉由具有技艺者所熟悉之方法判定之。该等方法之示例包含,但不限于蛋白分析、 北方或南方杂交法、反转录(定量RT-PCR)、化1 SA(酵素连结免疫吸附法,enzyme-1 inked immunosorbent assay)、西方墨点法、或放射免疫分析法(radioimmunoassay ;RIA)。于部分 具体实施例中,本发明之方法可进一步包含(e)挑选一带有D复制片段之SAN后代,其具有一 种或多种本文所述之有益特征。
[0093] 于吾人研究中,进一步发现丧失非同源性末端接合(N皿J)基因可稳定节段性复 审IJ,即预防本发明SAN后代恢复回整倍体。
[0094] 具体而言,本发明提供一种产生稳定木霉菌SAN菌株之方法,包含:
[00%] (a)将两个具有染色体杂合性之单倍体可交配之木霉菌菌株进行有性杂交,其中 该等亲源菌株中至少一者包含一 NHEJ基因缺失;及
[0096] (b)从步骤(a)中辨识及挑选出一所得之木霉菌SAN后代,其具有NHEJ基因缺失。
[0097] 「非同源性末端接合」乙词系指一自然、细胞反应,其中双股DNA断裂系藉由两个非 同源性DNA片段之直接接合而修复。木霉菌NHEJ基因编码Ku70、Ku80及Lig4,先前分别称作 tku70、tku80及tmu巧3。阮70及KuSO形成一异二聚体,W及其功能作为位于DSV端点之一分 子支架,与其他NHEJ蛋白(如DNA接合酶IV、Lig4)结合。
[0098] 根据本发明,NHEJ基因可于有性杂交前,自一个或两个亲源菌株中移除,如此,经 有性杂交两亲源菌株,即可产生及挑选出具有NHE J基因缺失之SAN后代。于部分具体实施例 中,本文所用之NHEJ基因为tku70或tmu巧3。基因缺失可藉由该领域所习知之方法进行[16、 17]。
[0099] 根据本发明,带有NHEJ基因缺失之SAN后代可稳定节段性复制一段时间,如2周或 更久、3周或更久、4周或更久、5周或更久、6周或更久、或7周或更久。
[0100] 于部分具体实施例中,第一具交配能力之菌株(支架33及支架M)及第二具交配能 力之菌株(支架F及支架X),至少其中有一者之NHEJ基因是缺失的,接着进行两菌株之有性 杂交,经挑选及辨识出所得具有D重复片段,及NHEJ基因缺失之后代。
[0101] 特定而言,根据本发明,SAN后代具有D复制片段及NHEJ基因缺失,且具有优异的特 征,不仅可产生更多之生物原料,亦于较长时间具有更高产量之半纤维素酶(如7周W上,50 天)。请参阅图IlB及图11D。
[0102] 本发明进一步W下列实施例阐述,系用于提供示例目的而非用于限制。该领域具 有技艺者应可藉由本发明之掲示,可明了各种于所接露之特定具体实施例中之改变,且仍 可获得相似或相近结果者,仍不背离本发明之精神及范畴。
[0103] 实施例
[0104] 吾人报告该16颗子囊抱子系藉由减数分裂及两次后减数分裂之有丝分裂生成。值 得注意的是,该CBS999.97(1-1)单倍体基因组,相较于该等CBS999.97(l-2)及QM6a(l-2), 于两个基因组支架中包含节段性重组。由于序列的杂合性,大部分的16颗子囊抱子基因座 (>90%)含有4或8个无法存活之子囊抱子,及相同数量之可存活之节段性非整倍体子囊抱 子。一约0.5Mbp之染色体复制片段可增强半纤维素酶之生成。再者,值得注意的,将非同源 性末端接合(NHEJ)基因(tku70或连接酶IV tmus53)缺失后,可稳定节段性复制,暗示是 N肥J而非同源性重组,负责整倍体之复原。吾人将此发现应用于生成一突变株,其可生产出 比抓T-C30(-种广泛使用的工业菌株,系用于木质纤维素生物质之降解)更多之半纤维素 酶。
[01化]1.材料及方法
[0106] 1.1菌株及有性杂交
[0107] 红褐肉座菌CBS999.97野生型分离单倍体菌株[5、15],tku70 AQM6a突变株[16]及 tmus53AQM6a突变株[17]已于先前研究被报告过。该两个CBS999.97单倍体突变株系藉由 将每一个突变株分别与野生分离株CBS999.97(1-1)进行杂交W生成。相对所生成之子 代突变株系与CBS999.97( 1-1)或CBS999.97( 1-2)菌株回交至少两次。有性杂交之施行方式 系如先前研究中所述者[5、1引。
[0108] 木霉菌有性杂交之施行方式如前述[15]。简言之,于一 10公分之麦芽萃取洋菜胶 盘(MEA)上,将CBS999.97(1-1)与 CBS999.97(l-2)或QM6a 杂交。将该 MEA 盘置于 25°C 培养,并 W持续黑暗方式2-3周,或经12小时光周期(12小时光/暗交替之周期)8-10天方式培养。一 带有光强度约80wiiol/m 2/s之植物培养箱系被用于本研究中。
[0109] 1.2十六颗子囊抱子分离
[0110] 为了将子囊抱子(或有性抱子)分离,成熟的十六颗子囊抱子系W手动从基质收集 分离而得,并将之转移到一 IOcm麦芽萃取洋菜胶(MEA)盘之中央。真菌四分体的分离系使用 显微操作器W连续地分离及单离出每一个于16颗子囊抱子中之子囊抱子。玻璃纤维针可轻 易破碎脆的囊壁,并分离出每一个子囊抱子,使得剩下的部分是完整的。于25°C植物培养 后,每一个存活的子囊抱子发芽生成一菌丝体聚落。将每一个菌丝体聚落转移到马铃馨葡 萄糖洋菜胶(PDA)盘上,W判定聚落型态及聚落颜色,接着藉由基因型鉴定及aCGH分析W分 析其特征。
[0111] 1.3野生型CBS999.97( 1-2)基因组之深度定序及全基因定序
[0112] 使用GS Rapid Libraiy Pr邱套组(Roche 454;45化ife Sciences,Connectixut, USA),依制造商之操作手册,从野生分离的CBS999.97(1-2)单倍体中分离出0.化g基因组 DNA,W建立454个定序之散弹枪基因库。所得到之基因库系藉由BioAnalyzer DNA化ip法 分析(Agilent Technologies ;California ,USA),W及使用Modulus巧光测量仪(Turner Biosystems ;California,USA) WFAM巧光定量之。于中央研究院生物多样性研究中屯、之高 速定序核屯、中屯、进行定序,并使用GS FLX Titanium系统进行之。原始读值从2.5次定序中 取得,全部共873Mb,于五组资料中,中间可读长度介于351至454nt间。全基因定序系W Newbler V.2.5.3(Roche 454),于单一CPU上执行。初步基因组重组包含1,087片段重迭群, 其大小介于500bp至404,555bp,其平均片段重迭群及N50大小,分别为29,833bp及66, 873bp。其他全基因定序组装及基因批注系藉由自家的计算机中屯、执行。组装完成的 CBS999.97( 1-2)基因组序列可从网络上取得化ttp: //140.109.32.39/~lab229/contig_ info/index.php)〇
[0113] 为了要评估深度定序的结果,群体批注包含Gene化tology(GO)分类可从木霉菌 基因组数据库V. 2.0(http: //genome. jgi-psf. org/Trire2/Trire2. home. html)中取得。使 用BLASTW进行批注,藉此找寻木霉菌(Trichoderma reesei)V. 2.0及木霉菌(Trichoderma virens)Gv29-8v2.0之同源基因。基因序列可从联合基因组研究所(Joint Genome Institute; JGI)数据库中下载化ttp: //genome. jgi-psf. org/);其中QM6a有9,143基因,木 霉菌中有12,427基因。吾人发现8,106个CBS999.97(1-2)及QM6a之同源基因,具有高度的序 列相似性(> 90%)。其他剩下的基因(<90% ),吾人发现有49个仅存在于QM6a中,且与 CBS999.97 (1-2)基因组之基因无任何相似性。
[0114] 1.4微数组比较基因组杂交法(aCGH)及数据分析
[0115] 使用标准技术将基因组DNA分离,并藉由Bioruptor SonicatoHDiagenode,UCD-200),使用75秒(高)及75秒关,共15分钟之反复周期W取得片段,W生成平均DNA大小为 500bp(介于200-1000bp范围)。将片段化之DNAW化noDrop ND-1000UV-VIS光谱仪定量,W 了解曲NA浓度及纯度。使用NimbIeGen双色DNA标记套组(Roche NimbleGen ,Madison ,WI), 将片段化之基因组DNA样本W切5或切3进行标记。将测试样本的基因组DNAW切3终端标记, 而CBS999.97(1-1)或QM6( 1-2)基因组DNA则W切5标记,W作为一参考标准,藉此测量DNA套 数的改变。该切5及切3标记的基因组DNA样本遂与客制化的寡核巧酸数组(4X72000构成) 杂合;该数组系藉由Roche-NimbleGen分别基于CBS999.97 (1-2)基因组序列及木霉菌v2.0 基因组序列所制成[15、1引。
[0116] DNA终端标记、杂合及筛选系于中央研究院之分子生物微数组核屯、研究所执行,系 使用NimbleGen系统技术(NG_CGH&CNV_Guide_v7pO),依供货商之标准操作方法进行之。影 像数据系WNimbleScan软件2.6.3版(Roche NimbleGen) W进行处理,W获得原始强度的数 据(.pair file)。数据分析及正规化系使用Agilent GeneSpring GX 11.5.1,藉由自家的 生物信息中屯、进行。原始强度规模系使用分位数正规化转换;该正规化是被用于将数组中 偏差修正,并使得所有的分布一致化。吾人发现QM6a微数组之aC細结果,系与CBS999.97微 数组之结果一致,且之后会于Gene Expression Omnibus(GEO)提交。
[0117] 1.5基因组-野生型微数组杂合
[0118] 全RNA分离及基因组-野生型mRNA微数组实验已于先前被报告过[15]。所有实验系 W S次技术重复试验进行,且使用至少立组不同的生物复制样本。使用Agi lent GeneSpring GX 12.0进行数据分析及正规化。原始强度规模系使用分位数正规化转换;该 正规化是被用于将数组中偏差修正,并使得所有的分布一致化。同时应用t-test及倍数改 变指针W辨别不同的基因表现程度(P值含0.05及倍数改变含1.5)。于菌株丛分析中,使用 分层法W进行分层算法,及使用欧式距离法用于相似性的测量。
[0119] 1.6角瓶震荡培养
[0120] Wlml之灭菌的抱子溶液[0.8%化Cl,0.05%Tween 20(Sigma)],从S天之盘(直 径IOcm之培养皿)上收集分生抱子,剧烈震荡后W玻璃绵过滤。将体积调整至ODsoonm等于 0.3,并将Iml的抱子悬浮液转移到250ml之锥形瓶中,瓶中含有50ml之Mandels-ArKlreotti 基础培养基;该培养基系Wo. IM巧樣酸-憐缓冲液(pH 5.0),及Ig L-I蛋白腺及0.33g L-I尿 素审Ij成。将 10邑 L-iSolka Floc 200( International Fiber Corporation , North Tonawanda,USA)或枠木木聚糖(Sigma Al化ich,USA)加入作为炭源,W分别诱导纤维素酶 或木聚醋酶表现。经S天于持续黑暗中、25°C、于一旋转震荡器(200rpm)中培养后,将角瓶 用于生物原料测定及酵素分析。
[0121] 1.7生物原料测定
[0122] 为了测量生物原料,将50ml震荡角瓶培养物,W干式MiraclotMCalbiochem, 化rmstadt,Germany)进行过滤,并W蒸馈水冲洗,并W纸巾擦干。将真菌的菌丝体收集,W 液态氮冷冻、存于-80°C备用。为了进行总蛋白之量化,将真菌样本溶解于5ml之0.1 N化OH 中。将溶液W数字符音波降解器(Branson)将之碎破,所使用之循环为30%6分钟(30秒开及 30秒关)。将样本接着于室溫培养3小时,并W5251 X g离屯、10分钟。上清液的蛋白浓度系W 修饰的Low巧蛋白分析法测定,使用牛血清白蛋白作为标准。
[0123] 1.8酵素分析
[0124] 为了测定内源的1,4-0-聚葡萄糖酶(纤维素酶)之活性,将上清液Wl :2至1:10之 比例稀释,并加入Azo-CM-纤维素溶液中(S-ACM化;Megazyme International, Ireland)。此 步骤系根据制造商之操作建议进行。Azo-CM-纤维素酶为一种染色的多糖,其Remazol Brilliant Blue R浓度约为每20个糖残基有一个染剂分子(Megazyme International)。此 方法较滤纸法(如DNS法)要更敏感(50-100倍)。
[012引为了测定内源的1,4-0-木聚糖酶(木聚糖酶)之活性,将上清液Wl :2至1:10之比 例稀释,并于40 °C加热5分钟。将木聚醋混合酶AX试验锭受质(T-XAX200 ; Megazyme International)加入上清液中(0.5mL),并于40°C培养10分钟。加入IOml中止溶液(2% Trizma Base,抑~9) W停止反应。将样本W2000 Xg进行离屯、10分钟,并于59化m吸光质进 行测量。黑曲菌木聚糖酶(~300mU/mL)系作为一对照组,并按照制造商所使用之方法进行。
[0126] 2.结果
[0127] 2.1于木霉菌中之四个减数分裂产物进行两次进一步的有丝分裂
[0128] 吾人应用酵母菌四聚体分离,W连续从子囊分离出16颗子囊抱子于洋菜胶盘上。 根据每一个子囊抱子于子囊中之线性序列将之编号,并于25°C、黑暗中培养两天,W判定抱 子是否存活。为了避免交叉污染,将每一个存活的聚落个别转移至另一个盘中(图1A)。将该 16颗子囊抱子依存活性、聚落型态、聚落颜色进行比较及分类(图IB-图1E),PCR基因型分析 (图2)及使用NimbleGen微数组之aCGH分析[15、1引(图3)。用于基因组PCR之引子如下所示:
[0129] 表4
[0130]
[0131] 从每一个16颗子囊抱子中所得之16颗子囊抱子可被分类成四类线性排列的组别, 且每一组含有4个基因上相同的子囊抱子。此发现显示16颗子囊抱子系藉由减数分裂,并接 着两轮的后减数之有丝分裂所产生。藉由将发育中之子囊W4',6-二脉基-2-苯基吗I噪 (DAPI)进行染色,吾人使用巧光显微镜亦发现两次减数分裂W及两次进一步的有丝分裂 (图 4)。
[0132] 2.2于减数分裂中诱导节段性非整倍体
[0133] 吾人发现将 CBS999.97( 1-1)与 CBS999.97( 1-2)进行有性杂交(图 1B)或 QM6a( 1-2) 进行有性杂交(图1C),可产生高比例的无法存活的子囊抱子。该等16颗子囊抱子大多数(〉 90%,n含30)含有8个或12个存活的子囊抱子。该两个纤维素酶过度表现的突变株,RUT-C30 (图1D)及QM9414(图化),亦可与CBS999.97( 1-1)交配,但常产生带有0或4个可存活的子囊 抱子的16颗子囊抱子。
[0134] QM6a具有7个染色体,且其基因组大小为34.道6。木霉菌乂2.0916曰基因组数据库 (联合基因组研究所,USA)包含89个支架及97个片段重迭群[1]。吾人应用aCGH技术W鉴定 基因组野生型基因套数目。aCGH结果显示两个CBS999.97亲源的单倍体株为整倍体(图3A)。 相反地,所有从8个存活的子囊抱子产生之存活的后代(图3B)具有一套源自于全长支架27 (134个基因及~424kb)、支架28之3'端(12个基因,~3化b),及支架36之5'端(15个基因,~ 54kp)(图5)。藉由深度定序CBS999.97(1-2)基因组,吾人发现该复制的区域(系指「D片段」, 如图6及图7所示)于该=个支架(27、28、及36)中为连续的片段。该=个支架接着重组为一 个较长的支架,系指支架「M」(图3B、图6及图7)。基因组PCR、定序、南方墨点分析进一步显示 支架M位于端粒附近,由于支架M的3'段与一重复的六核巧酸序列相连接,TTAGGG,此即为 QM6a之端粒重复序列[1]。吾人亦发现所有于16颗子囊抱子中之抱子具有16颗存活的子囊 抱子为整倍体,且不具有D复制片段(图3C)。相反的,野生型CBS999.97 16颗子囊抱子带有 之12颗存活抱子,有8颗为整倍体子囊抱子及4颗带有D复制片段之SAN子囊抱子(图3D-图 3巧。
[0135] aC細结果进一步显示,于一新基因 (ID 112288)之第二内含子中,假设的DNA双股 断裂位置(支架36:54323-54324bp)负责片段性复制残基。额外的PCR及定序分析显示,于野 生分离的CBS999.97之两个单倍体基因组中,该新颖QM6a基因之第一个外显子(支架36: 53664-53943bp)是被去除的(图7)。值得注意的,比较野生分离CBS999.97(l-2)及QMfe基因 组,野生分离CBS999.97 (1-1)基因组存在大量的节段性转位:(1)支架33之5 '端(1-33, 249bp;系指「L」片段)与支架M非复制区域连接W形成一新的支架「X」于CBS999.97(1-1)中; (2)支架33的3'端(33250-297,000bp)与支架M的D片段物理性连接W形成一新的支架「F」于 CBS999.97(1-1)中(图6及图7)。为了判定于减数分裂中,是否染色体杂合性与节段性复制 有关,吾人将两个野生分离之单倍体CBS999.97( 1-1、F、X)及CBS999.97( 1-2、M、33)杂交W 生成两个新的单倍体〔85999.97(1-1、1、33)及〔85999.97(1-2立心)(图8)。于该等单倍体中 之四个支架的存在系由诊断型PCR分别使用4个专一引子(A-D)巧憶之(表5)。
[0136] 表5 「01371
[013 引吾人发现由杂交 CBS999.97(1-1,F,X)及 CBS999.97(1-2,F,X),或 CBS999.97(1-1, M,33)及〔85999.97(1-2、1、33)所产生之16个子囊抱子皆存活。于任何相关菌株中,将非同 源性末端接合(N肥J)基因,tku70或DNA连接酶IV tmu巧3去除不会影响减数分裂、子囊抱子 数目或子囊抱子的存活率(表6)。
[0139]
[0140] 该等结果显示,于减数分裂期间,两对同源性支架(M/F及33/X)间的同源性重组于 SAN子囊抱子的形成有关。因此,吾人提出一模式(图6),描述如何藉由同源重组W得到存活 的SAN子囊抱子,且具有两个D片段,但不具有L片段,W及带有两个L片段之无法存活的子囊 抱子。此假设与吾人aCGH结果(图9) 一致,所有SAN子囊抱子(D2、D3及D5)缺乏L片段。
[0141] 2.3南方墨点分析
[0142] 为了进一步确认D复制片段之有无,遂进行南方墨点分析。
[0143] WBsmBI将木霉菌基因组DNA酶切,于0.8%洋菜胶上电泳,W32P-标记之DNA探针进 行南方墨点分析,接着使用化jif iIm影像分析仪成像。DNA探针(304bp) (SEQ ID NO: 9) W PCR增幅,所使用之两个寡核巧酸引子为PA7543(S^agctacatgagatcctgcat)(SEQ ID NO: 10)及PA7544(5'-TCAGGTGCACTCTGCACGAA)(沈Q ID N0:11)。
[0144] 表7
[0145]
[0146]
[0147]南方墨点藉由曝露在X光片上得W影像化(GE化althcare,USA)。分子量标记位于 左侧。该CBS999.97(1-1)亲源单倍体株具有443bp片段(SEQ ID ^:12);而〔85999(1-2)亲 源单倍体株具有1512bp片段(SEQ ID NO: 13)。该SAN后代具有该两个片段。经恢复成整倍体 (RTU)后,仅有433bp片段遗失。请参阅图12。
[0148] 2.4先代的木霉菌基因组可能含有支架M及支架33
[0149] 具有性交配能力之CBS999.97菌株系从一位于法国盖亚那之蓄水湖中分离出来
[23],然而系于第二次世界大战时于所罗口群岛发现。许多其他非CBS999.97之单倍体 菌株是从其他不同的地理位置所分离的[5]。于此使用诊断式PCRW研究该四个支架(M,33, F,X)于9个代表性之非CBS999.97分离株中之分布情形,其分别从法国盖亚那、己西、印度尼 西亚、及新喀里多尼亚所分离。使用前述四组引子(A-D)(表2、表5及图7),吾人可于8个分离 株中侦测到支架33(除了G.J.S 84-473W外),及可于6个分离株中侦测到支架M(除了G.J.S 84-473、G. J. S 86-410及G. J. S 93-23 W外)。有趣地,支架F及支架X于该9个非CBS999.97分 离株中皆无法测得(表8),指出,相较于CBS999.97( 1-1),该等非CBS999.97分离株之基因组 可能与该等QMfe及CBS999.97( 1-2)更为相似。
[0150] 表8 [01511
COl
[0153] 藉由有性杂交及单一子囊抱子单离实验进一步验证此假设:首先,CBS999.97 (I -2,M,33)可与3个法国盖亚那分离株(G.J.S. 86-404,86-410及G.J.S. 84-473)交配,且产生 具有16颗可存活的子囊抱子于子囊中,虽然吾人诊断式PCR方法无法测得支架M及支架33于 G.J.S.84-473中。第二,藉由有性杂交CBS999.97(l-l,M,33)与G.J.S.89-7(Brazil,化ra)、 G.J.S.97-178(&razil,Para)、G.J.S.93-23(New 化Iedonia)及G.J.S.85-236(Indonesia, Celebes)可生成16颗存活的子囊抱子于几乎所有所生成的子囊中(表9)。
[0154] 表9
[0155]
[0156] *:诊断式PCR无法分别于G. J. S. 84-473及G. J. S. 93-23 测得M、F、33 或X。
[0157] 因此,吾人推测先代木霉菌基因组可能含有支架M及支架33, W及支架F及支架X, 之后于法国盖亚那进化,其于支架M及支架33间发生不一致之DNA重组。有趣的是,该经检测 之9个非CBS999.97分离株可能仅与CBS999.97 (1-1)或CBS999.97 (1-2)发生有性杂交,而非 与彼此发生交配(表10)。
[015引 表10
[0159]
[0160] 有性杂交CBS999.97( 1-1)与RUT-C30(图1D)及QM9414(图1E)多生成带有0或4颗存 活的子囊抱子之子囊,此结果可能与序列杂合性有关。如前述,该两个纤维素酶过度产生的 突变株经过多次的物理性及化学性突变导致具有已存在多种突变、缺失及染色体重组[2、 3]〇
[0161] 2.5节段性复制影响局部及全面性的转录作用
[0162] QM6a基因组之检验证明发现,许多编码该醋类活性酵素基因(CA巧mes)为非随机 散布于多个基因簇中山。该CA巧mes可切割、建构及重组寡-及多醋类[24]。多数CA巧me基 因于该等基因簇中编码糖巧水解酶,其用于降解木质纤维素及植物细胞壁。先前转录学研 究亦发现邻近或附近的邻近基因可于于支架1、6、28及29之4个CA幻me基因簇中共同表现
[1]。值得注意的是,于支架28之CA巧me基因簇位于D片段,且包含一内源的-0-1,4-木聚糖 酶基因 (ID 69276)、e-甘露糖巧酶(ID 69245)及该cip2葡糖醒酸醋酶基因 (ID 123940)。该 D片段亦于支架27QD 123818)含有xyn2木聚糖酶II基因。该4个基因皆编码具有半纤维素 酶活性之酵素[24]。的确,相较于整倍体后代或其亲源的单倍体菌株,带有两个D片段之后 代存在较高的木聚糖酶活性(图10A)。
[0163] 接着,藉由比较5个具有复制片段(D1-5)之后代的转录学图谱及其亲源株(NO)及6 个整倍体后代(N1-6),吾人检验是否该节段性复制会影响全面的转录作用。热图及分簇分 析结果显示于该5个带有复制片段之后代的转录学图谱与该7个整倍体对照菌株的图谱不 同(图lOB)。令人意外地,节段性复制不仅增强该复制基因之局部转录,亦全面性促进许多 非复制基因的转录(图10C)。于该3个SAN菌株(D2、D3及D5)具有较高之木聚糖酶活性(图 10A),其中相较于存在于该6个整倍体后代菌株者(N1-N6;图10C),该3个SAN菌株有五个 CAZymes之转录作用系中度的、显着的增强,包含xyn2(3.5-倍,P = 0.0 10;支架27, ID: 123818)、e-甘露糖巧酶(3.4-倍,P = O.019;支架28, ID:69245)、G册4〇-1^-阿拉伯巧喃糖酶 (2.3-倍,P = 0.019;支架2,ID:55319)、候选的GH71a-l,3-レ葡聚糖巧酶(2.5-倍,P = 0.030;支架5, ID: 120873)及cel3d 細泌-1,3A-葡聚糖巧酶(1.9-倍,P = O.009;支架5, ID: 46816) O
[0164] 于该5个节段性非整倍体菌株(D1-5),至少有42个已批注的或可能的基因(包含23 个CA巧mes、7个转录因子、8个醋类运输子、4个Gcn5-相关的N-乙酷基转移酶),较存在于该7 个整倍体对照菌株之基因(NO及N1-6),具有至少增高两倍(p<0.05)转录量之现象。请参阅 表11。
[0165] 表11节段性基因组复制诱导局部及全身性转录增幅
[0166]

[016 引
[0169] *於支架I、6、28及29之CAZyme基因簇中之基因为Madinez et al,2008所报告过。
[0170] #该等后述已注解CA幻me基因,包含糖巧水解酶基因(G化)、醋类醋解酶(CEs)、及 多醋解离酶(PLs)化aWdnen et al,2012)。
[0171 ] 2.6于木聚醋为基底之培养基上,节段性复制提供生长优势
[0172] DNA套数的改变是很有害的[25]。该aC細结果指出从野生型CBS999.97所产生之 SAN后代,经过2-3周之无性繁殖后,于富含葡萄醋培养基上培养,总是会回复成整倍体状态 (图11A)。于多种微生物上之研究也显示DNA套数的改变可为有益的,于特定压力下可增加 存活[8、11、12、25-30]。吾人发现,当培养于木聚醋为基底的培养基上时,相较于该亲源 CBS999.97整倍体菌株及回复成整倍体(RTU)突变株者,将该SAN突变株培养于木聚醋为基 底的培养基上时可产生更多的生物原料(图11B)。于该RTU突变株中缺乏L片段(图9,下两 图),吾人可结论D复制片段,而非L片段缺失,与在木聚醋为基底的培养基上之生长优势有 关系。有趣地,该SAN株亦较CBS999.97整倍体单倍体者于稻杆上长的更好(图11C)。结论是 该等结果显示减数分裂所造成的节段性复制显然提供一优势,可短暂地增强降解及利用木 质纤维素生物原料之能力。
[0173] 2.7NHEJ基因缺失可预防SAN恢复成整倍体
[0174] 值得注意地,吾人发现将tku70或tmus53去除可稳定节段性复制高达7周W上(图 11A)。吾人亦发现两个tmus53 A SAN突变株(WTH1994及WTH4503),较野生型及tmus53 A整倍 体株,不仅产生更多的生物原料(图11B),且可维持半纤维素酶高生产量长达7周W上(图 11D),系指出NHEJ,而非同源重组,调控回复成整倍体之机制。该tmus53 A SAN株(WT化994), 较工业株抓T-C30,可分别分泌多于2倍W上之木聚糖酶(图11E) W及约0.8倍之纤维素酶 (图11F)。于先前结果一致[31],RUT-C30较QM6a多分泌约3倍之纤维素酶(图11F)。该等结果 显示该tmus53 A SAN突变株具有有用的工业应用潜力。
[0175] 表12非同源性末端接合基因的丧失可预防节段性非整倍体(SA)恢复成整倍体化 )1
[01761
[0177] I.节段性非整倍体(SAN)及整倍体化)系由微阵列比较基因组杂交法(aCGH)实验 所判定。
[017引 2. ND表示无法判定。
[01巧]3.摘要及讨论
[0180] 本研究显示木霉菌有性发育及基因组可塑性之至少5个新颖特征。
[0181] 首先,木霉菌经由减数分裂及另外两次之有丝核分裂W产生具有16颗子囊抱子之 子囊[4]。有趣的是,大多其他的子囊抱子真菌,分别经由减数分裂,产生具有4颗子囊抱子 之子囊(如酿酒酵母);或经由减数分裂及一次的后减数分裂产生8颗子囊抱子(如粉色面包 霉困)。
[0182] 第二点,与其他许多丝状真菌相似,具有性交配能力之CBS999.99野生分离株常产 生无法存活的子囊抱子。两个同源的单倍体菌株(如CBS999.97)可于自然环境中发生有性 杂交,W及该两个CBS999.97单倍体基因组之染色体杂合性与产生无法存活的子囊抱子有 关,让人感到有趣的提出假设,或许木霉菌可藉由两次后减数分裂,W增加每个子囊中之整 体子囊抱子数量,W克服此一缺陷。
[0183] 第S点,吾人结果显示先代木霉菌基因组,如CBS999.97,含有支架M及支架33。于 支架M及支架33间发生不均等的DNA重组可产生含有支架X及支架F之CBS999.9(1-1)单倍体 基因组。因此,吾人推测G.J.S.85-249(1-1,M,33)基因组可能于其他染色体区域含有不同 的同源性序列或重组现象,因为将G.J.S.85-249( 1-1,M,33)与无论是CBS999.97(1-1,M, 33)或CBS999.97( 1-2,F,X)进行有性杂交,皆导致带有4、8或12颗无法存活的子囊抱子的子 囊(表2)。藉由有性杂交两个带有染色体杂合性之单倍体菌株(一个含有支架33+M,及另一 个含有支架F+X),一种带有D复制片段之SAN后代具有增强的醋类活性酵素(CAZymes)之表 现程度或酵素活性,或可产生更多的生物原料产生。
[0184] 第四点,许多木霉菌品种被发现与无性型生物一样存在于±壤中,其可作为对植 物有益的真菌[32]。相反地,该有性型的肉座菌品种常被发现于脱皮的木头或腐木真菌上 (如木耳、暗礁菌、或磨茹)。吾人于本研究中所述之SAN有性后代具有对于木质纤维素生物 原料有较好的降解能力,可提供其于自然环境中适应性优势,尤其是于聚落化之早期(生长 时之前两周)。
[0185] 最后,本发明之一重要发现在于将NHEJ基因去除可预防SAN后代恢复成整倍体。于 多种微生物及哺乳动物细胞中之研究显示,SAN及非整倍体已知可于多数正常细胞造成增 生性缺陷。除非经过特定压力,或于一与增强的增生能力有关之情况下(如癌细胞),该SAN 及非整倍体细胞可准备进行RTU[8、25、27-30]。亦发现泛素蛋白酶体降解于抑制SAN及非整 倍体之不良反应中扮演重要角色[33],仍不清楚的是怎样的DAN修复及/或重组机制牵设于 RTU中。吾人结果证明NHEJ修复路径于木霉菌中促进RTU中扮演重要脚色。本研究一个令人 意外的发现为该tmus53 A SAN突变株具可期的工业化潜力,可用于增加的木质纤维素生物 原料降解。
[0186] 序列信息
[0187] 引子A(SEQ ID NO: 1)
[0188] 5' -CTTCCAGCCTAAGTACTC-3'
[0189] 引子B(沈Q ID N0:2)
[0190] 5' -GTCGATCGTGCTAATGAAG-3'
[0191] 引子C(沈Q ID N0:3)
[0192] 5' -CAAGGCTATTATCCGCAG-3'
[0193] 引子D(沈Q ID NO:4)
[0194] 5' -CTCTGAGGGGATTAGAAG-3'
[0195] 藉由引子C及B增幅的片段(SEQ ID N0:5)
[0196] (547bp,对应于支架 33:32892-3:M38bp)
[0197] 引子 C+B [019 引 CAAGGCTATTATCCGCAGTGGGACAATTGTGCTTTGATGTTGGTTCGCTCTACACTGGGTCAAACATGAACAGGCAG TGGAGGGGGGTGTGATGAGAATGAAACCAAGAGCCAACCTGTGGATCAATTTCAACGTGGGGCGATGTGCATGTAGG GACTCCGAAGTGTTTTCGGGACGGAACCGGCCTAAACAAGACCATGTTCGACGGTTTATTAAGCAGGCAAATATCGA CAGGCATGGCGTATGTCAAGACCTAATCAATCATTGTCCTGGTGAGGCCTATACCTGCCGTTGTGGAAAGATACTCG CGATGTATTTTTTTCTTCTGTCTCTGTCATCGATACTTGCCTACTGGATCATCAAGACGGCCGTCTCTTCAAACAAA GATCGACTTTATGCCCGCCGAAAAGCATGTCAACCCTGCGCGCGCCTACCACAAACTGAAAGGGTCATTGGCTATTC TTTGTTCAAGCAAGATGCTACCATTGCACGCCAGGGGAGGTCCTTGCAAACAGCCCAAGACCGCTTCCGTTTGCTCG GTGACACG
[0199] 藉由引子A及D增幅的片段(SEQ ID N0:6)
[0200] (467bp,对应于支架 36:54048-54514bp)
[0201] 引子 A+D
[0202] CTTCCAGCCTAAGTACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAAAGCCAAAC ACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTGATCTATCTCAATAGCGCTCAGTAGGTACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGAC AAACCCTCCTCCACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAACGCTGACTGCACATCAGACG CACTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGTGAGGTACCCGTATCACCCTACTCCAATCGCCTGAGAAGCTTGTATC TTGCTCAACATTCCGGAGCAGCACCTACATGTACTACATGTGAATCGCCCTATATCTCATTCTGACCGGAGAACGAG ACAGCACCCACGTATTCATACCTATTTACTTTCTTCTGTTTTTTACCTCTTCTCGATCTTCTTTTCTTCTAATCCCC TCAGA
[0203]藉由引子A及B增幅的片段(SEQ ID NO:7)
[0204] (462bp,对应于支架 36:54048-54320bp (底线)及支架 33:33250-3:3438bp (双底 线))
[0205] 引子 A+B
[0206] CTTCCAGCCTAAGTACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAAAG CCAAACACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTGATCTATCTCAATAGCGCTCAGTAGGTACGAAGAGTAG GCATCCCTCGAGACAAACCCTCCTCCACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAA CGCTGACTGCACATCAGACGCACTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGTGAGGTACCCGT ATCA AG ACGGCCGTC-rCTTC AAACAA AGATCGACTT'-f'ATGCCCGCCG A AA AGCA T 片rCAACCCTGCGCGCGC乂、TAC 广 ACAAACTGAAAGGGTC.VrTGGCTATTCTTTGT TCAAGCA AGATGCTACCA 下 TGCACGCXAGGGGAGGTCCTTGCAAACAGCCC AAG ACCGCTTCCGTTTGCTCGGTG 八 CACG
[0207] 藉由引子C及D增幅的片段(SEQ ID N0:8)
[0208] (552bp,对应于支架 33:32892-33249bp (底线)及支架 36:54321-54514bp (双底 线))
[0209] 引子 C+D
[0210] CAAGGCTATTATCCGCAGTGGGACAATTGTGCTTTGATGTTGGTTCGCTCTACACTGGGTCAAACATGAAC AGGCAGTGGAGGGGGGTGTGATGAGAATGAAACCAAGAGCCAACCTGTGGATCAATTTCAACGTGGGGCGA TGTGCATGTAGGGACTCCGAAGTGTTTTCGGGACGGAACCGGCCTAAACAAGACCATGTTCGACGGTTTAT TAAGCAGGCAAATATCGACAGGCATGGCGTATGTCAAGACCTAATCAATCATTGTCCTGGTGAGGCCTATACCTGCC GTTGTGGAAAGATACTCGCGATGTATTTTTTTCTTCTGTCTCTGTCATCGATACTTGCCTACTGGATC ATCACCCTACTCCAATCGCCTGAGA AGCTTGT八TCTTGCTC八八 CATTCCGG 八 GC八GC八CCT八C八TGT八CT八 C 八 TGTG八 AT CGCCCTATATCTCATTCTGACCGGAGAACGAGACAGCACCCACGTATTCATACCT ATTTACTTTCTTC TGTn TTTACCTCTTC'TCGATCTTCTTTTCTTCTAATCC CCTC AG A
[0211] DNA探针之核巧酸序列(SEQ ID NO:9)
[0212] AGCTACATGAGATCCTGCATACCGTATCTTTGTCCTGGTAAACTATTGTTTCGTAG TTCAAGAGGACATTCTGAAGGAACACCGAGAGCATTTCTTCCAGCCTAAGTACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAA TGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAAAGCCAAACACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTTTCTTATTTCAATAG CGCTCAGTAGGTACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGACAAACCCTCCTCCACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCA GGTGCACTCTGCACGAA
[0213] 引子PA7543(SEQ ID N0:10)
[0214] AGCTACATGAGATCCTGCAT [0^5]引子A7544(SEQ ID N0:11)
[0216] TCAGGTGCACTCTGCACGAA
[0217] 443bp条带之核巧酸序列(沈Q ID NO: 12)
[021 引 TTAAATCCCACAACTACCTATTACTACATGTACATTTGATCAATTGCAAGCCGTGACCGAGCTACATGAGATCCTGC ATACCGTATCTTTGTCCTGGTAAACTATTGTTTCGTAGTTCAAGAGGACATTCTGAAGGAACACCGAGAGCATTTCT TCCAGCCTAAGTACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAAAGCCAAACAC TGCGGGCTTCCATATGGGAAATTTTCTTATTTCAATAGCGCTCAGTAGGTACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGACAA ACCCTCCTCCACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAACGCTGACCGCACATCAGACGCA CTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGCGAGGTACCCCTATCAAGACGGCCGTCTCT
[0219] I512bp条带之核巧酸序列(SEQ ID N0:13)
[0220] TTAAATCCCACAACTACCTATTACTACATGTACATTTGATCAATTGCAAGCCGTGACCGAGCTACATGAGATCCTGC ATACCGTATCTTTGTCCTGGTAAACTATTGTTTCGTAGTTCAAGAGGACATTCTGAAGGAACACCGAGAGCATTTCT TCCAGCCTAAGTACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAAAGCCAAACAC TGCGGGCTTCCATATGGGAAATTTTCTTATTTCAATAGCGCTCAGTAGGTACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGACAA ACCCTCCTCCACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAACGCTGACCGCACATCAGACGCA CTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGCGAGGTACCCCTATCACCCTACTCCAATCGCCTGAGAAGCTTGTATCTT GCTCAACATTCCGGAGCAGCACCTACATGTACTACATGTGAATCGCCCTATATCTCATTCTGACCGGCGAACGAGAC AGCACCCACCACGTATTCATGCCTATTTACTTTCTTCTGTATTTTACCTCTTCTCGATCTTCTTTTCTTCTAATCCC CTCAGAGCCTCAACAACCTCCACCTCTTTCTGCATCAGCACACGAGTGACATCCTGCATCTTCCACACCATCAGATA CGTTGGTCCTCCTTTTAAGAAAGCTACAAAACTTGTAAGAAATCTTCACTTAAGGTACTGAGAGGTTCTTGTTTCTT TATGCTACAGTCCTTCGAGATAACTGACACATAGTGTTTCATTCAGCATCGCTTCCATTGCGCTCGTTTTCTCGGCT CACCTCAAAGACATCTCAGCCATCTTGGAGGCCAAGAGCAAGATATCAAACAATCTTCTCTTTGAACTGGTGGCAAT GAGCAGCGATAGCTATTGGATTGTTCCTCCTCAACCCCCGGGTGGTGGCACGTGGAAAGGCTGTGCTCTGCTCAAGA AGCCAGATGGAGGAGATTTCGTGCTATTTTCTCCCAATGCCGTGCATCTGAGTGCGATGCTCCAGGTGCATGACGCG CACCAAGCATCTGTCGTCAGTAATGCATCTCAGTCGACCTCACAAGACAATGAGATGACTGAGTTCATGGTAATGGG ACGATGCAGACATTTGTTGGATGGCTATTCGCACACGAACCCTCAAAGCTCATCCGGACAAATGGCAGAGAGCTTGA ACAGGCTACATGCCGATTTGAAAGGAACAAGGTCCCGAGGGCAGAAGTTCATCACTGCAGCATACGTCGGCTTCGAC TCCTGCATGCAGGGTCCTGTCTTTGCCAGGGCGGCTAAAGATGCGGCCAGCTCCAACCCCTCCAAATCGATCGCTTC GAATGAAGCAAATCAGTCAAGAGGGTCAAACGGTATCCTTGACCTGAAGGATCTGAGCTTCAGTTGTGGCTCTGCGT CCTCTTCTGTGGGACTGGGATTCATTCCACATTATGCAGTAACGTCTCG
[0221 ] 参考文献
[0222] I .Ma;rtinez D,Berka RM,Henrissat B,Saloheimo M,Arvas M,et al. (2008)生 质降解真菌木霉菌(Trichoderma reesei (syn.Hypocrea jecorina))的基因定序及分析 Nat Biotechnol 26:553-560.
[0223] 2.Peterson R,Nevalainen H(2012)木霉菌(Trichoderma reesei 抓T-C30)-菌 种的=十年发展 Microbiology 158:58-68.
[0224] 3.ViUkainen !,Arvas !,Pakula T,Oja !,Penttila M,et al. (2010)具有提升 的纤维酶产生性质的木霉菌菌种的数组比较基因杂合分析BMC Genomics 11:441.
[0225] 4.Samuels GJ,Petrini 0,Manguin 8 ( 1 994 )施韦尼兹肉座菌 (Hypocreaschweinitzi)及其木霉属变形真菌的行态学及具分子特性分析.Micologia86: 421-435.
[02%] 5.Seidl V,Seibel C, Kubicek CP, Schmoll 1(2009)工业主力木霉菌 (Trichoderma reesei)的有性生殖化OC Natl Acad Sci U S A 106:13909-13914.
[02巧]e.Cole F,Keeney S,Jasin 1(2010)减数分裂DSB蛋白质的演化转变:不只是 Spoil基因 Genes Dev 24:1201-1207.
[0228] 7.Fraser JA,Huang JC,Pukkila-Worley R,Alspaugh JA,Mitchell TG,et al? (2005) Chromo soma I translocation and segmental duplication in 亲片型隐球菌 (Oyptococcus neoformans)的染色体转位及节段性复制Eukaiyot Cell 4:401-406.
[02巧]8.Ni !,Feretzaki M,Li W'Floyd-Averette A'Mieczkowski P,et al?(2013)单 性及异性减数生殖在酵母菌新型隐球菌(&Tptococcus neoformans)重新产生非整倍体及 表型多样性化OS Biol ll:e100 1653.
[0230] 9.Wittenberg AH,van der Lee TA,Ben M'barek S,Ware SB,Goodwin SB,et al. (2009)减数分裂在单倍体真菌植物病原禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)启 动特殊的基因体可塑性化OS One 4:e5863.
[0231] 10.Goodwin SB'M'Barek S B,Dhillon B,Wittenberg AH,Crane CF,et al? (2011)真菌小麦病原禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)的完成基因体显示分散 体结构(dispensome Struc化re)、染色体可塑性及隐形致病机制化oSGenet 7: e100 2070.
[0232] 11 .Tegtmeier KJ,VanEtten H(1982)红球化赤壳菌(Nectria haematococca)经 选择性状的基因研究72:604-607.
[0233] 12.Taga M,Murata !,VanEtten册(1999)藉由原位杂合的焚光显现丝状子囊菌 属的红球化赤壳菌(Nectria haematococca)中的有条件分散的染色体F^mgal Genet Biol 26:169-177.
[0234] 13.〔〇16111过11]7,民011113167涨,民0虹1容116乙-〔过町63 1,1(110六,啡过3111过1111〇〔,6古过1. (2009)红球化赤壳菌(Nectria haematococca)的基因体:多余的染色体对于基因扩展的贡 献(PLoS Genet 5:e100 0618.
[0235] 14.Schmoll M,SeiLbel C,Tisch D,Dorrer M,Kubicek CP(2010)子囊真菌的新类 型胜版费洛蒙先驱物Mol Microbiol 77:1483-1501 ?
[0236] IS.Chen CL,Kuo HCfl'ung SY,Hsu PW,Wang CL,et al.(2〇l2)蓝光作为调节木霉 菌化ypocrea jecorina(Trichoderma reesei))有性生殖的双面剑化oSOne 7:e44969.
[0237] 16.Guangtao L,Schuster A,Polak S,Schmoll M,et al ? (2009)基因革E 向于非同源性末端接合缺陷的木霉菌化ypocrea jecorina)J Biotechnol 139:146-151.
[0238] 17.Steiger MG,Vitikainen M,Uskonen P,Brunner K,Adam G,et al.(2011)有 利于同源整合及利用可重复使用的双向可选择性标记之木霉菌(Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei))转形系统Appl Environ Microbiol 77:114-121.
[0239] IS.Tisch D,Kubicek CP,Schmoll 1(2011)光导蛋白类似蛋白PhLPl影响木霉菌 (Trichoderma reesei)糖骨水解酶及光反应的调节BMC Genomics 12:613.
[0240] 19.Penttila M,Nevalainen H,Ratto M,Salminen E,Knowles J(1987)分解纤维 素的丝状真菌木霉菌(Trichoderma reesei)可重复使用的转形系统Gene 61:155-164.
[0241] 20.Mantyla AL,Rossi KH,Vanhanen SA,Penttila ME,Suominen PL,et al. (1992)野生型及突变型木霉菌(Trichoderma longibrachiatum(reesei))菌种的电泳核型 分析Curr Genet 21:471-477.
[0242] 21 .Herrera-Estrella A,Gol血an GH,van Montagu !,Geremia RA( 1993)对于木 霉属菌的解析染色体的电泳核型及基因分配Mol Microbiol 7:515-521.
[0243] 22JungMK,0vechkinaY,PrigozMnaN,0akl巧CE,0akl巧BR(2000)使用贝 塔-D-葡聚糖酶取代Novozym 234作为免疫巧光及原生质化的用途化ngal Genet 化wsletter 47:65-66.
[0244] 23丄ieckfel化 E,Kullnig C,Samuels GJ,Kubicek CP(2000)来自南美±壤的木 霉菌化ypocrea Jecorina(^ic)Ioderma reesei))的有性胜任、薦糖及硝酸盐吸收的菌株 Mycologia 92:374-380.
[0245] 24.化Wdnen !,Arvas M,Oja M,Aro N,Penttila M,et al. (2012)在木质纤维基 质存在下木霉菌CA巧基因的重新i全释及转录Microb Cell化。!: 11:134.
[0246] 25.Tang YC,Amon A(2013)基因复制数改变:成本利益分析Cell 152:394-405.
[0247] 26.Gresham D,Desai MMJucker CMJe叫 HT,Pai DA,et al.(2008)在酵母菌对 于受控制的营养限制环境的演化适应谱系及动态化OS Genet 4:e100 0303.
[024引 27.Ni !,Feretzaki M,Sun S,Wang X,Heitman J(2011)真菌的性别Annu Rev Genet 45:405-430.
[0249] 28.化eltzer JM,Amon A(2011)非整倍体谬论:不正确的核型的成本及利益 Trends Genet 27:446-453.
[02加]29.化611〇,8^壯^(1胖0,561(161〔胖,1^11?(2012化3990压力可透过非整倍体诱导 产生快速细胞适应Hsp90stress potentiates rapid cellular adaptation through induction of 曰neuploidy.Nature 482:246-250.
[0巧1] 30.Chang化,Lai肌,Tung SY,Leu JY(2013)动态大规模染色体重组在酵母菌族 群激起快速适应化OS Genet 9:e100 3232.
[0巧2] 31.Ghosh A,Ghosh BK,Trimino-Vazquez H,Eveleigh DE,Montenecourt BS (1984)来自木霉菌(Trichoderma reesei)高纤维素分解突变型Rut-C30的纤维素酶分泌 Arch Microbiol 140:126-133.
[0253] 32.M址herjee PK,Horwitz BA,Herrera-Eshella A,Schmoll !,Kenerley CM (2013)基因体世代的木霉属研究Annu Rev Phytopathol 51:105-129.
[0254] 33.Torres EM,Dephoure N,Panneerselvam A,Tucker CM,怖it1:aker CA,et al. (2010)非整倍体奈授图变的鉴定Cell 143:71-83.
【主权项】
1. 一种用于制备木霉菌节段性非整倍体菌株之方法,包含下列步骤: (a) 辨识及挑选木霉菌第一菌株,其具交配能力,且其基因组中带有支架33及支架M; (b) 辨识及挑选木霉菌第二菌株,其具交配能力,可与步骤(a)之第一菌株交配,且其基 因组中带有支架F及支架X; (c) 有性杂交步骤(a)之第一菌株与步骤(b)之第二菌株;及 (d) 从步骤(c)中辨识及挑选节段性非整倍体(SAN)后代,其基因组中具有D复制片段。2. 如申请专利范围第1项之方法,其中 支架33包含: (0支架33之5'端,约33此(称作1^片段),及 (? )支架33之3'端,约171kb(称作33(3')片段); 支架Μ包含: (i)D片段,包含: 支架28之3'端,长度约37kb(称作28(3')片段), 全长的支架27,长度约427kp,及 支架36之5'端,长度约52kb(称作36(5')片段),以及 (丑)非〇片段,包含: 支架36之3 '端,长度约83kb(称作36(3 ')片段),以及 支架28之5'端,长度约370kb(称作28(5')片段); 支架F包含: (i)D片段及 U)33(3')片段;及 支架X包含: (i)L片段及 (丑)非〇片段。3. 如权利要求1之方法,其中该第一菌株具有MAT1-1基因座,及第二菌株具有MAT1-2基 因座,或该第一菌株具有MAT1-2基因座,及第二菌株具有MAT1-1基因座。4. 如权利要求1之方法,其中步骤(a),该第一菌株藉由聚合酶连锁反应(PCR)分析,以 判断出其基因组中是否存在支架33及支架Μ来辨识。5. 如权利要求4之方法,其中该PCR分析系使用第一引子对,包含SEQ ID Ν0:3之引子C 及SEQ ID Ν0:2之引子Β,以判断支架33于第一菌株之基因组中存在与否,或使用第二引子 对,包含SEQ ID Ν0:1之引子Α及SEQ ID Ν0:4之引子D,以判断支架Μ于第一菌株之基因组中 存在与否。6. 如权利要求1之方法,其中步骤(a),该第二菌株藉由聚合酶连锁反应(PCR)分析,以 判断出其基因组中是否存在支架F及支架X来辨识。7. 如权利要求6之方法,其中该PCR分析系使用第三引子对,包含SEQ ID NO: 1之引子A 及SEQ ID N0:2之引子B,以确认支架F于第二菌株之基因组中存在与否,或使用第四引子 对,包含SEQ ID N0:3之引子C及SEQ ID N0:4之引子D,以确认支架X于第二菌株之基因组中 存在与否。8. 如权利要求1之方法,其中于步骤(d),该SAN后代藉由比较基因组杂交法(CGH)分析, 或南方墨点分析,以判断D复制片段之有无,以辨识之。9. 如权利要求8之方法,其中该南方墨点分析系使用包含SEQ ID N0:9之探针进行。10. 如权利要求1之方法,其中该SAN后代具有一种或多种增强的基因表现,该基因编码 醣类活性酵素(CAZyme)。11. 如权利要求10之方法,其中该编码CAZyme基因系选自由下列所组成之群组:位于支 架27之内源-β-l,4_木聚醣酶基因(xyn2 ; ID: 123818)、位于支架28之β-甘露糖苷酶基因 (10:69245)、位于支架2之€^-阿拉伯呋喃糖酶基因(6!154,10 :55319)、位于支架5之6!171€[-1,3-L-葡聚糖苷酶基因(GH71,ID: 120873)、及位于支架5之β-l,3-L-葡聚糖苷酶基因 (cel3d,GH3,ID:46816)。12. 如权利要求1之方法,其中该SAN后代展现增强的木聚糖酶活性、或于木聚醣为主的 培养基上之增加的生物原料产量。13. 如权利要求1之方法,其中该第一菌株或第二菌株进一步包含非同源性末端接合 (NHEJ)基因缺失。14. 如权利要求13之方法,其中辨识并挑选所得之SAN后代,其系产自第一菌株及第二 菌株之有性杂交,其基因组中具有D复制片段,且NHEJ基因是缺失的。15. 如权利要求13之方法,其中该NHEJ基因为tku70或tmus53。16. 如权利要求13之方法,其中该SAN后代可稳定节段性复制达2周或更久、3周或更久、 4周或更久、5周或更久、6周或更久、或7周或更久。17. -种用于制备稳定木霉菌节段性非整倍体菌株之方法,包含: (a) 将两种具有染色体杂合性之单倍体可交配之木霉菌菌株进行有性杂交,其中该两 个菌株中至少一者包含一 NHEJ基因缺失;及 (b) 从步骤(a)中辨识及挑选出一所得之节段性非整倍体(SAN)后代,其具有NHEJ基因 缺失。18. 如权利要求17之方法,其中该NHEJ基因为tku70或tmus53。19. 如权利要求17之方法,其中如申请专利范围第1项所述之该两种可交配的单倍体菌 株中之一者系带有支架33及支架M,以及另一者系带有支架F及支架X。20. 如权利要求19之方法,其中从步骤(a)所得之SAN后代,经辨识及挑选,具有D复制片 段及NHEJ基因之缺失。21. -种由权利要求17所得之稳定、木霉菌节段性非整倍体菌株。22. -种稳定、木霉菌节段性非整倍体菌株,其之基因组中包含D复制片段及tku70或 tmus53之缺失。
【文档编号】C12R1/885GK105874055SQ201480054997
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年10月1日
【发明人】王廷方
【申请人】中央研究院
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1