用于酮生产的微生物和方法
【专利摘要】本发明提供了重组产乙酸、一氧化碳营养细菌，其缺乏仲醇脱氢酶或包含失活的仲醇脱氢酶。失活的仲醇脱氢酶可由包含失活突变的仲醇脱氢酶基因编码，所述失活突变减少细菌将丙酮转换为异丙醇并且将甲基乙基酮转换为2?丁醇的能力。因为缺乏仲醇脱氢酶或包含失活的仲醇脱氢酶的细菌累积含羰基化合物，所以本发明还提供了生产含羰基化合物例如丙酮和甲基乙基酮的方法。
【专利说明】用于酬生产的微生物和方法
[0001] 与相关申请的交叉参考
[0002] 本专利申请要求于2013年12月3日提交的美国临时专利申请号61 /911，449的利 益，所述美国临时专利申请全文W引用的方式并入本文。
[000；3] 序列表
[0004] 本专利申请包括随同同时提交且如下鉴定的核巧酸/氨基酸序列表:于2014年12 月1日创建，名称为"LT101PCT_ST25. txt"的7，617字节ASCII(文本)文件，所述序列表全文 W引用的方式并入本文。
技术领域
[0005] 本发明设及工业发酵。特别地，它设及使用微生物来生产工业上有用的溶剂例如 酬。
【背景技术】
[0006] 产乙酸、一氧化碳营养细菌例如自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、 扬氏梭菌（Clostridium Ijungd址Iii)和拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)将丙酬转换 为异丙醇，并且将甲基乙基甲酬(MEK)转换为2-下醇。相应地，运些细菌W酬例如丙酬和MEK 为代价产生醇例如异丙醇和2-下醇。
[0007] 然而，酬自身是重要的商业产品。丙酬是工业溶剂W及甲基丙締酸甲醋(MMA)和聚 甲基丙締酸甲醋(PMMA)的前体，所述MMA和PMMA具有约$ 100亿USD/年的合并市场价值。丙酬 还是异下締的前体（van Leeuwen,ApplMicrobiol Biotechnol ,93:1377-1387,2012)。异下 締的市场价值也是显著的，为约$240亿USD/年。MEK是涂料和油墨的重要组分，具有约$20亿 USD/年的全球市场价值，W每年约1.9%增长。MEK还是1，3-下二締的前体，其具有超过$190 亿USD/年的市场价值，W每年约2.7%增长。此外，丙酬是喷气燃料的生产前体(Anbarasan, Na1:ure,491:235-239,2012)。
[000引相应地，存在生产工业上有用的溶剂和合成前体例如丙酬和甲基乙基酬(MEK)的 改良方法的需要。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了重组产乙酸、一氧化碳营养细菌，其缺乏仲醇脱氨酶或包含失活的 仲醇脱氨酶。优选地，细菌是梭菌属(Clostridium)的成员，例如来源于自产乙醇梭菌、扬氏 梭菌或拉氏梭菌的细菌。在一个特定实施例中，细菌来源于在DSMZ登录号DSM23693下保藏 的自产乙醇梭菌。
[0010] 失活的仲醇脱氨酶可来源于具有仲醇脱氨酶或伯-仲醇脱氨酶活性的酶。失活的 仲醇脱氨酶可由包含失活突变的仲醇脱氨酶基因编码。包含失活突变的仲醇脱氨酶基因可 来源于编码具有仲醇脱氨酶或伯-仲醇脱氨酶活性的酶的基因。在一个实施例中，失活的仲 醇脱氨酶来源于SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。在另一个实施例中，包含失活突变的仲醇脱氨 酶基因来源于SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的核酸序列。特别地，失活突变可为插入。
[0011] 细菌还可包括编码一种或多种酶例如硫解酶、CoA-转移酶或乙酷乙酸脱簇酶的外 源基因。此外，细菌可包含编码丙二醇脱水酶的外源基因，所述丙二醇脱水酶将内消旋-2， 3-下二醇转换为MEK，例如产酸克雷伯氏菌化Iebsiella oxtoca)丙二醇脱水酶。
[0012] 失活的仲醇脱氨酶的存在导致酬的累积。相应地，细菌可累积或产生酬，例如丙酬 或 MEK。
[0013] 本发明还提供了通过培养包含失活的仲醇脱氨酶(所述失活的仲醇脱氨酶由包含 失活突变的仲醇脱氨酶基因编码）的细菌，由此该细菌产生丙酬和MEK中的一种或多种，来 生产酬例如丙酬或的方法。该方法还可包括从培养物中回收丙酬或Mffi。
【附图说明】
[0014] 图1是显示自产乙醇梭菌醇脱氨酶对各种底物的动力学的表。
[0015] 图2是显示在仲醇脱氨酶基因上的内含子祀位点（2113、287曰、388曰、40〇3、4333和 552a)和引物结合位点（156F和939R)的基因图。
[0016] 图3A-3C是证实组II内含子插入的凝胶图像。
[0017] 图4是显示通过LZ1561和具有失活的仲醇脱氨酶(287a)的突变型自产乙醇梭菌， 将丙酬转换为异丙醇(或其缺乏)的图表。
[0018] 图5A-5C是显示与具有失活的仲醇脱氨酶(433s、388a)的突变型自产乙醇梭菌的 培养物相比较，经过LZ1561培养物的4天生长，如通过光密度（图5A )、丙酬中的变化（图5B) 和异丙醇中的变化(图5C)测量的生长的图表。
[0019] 图6A和6B是显示当进料到LZ156U具有含CO钢铁厂气体作为底物）的稳定连续培 养物时，丙酬W高浓度和速率完全转换为异丙醇的图表。进料浓度在每个图表下指出。
[0020] 图7是显示在具有失活的仲醇脱氨酶的突变型自产乙醇梭菌的第11-14天发酵时， 乙酸盐(=角形）、乙醇(菱形）和生物质（正方形)浓度的图表。在第11天时将丙酬进料到发 酵罐内，并且在第12天时将进料到发酵罐内。
[0021] 图8是显示通过HPLC检测的丙酬(S角形）和异丙醇(菱形)浓度的图表，W及在稀 释速率1.6时关于丙酬的理论洗脱曲线(虚线）。差异是由于丙酬的气提。
[0022] 图9是显示通过LZ1561和具有失活的仲醇脱氨酶(287a)的突变型自产乙醇梭菌， 将1邸转换为2-下醇(或其缺乏）的图表。
[0023] 图10是显示通过册LC检测的MEK(S角形）和2-下醇(菱形）的图表，W及在稀释速 率1.6时关于1邸的理论洗脱曲线(虚线）。差异是由于1邸的气提。
[0024] 图11是显示在具有失活的仲醇脱氨酶的突变型自产乙醇梭菌的连续发酵中，由CO 生产丙酬的图表。
【具体实施方式】
[0025] 仲醇脱氨酶将含幾基化合物转换为醇。相应地，含有仲醇脱氨酶的细菌能够将含 幾基化合物例如丙酬和MK(分别转换为醇例如异丙醇和2-下醇。本发明提供了重组产乙酸、 一氧化碳营养细菌，其缺乏仲醇脱氨酶或包含失活的仲醇脱氨酶。特别地，失活的仲醇脱氨 酶可由包含失活突变的仲醇脱氨酶基因编码，其中所述失活突变减少细菌将丙酬转换为异 丙醇并且将转换为2-下醇的能力。因为该失活突变导致含幾基化合物的累积，所W本发 明还提供了生产含幾基化合物例如丙酬和1邸的方法。
[0026] 幾基是由与氧原子双键键合的碳原子组成的官能团，例如醒或酬。含幾基化合物 包括例如乙偶姻、丙酬、甲基乙基酬(MffiK即2-下酬)和乙醒。
[0027] 醇是其中径基官能团与饱和碳原子结合的有机化合物。醇包括例如异丙醇和2-下 醇。
[0028] 醇脱氨酶(ADH)是催化醒或酬（例如丙酬）和醇（例如异丙醇）之间的互换的一组 酶。伯醇脱氨酶能够将醒转换为伯醇，或反之亦然，并且仲醇脱氨酶能够将酬转换为仲醇， 或反之亦然。另外，许多醇脱氨酶能够将醒转换为伯醇，或反之亦然，并且将酬转换为仲醇， 或反之亦然。运些醇脱氨酶可被称为伯-仲醇脱氨酶，因为它们证实伯醇脱氨酶和仲醇脱氨 酶两者的活性。如本文使用的，术语"醇脱氨酶"和"仲醇脱氨酶"涵盖仲醇脱氨酶和伯-仲醇 脱氨酶两者。
[0029] 细菌可缺乏仲醇脱氨酶或可遗传改造为不表达仲醇脱氨酶。特别地，细菌可为来 源于缺乏仲醇脱氨酶的自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌(其是已知具有仲醇脱氨酶的 唯一产乙醇细菌物种)的细菌。
[0030] 失活突变是减少、基本上消除或完全消除酶活性的任何突变，所述酶例如仲醇脱 氨酶或伯-仲醇脱氨酶。失活突变可为插入、缺失、置换或无义突变、或者减少或消除酶活性 的任何其他类型的突变。失活突变可使细菌的酶活性减少至少10%、至少20%、至少30%、 至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、或至少99 %。酶 活性可通过减少酶功能或通过减少酶量得到减少或消除。引入失活突变的方法是本领域众 所周知的。例如，失活突变可通过化学诱变、转座子诱变、病毒诱变或体外诱变进行制备。
[0031] 就核酸序列和氨基酸序列而言，术语"衍生的"指亲本或野生型核酸序列或氨基酸 序列的修饰。例如，包含失活突变的仲醇脱氨酶核酸序列或氨基酸序列可分别来源于不含 失活突变的亲本或野生型核酸序列或氨基酸序列。在一个优选实施例中，失活的仲醇脱氨 酶来源于包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的野生型仲醇脱氨酶。编码失活的仲醇脱氨酶的 基因可来源于包含SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列。
[0032] 本发明可使用其序列由本文具体例示的序列改变的核酸进行实践，条件是核酸执 行基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肤的核酸序列，运意指编码的蛋白质或肤执行基 本上相同的功能。对于启动子的核酸序列，变体序列具有促进一种或多种基因表达的能力。 此类核酸可被称为"功能等价变体"。例如，核酸的功能等价变体包括等位基因变体、基因片 段、多态性等等。来自其他微生物的同源基因是本文具体例示的序列的功能等价变体的例 子。运些包括在物种例如自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌或诺维氏梭菌(C.novyi)中的 同源基因，关于其的序列信息可在网站例如GenBank或NCBI公开获得。短语"功能等价变体" 还包括其序列由于特定生物的密码子优化而改变的核酸。核酸的功能等价变体优选与鉴定 的核酸具有至少大约70 %、至少大约80 %、至少大约85 %、至少大约90 %、至少大约95 %或 更大的核酸序列同一性。
[0033] 另外，本发明可使用其序列由本文具体例示的序列改变的酶或蛋白质进行实践， 条件是酶或蛋白质执行基本上相同的功能。运些变体可被称为"功能等价变体"。蛋白质或 肤的功能等价变体包括与鉴定的蛋白质或肤共享至少40%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大的氨基酸同一性的那些蛋 白质或肤。此类变体包括蛋白质或肤的片段，其中所述片段包括截短形式的多肤，其中缺失 可为1至5、至10、至15、至20、至25个氨基酸。缺失可在多肤的任一末端处从残基1延伸到25， 可为在该区域内的任何长度，或可在赋予特异性催化功能和活性或者底物或辅因子结合的 蛋白质的内部位置或特定结构域处。特定酶或蛋白质的功能等价变体还包括由其他细菌物 种中的同源基因表达的多肤，例如如先前段落中例示的。
[0034] 本发明的核酸序列和氨基酸序列可为外源或内源的。在一个实施例中，引入外源 核酸W表达未由微生物天然产生的基因，或过表达由微生物天然产生的基因。另外，外源核 酸可增加基因的拷贝数，引入强启动子或组成型启动子，或引入调节元件。外源核酸可整合 到微生物的基因组内或可W染色体外状态保留。
[0035] 重组核酸、蛋白质或微生物含有已连接在一起的不同个体、不同物种或不同属的 部分。通常，运使用重组DNA技术来完成，使得形成复合核酸。复合核酸可用于制备例如复合 蛋白质。它可用于制备融合蛋白。它可用于转化微生物，所述微生物维持复合核酸且复制复 合核酸，且任选表达蛋白质，任选复合蛋白质。本发明的细菌是重组的，即非野生型的。
[0036] 立体特异性酶差异识别对映体且催化与对映体的不同反应。因此，仅一种对映体 可反应，或每种对映体可获得不同产物。
[0037] "减弱的表达"指相对于在亲本微生物中的表达减少的核酸或蛋白质表达。减弱的 表达还包括指完全不表达核酸或蛋白质的"零"表达。"零"表达可通过本领域技术人员已知 的任何方法来实现，包括RNA沉默、表达过程的修饰(例如启动子功能的破坏）、或者编码酶 的核酸从基因组中的完全或部分去除(敲除）。
[0038] 术语核酸"构建体"或"载体"和类似术语应广义地理解为包括适合于用作将遗传 材料转移到细胞内的媒介物的任何核酸(包括DNA和RNA)。该术语应理解为包括质粒、病毒 (包括细菌隧菌体）、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节元件、复制起 点、多克隆位点和/或可选标记物。构建体或载体可适合于允许表达由构建体或载体编码的 一种或多种基因。核酸构建体或载体包括裸露核酸W及用一种或多种试剂配制W促进对细 胞的递送的核酸(例如脂质体缀合的核酸）。
[0039] 外源核酸可使用本领域已知的任何方法引入细菌。例如，转化(包括转导或转染） 可通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或自然感受态、原生质体转化、原隧菌 体诱导或缀合来实现（参见例如Sambrook,Molecular Cloning = A LaboratoiT Manual, Cold Spring Harbor Lsborstory Press,Cold Spring Harbor,1989)〇
[0040] 电穿孔的使用已对于几种一氧化碳营养产乙酸菌报道，包括扬氏梭菌化opke, PNAS, 107:13087-13092，2010 ;W0/2012/053905)、自产乙醇梭菌(W0/2012/053905)、乙酸梭 菌（C.aceticum) (Schiel-Bengelsdorf,Synthetic Biol, 15:2191-2198,2012)和伍氏乙酸 杆菌(A .woodii KStr射Z,A卵1 Elnviron Microbiol, 60:1033-1037,1994)。电穿孔的使用还 已在梭菌属中报道，包括丙酬下醇梭菌（CloStridium acetobutyl icum) (Mermelstein, Biotechnol, 10 :190-195,1992) W及解纤维素梭菌（C. cel Iulolyticum)(Jennert, Microbiol, 146:3071-3080,2000)。另外，原隧菌体诱导已对于一氧化碳营养产乙酸菌得到 证实，包括粪味梭菌（C.scatologenes)(Pa;rthasarathy,Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775for Generation of Mutants，Masters Project，Western Ken化cky University,2010)，并且缀合已对于许多 梭菌得到描述，包括艰难梭菌（C?difficileKHerbert，FEMSMicrobiolLett，229:103-110,2003) W及丙酬下醇梭菌(Williams J Gen Microbiol ,136:819-826,1990)。类似方法 可用于一氧化碳营养产乙酸菌中。
[0041] 如果某些限制系统在宿主微生物中是活跃的，则可能需要外源核酸的甲基化。
[0042] 穿梭微生物可为其中表达甲基转移酶且不同于目的微生物的微生物。穿梭微生物 可用于将合成后修饰引入遗传改造的核酸，所述合成后修饰保护最终宿主生物中的遗传改 造的核酸。相反，目的微生物是其中表达在表达构建体/载体上包括的基因且不同于穿梭微 生物的微生物。
[0043] 细菌可为任何重组、一氧化碳营养、产乙酸细菌。"重组"指已由野生型或亲本微生 物遗传修饰的微生物。"一氧化碳营养"指可耐受高浓度一氧化碳的微生物，优选细菌。"产 乙酸菌"指天然生成乙酸盐/乙酸作为厌氧发酵产物的微生物，优选细菌。
[0044] 特别地，细菌可属于梭菌属。例如，细菌可为乙酸梭菌、丙酬下醇梭菌、自产乙醇梭 菌、拜氏梭菌（C. bei jerinckii)、下酸梭菌（Clostridium butyricum)、食一氧化碳梭菌 (Clostridium carboxidovirans)、解纤维素梭菌、嗜纤维梭菌（Clostridium cellulovorans)、艰难梭菌、Clostridium diolis、Clostridium drakei、蚁酸乙酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum)、克氏梭菌（Clostridium.kluyveri)、扬氏梭菌、大梭菌 (Clostridium magnum)、诺维氏梭菌、己斯德梭菌（Cl OStr id ium pas ter ianium)、 Clostridium phytofermentans、控氏梭菌、Clostridium saccharbutyricum、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、粪味梭菌、热纤梭菌（Clostridium thermocellum)或由其 衍生的细菌。细菌可为产乙酸、一氧化碳营养菌。在一个优选实施例中，细菌来源于自产乙 醇梭菌、扬氏梭菌或控氏梭菌。细菌可来源于自产乙醇梭菌DSM10061、自产乙醇梭菌 DSM23693(LZ1561，自产乙醇梭菌DSM10061的衍生物）、或扬氏梭菌DSM13528。在一个优选实 施例中，细菌是包含基因的自产乙醇梭菌DSM23693,所述基因编码包含失活突变的仲醇脱 氨酶。
[0045] 还可使用其他细菌。例如，细菌可属于乙酸杆菌属(Acetobacterium)、产碱杆菌属 (Alkaligenes)、芽抱杆菌属（Baci Ilus)、短杆菌属（Brevibac ter ium)、假丝酵母属 (Candida)、棒状杆菌属（Corynebac ter ium)、肠球菌属化n ter O CO ecus)、埃希氏菌属 (Escherichia)、汉逊酵母属（Hansenu la)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、乳杆菌属 (Xactobacillus)、乳球菌属(Xactococcus )、类芽抱杆菌属（Paenibaci Ilus)、毕赤酵母属 (Pichia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、罗尔斯通氏菌属（Ra Istonia)、红球菌属 (Rhodococcus)、酵母属（Saccharo my ces)、沙口 氏菌属（Salmonella)、木霉属 (Trichoderma)或发酵单胞菌属(Zymomonas)D特别地，细菌可为伍氏乙酸杆菌、己氏嗜喊菌 (Alkalibaculum bacchii)、地衣芽抱杆菌（BaciIlus Iicheniformis)、枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis)、Blautia producta、甲基营养下酸杆菌（Butyribacterium me thy Iotrophi cum)、谷氨酸棒状杆菌（Corynebac ter ium g Iutami cum)、大肠杆菌 化scherichia coli)、粘液真杆菌化ubacterium limosum)、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯 氏菌（Klebsiella pneumonia)、植物乳杆菌化actobaciIlus PIantarum)、乳酸乳球菌 (Xactococcus Iactis)、热自养穆尔氏菌（Moorella 化ermautotrophica)、热乙酸穆尔氏 菌（Moorella thermoacetica)、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)、富养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、 球形鼠抱菌（Sporomusa S地aeroides)、凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi)、里氏 木霉（Trichoderma reesei)、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)或由其衍生的细菌。
[0046] 就微生物(例如细菌)而言，术语"衍生的"指亲本或野生型微生物的修饰。包含编 码包含失活突变的仲醇脱氨酶的基因的细菌可来源于包含编码仲醇脱氨酶(所述仲醇脱氨 酶不含失活突变)的基因的亲本或野生型细菌，或者不含编码仲醇脱氨酶的基因的亲本或 野生型细菌。使用本领域已知的任何方法，例如人工或天然选择、突变或遗传重组，细菌可 来源于亲本或野生型细菌。亲本微生物可为运样的生物，其先前已进行修饰，但不表达或过 表达本发明的一种或多种酶(例如LZ1561)。在一个优选实施例中，细菌来源于自产乙醇梭 菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在一个特别优选的实施例中，细菌来源于在DSMZ登录号DSM23693 下保藏的细菌(目化Z1561)。
[0047] 细菌可为分离的。例如，细菌可从其天然环境、包含两种或更多种微生物的培养 物、或包含单一微生物的异质(遗传上不等同）群体的培养物中物理分离。由单一细菌生长 的菌落或培养物也视为分离的。
[0048] 细菌还可进行修饰，W表达或过表达在用于制备含幾基化合物例如醒或酬的生物 合成途径中的一种或多种酶。生物合成途径可为对细菌内源、部分内源或完全外源的。生物 合成途径可包含例如外源酶或者来源于其他物种或属的酶。在一些情况下，外源酶可与内 源酶协同工作，W形成并非天然存在于细菌中的生物合成途径。例如，丙酬生产已在并非天 然生产丙酬的微生物中得到证实(W0/2012/115527)。编码酶例如硫解酶、CoA-转移酶和乙 酷乙酸脱簇酶的基因可加入细菌中，W使细菌能够制备丙酬。另外或可替代地，外源丙二醇 脱水酶可加入细菌中，W使细菌能够将内消旋-2,3-下二醇转换为2-下酬(MEK)。外源丙二 醇脱水酶可来源于产酸克雷伯氏菌。
[0049] 气体发酵是通过其气态底物用作碳源和/或能源用于生产乙醇或其他产物或化学 品的代谢过程。如本文使用的，术语"发酵"涵盖该过程的生长期和产物生物合成期两者。气 体发酵通过微生物通常为细菌来执行。
[0050] 细菌培养物可在对培养物提供足够资源的任何液体营养培养基中生长。液体营养 培养基可含有例如维生素、矿物质和水。合适的液体营养培养基的例子是本领域已知的，包 括适合于乙醇或其他产物发酵的厌氧培养基（参见例如美国专利5,173,429、美国专利5， 593,886和WO 2002/08438)。
[0051] 细菌培养物可包含在反应器(生物反应器）中。反应器可为具有一个或多个容器 和/或塔或管道布置用于生长细菌培养物的任何发酵装置。反应器可为例如固定化细胞反 应器、气举式反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、环管反应器、膜反应器例如中空纤维膜生物反应 器化FM BR)、连续流揽拌蓋式反应器(CSTR)或滴流床反应器(TBR)。反应器优选适合于接受 包含C0、O)2和/或出的气态底物。反应器可包括平行或串联的多重反应器(阶段）。例如，反应 器可包含在其中培养细菌的第一生长反应器和第二发酵反应器，来自生长反应器的发酵液 可进料给所述第二发酵反应器并在其中可产生大多数发酵产物。
[0052] 发酵应期望地在用于含幾基化合物的生产发生的适当发酵条件下进行。应考虑的 反应条件包括压力、溫度、气体流速、液体流速、培养基抑、培养基氧化还原电位、揽动速率 (如果使用连续揽拌蓋式反应器）、接种物水平、确保在液相中的CO不会成为限制性的最大 气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。
[0053] 当与发酵工艺相关使用时，术语"增加效率"、"增加的效率"等等包括但不限于增 加下述中的一种或多种:催化发酵的微生物的生长率、W升高的产物浓度的生长率和/或产 物生产率、产生的所需产物的体积/消耗的底物体积、所需产物的生产率或生产水平、W及 与发酵的其他副产物相比较产生的所需产物的相对比例。
[0054] 气态底物（"气体"或"进料气体"或"发酵气体"或"底物"）可为任何气体，其含有在 发酵中由微生物用作碳源和/或能源的化合物或元素。气态底物通常含有显著比例的出、0)2 和/或CO,并且可另外含有化或其他气体。在一个实施例中，气态底物包含C0。在另一个实施 例中，气态底物包含出、0)2和C0。在一个进一步的实施例中，气态底物不含或基本上不含化。
[0055] 气态底物的确切组成可改变。气态底物可含有例如按体积计约20%至约100%C0、 按体积计约20 %至70 % CO、按体积计约30 %至60 % CO、或按体积计约40 %至55 %C0。特别 地，气态底物可含有按体积计约25 %、约30 %、约35 %、约40 %、约45 %、约50 % CO、约55 % C0、或约60 % C0。气态底物可含有例如按体积计约1 %至80 % C〇2或按体积计约1 %至30 % C〇2。气态底物可含有例如按体积计小于约20 % C〇2、小于约15 % C〇2、小于约10 % C〇2、小于约 5 % C〇2、或约0 % (基本上无)0)2。虽然气态底物无需含有此，但此的存在可导致所需产物生 产的总体效率改善。气态底物可包含例如2:1、1: 1、或1: 2比率的此:C0。气态底物可包含例 如按体积计小于约30 %出、小于约20 %出、小于约15 %出、或小于约10 %出。在其他实施例 中，气态底物可包含低浓度此，例如按体积计小于约5%出、小于约4%此、小于约3%此、小于 约2%出、小于约1 %出、或约0%(基本上无化。
[0056] 此外，通常期望增加底物流的CO浓度(或气态底物中的CO分压），W增加其中CO是 底物的发酵反应的效率。在增加的压力下操作允许从气相到液相的CO转移速率中的显著增 加，在所述液相中它可由微生物吸收。运依次又减少定义为生物反应器中的液体体积除W 输入气体流速的保留时间。最佳反应条件部分地取决于使用的特定微生物。然而，一般而 言，优选在比环境压力更高的压力下执行发酵。此外，因为给定CO转换率部分地是底物保留 时间的函数，并且达到所需保留时间指示生物反应器的所需体积，所W增压系统的使用可 极大减少所需生物反应器的体积，并且因而减少发酵设备的资金成本。根据US 5,593,886 中给出的例子，反应器体积可与反应器操作压力中的增加按线性比例减少。例如，在IOatm 压力下操作的生物反应器仅需要在Iatm压力下操作的那些十分之一的体积。
[0057] 用于给发酵反应进料的气体流的组成可对发酵反应的效率和/或成本具有显著影 响。例如，〇2的存在可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵前或发酵后发酵过程阶段中不需要 或不必要的气体的处理可增加阶段的能量负荷。例如，当气体流在进入生物反应器之前是 压缩的时，能量可用于压缩在发酵中不需要的气体。
[005引气态底物可源自工业过程。特别地，气态底物可为由工业过程生成的废气，所述工 业过程例如铁金属产品制造(例如钢铁制造）、非铁产品制造、石油精炼、煤炭气化、电力生 产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产或焦炭制造。在一个优选实施例中，气态底物来源于钢铁制 造气体。
[0059]气态底物可源自有机物质的气化，所述有机物质例如甲烧、乙烧、丙烷、煤、天然 气、原油、来自炼油厂的低价值残渣(包括石油焦炭或石油焦）、固体城市废物或生物质。生 物质包括在粮食提取和加工期间获得的副产物，例如来自甘薦的糖、或者来自玉蜀泰或谷 物的淀粉、或者通过林业产业生成的非食物生物质废物。运些含碳材料中的任一种可为气 化的，即部分由氧燃烧，W产生合成气体(合成气）。合成气通常主要包含C0、出和/或C〇2,并 且可另外含有甲烧、乙締、乙烧或其他气体的量。气化器的操作条件可进行调整，W提供具 有所需组成的底物流用于发酵，或者与一种或多种其他流渗和W提供最佳组成或期望组成 W得到发酵过程中增加的醇生产率和/或总体碳捕获。
[0060] 在气态底物用于发酵之前，可能期望过滤、擦洗或W其他方式预处理气态底物，W 去除化学或物理杂质或污染物。例如，源气体可经过水或W其他方式过滤，W去除颗粒物 质、长链控或焦油。然而，不一定需要此类过滤或预处理。有时能够对发酵培养物直接提供 未过滤、未经处理的气态底物。
[0061] 尽管气态底物通常W气体的形式提供，但术语"气态底物"还涵盖W替代形式提供 的包含CO、0)2和/或此的底物。例如，含有CO的气态底物可在液体中溶解提供。基本上，液体 可用含CO气体饱和，并且随后加入生物反应器中。示例性方法包括微泡分布发生器 化ensirisak,Appl BiochemBiotechnol ,101:211-227,2002)的使用和气态底物吸附到固 体支持物上。
[0062] 本发明还提供了通过培养包含失活的仲醇脱氨酶(所述失活的仲醇脱氨酶由包含 失活突变的仲醇脱氨酶基因编码）的细菌，由此该细菌产生丙酬和MEK中的一种或多种，来 生产酬例如丙酬或的方法。该方法还可包括从培养物中回收丙酬或Mffi。
[0063] 实例
[0064] 下述实例进一步举例说明本发明，但当然，不应解释为W任何方式限制其范围。 [00化]实例1
[0066] 该实例描述了一般材料和方法。
[0067] 微生物和生长条件
[0068] 自产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生物）W及扬氏梭菌DSM13528 源自DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中屯、（The German Collection Of Microorganisms and Cell Cultures)，InhoffenstraPe 7B,38124Braunschweig，德国）。 拉氏簇基ATCC BAA-622源自ATCC(美国典型培养物中屯、，Manassas,VA 20108,USA)，并且大 肠杆菌D册a源自 Invitrogen(Carlsbad，CA 92008，USA)。
[0069] 大肠杆菌在好氧条件下在37°C下在LB化uria-Bertani)培养基中进行生长，所述 LB培养基含有IOg膜蛋白腺、5g酵母提取物和IOg化C1/1. OL培养基。固体培养基含有1.5 % 琼脂。
[0070] 梭菌属菌株在37°C下在PETC培养基中在pH 5.6下进行生长，使用标准厌氧技术 (Hungate,In=Methods in Microbiology,3B:117-132,1969;Wolfe,Adv Microb F*hysiol, 6:107-146，1971)。果糖（异养生长)或顶空中的30psi含C0钢铁厂气体（由在Glenbrook，NZ 中的化W Zealand Steel场所收集；组成：44%C0、32%化、22%C02、2%出）（自养生长）用作 底物。对于固体培养基，加入1.2 %Bacto琼脂(BD，陆姐kl in Lakes，NJ 07417，USA)。
[0071] 阳TC培养基
[0080] 用自产乙醇梭菌DSM23693的发酵在I.化生物反应器中在37°C下进行，使用含CO钢 铁厂气体作为唯一能源和碳源。制备确定成分的培养基，其含有:MgClXaCl2(0.5mM)、KCl (2mM)、出PCk(SmM) Je(IOOiiM)、Ni、ai(5iiM)、Mn、B、W、Mo、Se(2iiM)。将培养基转移到生物反应 器内且在12rC下高压灭菌45分钟。在高压灭菌后，培养基补充硫胺、泛酸盐(0.05mg/L)、生 物素(0.02mg/L)，且用3mM半脫氨酸-HCl还原。反应器容器通过0.2皿滤器用氮喷射，W达到 厌氧条件。在接种之前，将气体转变为连续进料至反应器的含CO钢铁厂气体。气流最初设为 80ml/分钟，并且在指数中期过程中增加至200ml/分钟，同时揽动从20化pm增加到35化pm。 将化2SWO. 25ml/小时给予生物反应器内。一旦0D600达到0.5,生物反应器就转变为W 1.0ml/分钟速率(稀释速率0.96d-l)的连续模式。获取样品W测量生物质和代谢产物，并且 分析流入和流出气体。
[0081] 代谢产物分析
[0082] 顶空的气体组成在具有两个安装通道的化rian CP-4900mic;ro GC上进行测量。通 道1是在70°(：、2001^^氣和4.23的回洗时间下运行的101111〇1筛分柱，而通道2是在90°(：、 150k化氮和无回洗下运行的IOm PPQ柱。关于两个通道的进样器溫度为70°C。运行时间设为 120s，但所有目的峰通常在IOOs前洗脱。
[0083] 使用配备在35°C下操作的RID(折射率接触器)和保持在60°C下的Alltech IOA-2000有机酸柱（150x 6.5mm，粒度扣m)的Agilent IlOOSeries HPLC系统，执行代谢终产物 的HPLC分析。略微酸化的水(0.005M此S〇4)用作移动相，具有0.7ml/分钟的流速。为了去除 蛋白质和其他细胞残渣，将400iil样品与10化1 2%(w/v)5-横基水杨酸混合，并且W14, OOOx g离屯、3分钟，W分离沉淀的残渣。随后将IOiil上清液注入HPLC内用于分析。
[0084] 使用配备Supelco PDMS 100 Icm纤维、Alltech EC-1000(30m xO. 25mm X 0.25y m)柱和火焰离子化接触器(FID)的Agilent 6890N顶空GC，执行代谢终产物的GC分析。将5ml 样品转移到化ngate管内，在水浴中加热至40°C，并且暴露于纤维正好5分钟。进样器保持在 250°C下。氮用作载气并且维持在Iml/分钟的恒定流速下。烘箱在40°C下运行5分钟，随后为 10°C/分钟增加直到200°C。溫度随后还W50°c/分钟的速率增加至220°C，随后在该溫度下 保持5分钟。随后，溫度W50°C/分钟的速率下降至40°C，随后在该溫度下保持1分钟。FID保 持在250°C下，具有40ml/分钟氨、450ml/分钟空气和15ml/分钟氮作为补充载气。
[0085] 实例2
[0086] 该实例证实在自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌中，负责将丙酬还原为异丙醇 和将还原为2-下醇的仲醇脱氨酶的鉴定。
[0087] 丙酬至异丙醇的转换已在一氧化碳营养菌中得到描述，所述一氧化碳营养菌例如 自产乙醇梭菌(WO 2012/115527)、扬氏梭菌(WO 2012/115527)和拉氏梭菌(WO 2012/ 115527)(Ramachan化iya,Biotechnol Bioeng,108:2330-2338,2011)。还鉴定了与来自拜 氏梭菌的酶（Ismaiel，J Bacteriol ,175:5097-5105,1993)具有相似性的仲醇脱氨酶(ADH; EC 1.1.1.2)(W0 2012/115527)。
[008引自产乙醇梭菌包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的仲醇脱氨酶，由SEQ ID NO:2 的核酸序列编码。扬氏梭菌包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的仲醇脱氨酶(NCBI YP_ 003780646.1)，由扬氏梭菌基因组内的仲醇脱氨酶基因的核酸序列编码（NCBI NC_ 014328.1:2755565. .2756620，GeneID9446102,基因座标签化JU-C24860)。拉氏梭菌包含具 有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的仲醇脱氨酶，由SEQ ID N0:3的核酸序列编码。
[0089] 为了证实该仲醇脱氨酶负责丙酬至异丙醇的转换，使自产乙醇梭菌的仲醇脱氨酶 在大肠杆菌中过度产生，并且测量它的活性。SEQ ID N0:2由如WO 2012/115527中所述分离 的自产乙醇梭菌的基因组DNA扩增，经由KpnI和HindIII克隆到pBAD载体（Invitrogen)内， 并且使用如Sambrook中所述的标准方法，通过电穿孔转化到大肠杆菌内。ADH基因的序列通 过DNA测序加 W证实。经转化的细胞在IOOmL具有氨节青霉素的LB中在37°C下生长，直至达 至IjO. 8的0D600。在运时，加入ImL 20 %阿拉伯糖，并且对于表达的剩余部分，使培养物在28 °C下溫育。使细胞形成团块，并且倾析上清液。随后将团块重悬浮于肥阳S缓冲液(50mM化-肥阳S和0.2mM DTT，P册.0)中，并且加入各0.化L邸NZ0NAW?(Merck，25单位/化）和溶菌酶 (Merck，30kUAiL)。随后使用固定化金属亲和层析，经由融合的N末端化s6标签来纯化仲醇 脱氨酶。在冰上的30分钟溫育后，细胞通过超声处理进行裂解，使不溶性碎片形成团块，并 且使用0.2微米滤器使上清液澄清。将澄清的上清液加入TALON?树脂(Clontech)中，所述 TALON?树脂已用裂解缓冲液充分洗涂。500化的柱床体积用于纯化，并且允许蛋白质与 TALON?树脂在4 °C下结合一小时，并且随后用裂解缓冲液洗涂几次。使用补充有150mM咪挫 的裂解缓冲液从柱中洗脱蛋白质，并且将洗脱物W5(K)化级分收集。通过纯化过程获取的等 分试样W及洗脱级分在SDS PAGE凝胶上运行，W证实蛋白质的存在且测定纯化的成功。使 用AMIC0N?Ultra-4Cent;ri化gal Filter Units(Millipore)，将蛋白质交换到胆存缓冲液 (50mM憐酸钟、150mM化Cl、10%v/v甘油，pH 7.0)内。当在大肠杆菌中表达时，蛋白质是高 度可溶的且可容易地纯化。活性测定在使用石英比色杯的紫外/可见光分光光度计中进行， 使用Wo. 2mM浓度的NADPH作为辅因子，并且使用3mM M邸作为底物。测定混合物含有50mM 化is-HCl缓冲液(pH7.5)与ImM DTT。自产乙醇梭菌的仲醇脱氨酶显示用于将丙酬还原为异 丙醇的活性。此外，发现用于将还原为2-下醇，将乙偶姻还原为2,3-下二醇，W及将乙醒 还原为乙醇的活性。最高活性对于丙酬发现，随后为MEK(图1)。
[0090] 除仲醇脱氨酶之外，对异丙醇具有活性的两种下醇脱氨酶(抓H)已得到描述(Tan, J Basic Microbiol ,54:996-1004,2013)。运些下醇脱氨酶也存在于自产乙醇梭菌和拉氏 梭菌中。
[0091] 实例3
[0092] 该实例证实在自产乙醇梭菌中仲醇脱氨酶的失活。
[0093] 所鉴定的自产乙醇梭菌的仲醇脱氨酶(SEQ ID NO: 2)使用Clos化on系统化eap，J Microbiol Meth,70:452-464,2007)进行失活。在CloslYon网站上的内含子设计工具用于 设计344bp祀向区域(SEQ ID N0:4)，W及鉴定在有义链和反义链上的六个祀位点（图2)。祀 向区域在含有逆转录转座活化的ermB标记物(RAM)的载体PMTL007C-E2中进行化学合成。
[0094] 如WO 2012/053905中所述，将载体引入自产乙醇梭菌中。在具有15iig/ml甲讽霉素 的PETC MES上生长的单一菌落在具有扣g/ml克拉霉素的PETC MES上进行划线培养。随机挑 选来自每种祀的菌落，并且使用侧翼引物155F(SEQ ID N0:5)和939R(SEQ ID N0:6)筛选插 入。使用iN化onMaxime PCR预混合物执行扩增。783bp的PCR产物指示LZ1561基因型，而大约 2.6化的产物大小提示组II内含子在祀位点中的插入（图3)。质粒的丧失通过PCR使用引物 (AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT,沈Q ID N0:8)用于扩增抗性标记物（catP)，W及革兰氏阳 性复制起点(PCB102)。
[0095] 相同策略和质粒也可应用于扬氏梭菌或拉氏梭菌。转化方案先前已得到描述(WO 2012/053905)(Leang,Appl Environ Microbiol,79:1102-1109,2013)〇
[0096] 实例4
[0097] 该实例证实在具有失活的仲醇脱氨酶的自产乙醇梭菌中丙酬还原为异丙醇的消 除。
[0098] 将丙酬(0、1、5和20g/L)进料至（1化Z1561和(2)ClosTron突变型自产乙醇梭菌(具 有含有在位置287a和211s处的突变的失活仲醇脱氨酶)的血清瓶培养物。LZ1561菌株将Ig/ L丙酬完全转换成异丙醇，使得通过HPLC检测到0.65g/L异丙醇，且未检测到丙酬。进料20g/ L丙酬的血清瓶中的异丙醇的终浓度为8. Ig/L异丙醇，其中剩下9.25g/L丙酬。在Clos化on 仲醇脱氨酶突变体的任一中未观察到丙酬至异丙醇的可检测转换（图4)。在进料量和测量 量之间的差异是由于将丙酬准确加入增压血清瓶的困难。
[0099] 在另外的实验中，将16g/L丙酬进料到在阳TC MES中的LZ1561SecADH: :erm 433s、 LZ1561SecADH: :erm 388a和LZ1561的血清瓶培养物。培养物在钢铁厂气体顶空下在37°C下 生长。在生长4天后，LZ1561已将大约一半丙酬转换成异丙醇。在secADH Clos化on突变体中 未检测到异丙醇（图5)。
[0100] 因此，虽然LZ1561菌株非常有效地将丙酬还原为异丙醇，但突变株不能将丙酬还 原为异丙醇。尽管存在两种下醇脱氨酶(其在丙酬至异丙醇的还原中明显不起作用），仍观 察到该结果。
[0101] 还执行设及生物反应器中的连续培养的实验。LZ1561如上所述在生物反应器中生 长。一旦处于具有稳定生物质和代谢产物生产的连续模式中，就将丙酬加入生物反应器和 进料培养基两者中。将丙酬渗料到反应器内至一定水平，其随后通过连续进料获得。最初加 入Ig/L丙酬。一旦代谢产物浓度稳定，浓度就增加至5g/L、15g/L，并且在第二实验中，至 20g/L。即使在15-20g/L的高浓度下，培养物也W高速率将所有丙酬转换为异丙醇，证实所 鉴定的仲醇脱氨酶是高度有效的（图6)(wo 2012/0252083)。
[0102] 类似生物反应器实验用Clos化on突变体执行，所述Clos化on突变体具有含有在位 置211s处的突变的失活的仲醇脱氨酶。将5g/L丙酬渗料到生物反应器内。与在其中观察到 丙酬至异丙醇的几乎立即转换的LZ156U图6)不同，在Clos化on突变体中未观察到丙酬的 转换(图7和图8)。因此，丙酬至异丙醇的转换在Clos Tron突变体中完全被消除。
[0103] 实例5
[0104] 该实例证实无丙酬还原的来自1,2-丙二醇的丙酬生产。
[0105] 先前已证实自产乙醇梭菌含有运样的基因，当将丙-1,2-二醇加入培养基时，所述 基因赋予将丙-1,2-二醇立体特异性脱水为丙醒和丙酬的能力。在LZ156中，丙醒和丙酬被 还原为丙-1-醇和丙-2-醇。丙酬通过仲醇脱氨酶还原。当丙-1,2-二醇加入用Clos化on突变 体(具有失活的仲醇脱氨酶)接种的培养基中时，所产生的丙酬未还原为丙-2-醇。
[0106] 将丙-1,2-二醇加入血清瓶中的PETC-MES培养基中至66mM。瓶用自产乙醇梭菌或 LZ1561进行接种，所述自产乙醇梭菌具有ClOsTron失活的仲醇脱氨酶（SecADH: :e;rmB 287a)。在生长96小时后，LZ1561产生16.0± 1.6mM丙-2-醇和8.1 ± 1.8mM丙-1-醇，而失活的 sADH菌株产生5.7 ± 1.5mM丙酬、6.0 ± 1. SmM丙-1-醇和无法检测的丙-2-醇。
[0107] 实例6
[0108] 该实例证实在具有失活的仲醇脱氨酶基因的自产乙醇梭菌中由CO生产丙酬。
[0109] 具有丙酬合成基因包括编码硫解酶、CoA-转移酶和乙酷乙酸脱簇酶的基因的质粒 已得到设计，并且在自产乙醇梭菌中引入，导致异丙醇生产，仅伴随很少的丙酬或无丙酬 (WO 2012/0252083)。当此类质粒在具有失活的仲醇脱氨酶的自产乙醇梭菌的Clos化on突 变体中引入时，产生丙酬，而不产生异丙醇。培养物在6孔板中W6mL/孔的体积在厌氧培养 罐内在W25psi的C0/H2气体上生长。在生长4天后，培养物产生平均0.95±0.01g/L丙酬、 5.64 ± 0.1 Ig/L乙醇和3.58 ± 1.3g/L乙酸盐。由于丙酬在37 °C下的挥发性，实验用两个另外 的6孔板重复，所述6孔板具有培养基，但不含丙酬生产细菌。丙酬生产培养物在4天内产生 平均0.92 ± 0.04g/L丙酬。此外，本底板产生平均0.5 ± 0.02g/L丙酬，其已经由气相丙酬转 移。考虑到丙酬的转移，最终调整的生产为1.9g/L丙酬。
[0110] 丙酬生产还在生物反应器中的连续培养物中得到证实，使用与上文描述相同的菌 株和方法。经过20天时期，在发酵液中始终观察到大约0.2g/L丙酬（图11，其中"总丙酬"指 培养基中的丙酬(通过HPLC观察到)加上计算为通过经过发酵罐的气体从培养基中去除的 丙酬）。生物反应器用1.5的稀释速率运行，获得发酵液中大约0.4g/L/d的生产率。除发酵液 中的浓度之外，用逸出气体剥离相当量的丙酬(超过发酵液中浓度的30%)，如在流出气体 的冷却分离罐中测定的。考虑到丙酬的挥发性和通过系统的气体流动，丙酬的剥离提供了 理想、低成本的产物分离，从而提供超过异丙醇的优点，所述异丙醇不是挥发性的，并且大 多数需要例如通过蒸馈从发酵液中提取。丙酬的剥离还提供了用于产物合成的驱动力，从 而避免终产物抑制。
[0111] 实例7
[0112] 该实例证实1邸至2-下醇还原的消除。
[0113] 将MEK(0、1、5和20g/L)进料至（1化Z1561和（2)ClosTron突变型自产乙醇梭菌（具 有含有在位置287a和211s处的突变的失活的仲醇脱氨酶）的血清瓶培养物。LZ1561将1和 5g/L MEK分别完全转换成0.94和4.34g/L2-下醇，其中未剩下可检测的MEK。进料20g/L MEK 的血清瓶中的2-下醇的终浓度为6.3g/L 2-下醇，其中剩下17.3g/L MEK。在Clos化on仲醇 脱氨酶突变体的任一中未观察到1邸至2-下醇的转换(图9)。
[0114] 为了进一步验证使在位置211s处失活的仲醇脱氨酶基因失活完全消除自产乙醇 梭菌将MEK转换成2-下醇的能力，将lOg/L MEK渗料到具有仲醇脱氨酶失活菌株生长的生物 反应器内。未观察到MEK的转换(图7，图10)。
[0115] 实例8
[0116] 该实例描述在具有失活的仲醇脱氨酶基因的自产乙醇梭菌中来自2,3-下二醇的 MEK生产。
[0117] 已证实在自产乙醇梭菌中表达来自产酸克雷伯氏菌的丙二醇脱水酶允许将外源 内消旋-2,3-下二醇转换为2-下酬。所产生的2-下酬通过自产乙醇梭菌中存在的仲醇脱氨 酶还原为2-下醇。
[0118] 使用确定的方法，用表达来自产酸克雷伯氏菌的二醇脱水酶的pMTL83155-pddABC 转化具有失活的仲醇脱氨酶的自产乙醇梭菌的ClosTron突变体。所得的菌株在外源内消 旋-2,3-下二醇的存在下在血清瓶中自养生长。转换为2-下酬的下二醇未还原为2-下醇。
[0119] 本文引用的所有参考文献包括出版物、专利申请和专利在此W引用的方式并入， 其程度与每个参考文献个别且特别指出W引用的方式并入且在本文中全文阐述相同。本说 明书中对任何现有技术的提及不是，也不应被视为承认现有技术在任何国家构成努力领域 中的公知常识的一部分。
[0120] 在描述本发明的上下文中（尤其是在下述权利要求的上下文中），术语"一个"和 "一种"和"该/所述"W及类似指示物的使用应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有 说明或上下文明显矛盾。术语"包含"、"具有"、"包括"和"含有"应解释为开放式术语(即，意 指"包括但不限于"），除非另有说明。本文值范围的叙述仅预期充当个别提及落入该范围内 的每个分开值的速记方法，除非本文另有说明，并且每个分开值并入说明书内，如同它在本 文中个别叙述一样。本文描述的所有方法均可W任何合适的次序执行，除非本文另有说明 或上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有例子或示例性语言（如"例如"）的使用仅预期更 好地举例说明本发明，并且不对本发明的范围造成限制，除非另有说明。说明书中的语言不 应解释为指示任何未请求保护的元件作为本发明实践必需的。
[0121] 本发明的优选实施例在本文中描述，包括本发明人已知用于进行本发明的最佳方 式。在阅读前述说明书后，运些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员可W变得显而 易见。本发明人预期技术人员在适当时采用此类变化，并且本发明人预期本发明W与如本 文具体描述外的其他方式进行实践。相应地，本发明包括如由可应用法律许可的与之附着 的权利要求中所述的主题的所有修饰和等价物。此外，在其所有可能变化中的上述元件的 任何组合由本发明涵盖，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。
【主权项】
1. 一种重组产乙酸、一氧化碳营养细菌，其缺乏仲醇脱氢酶或包含失活的仲醇脱氢酶。2. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌是梭菌属的成员。3. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌来源于选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉 氏梭菌的细菌。4. 根据权利要求3所述的细菌，其中所述自产乙醇梭菌是在DSMZ登录号DSM23693下保 藏的自产乙醇梭菌。5. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述失活的仲醇脱氢酶是失活的伯-仲醇脱氢酶。6. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述失活的仲醇脱氢酶来源于包含SEQ ID NO: 1的 氨基酸序列的仲醇脱氢酶。7. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述失活的仲醇脱氢酶由包含失活突变的仲醇脱 氢酶基因编码。8. 根据权利要求7所述的细菌，其中包含失活突变的所述仲醇脱氢酶基因来源于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列。9. 根据权利要求7所述的细菌，其中所述失活突变是插入。10. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌还包含编码硫解酶、CoA-转移酶和乙酰 乙酸脱羧酶中的一种或多种的外源基因。11. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌还包含编码丙二醇脱水酶的外源基因， 所述丙二醇脱水酶将内消旋-2，3-丁二醇转换为MEK。12. 根据权利要求11所述的细菌，其中所述丙二醇脱水酶是产酸克雷伯氏菌丙二醇脱 水酶。13. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌产生丙酮和MEK中的一种或多种。14. 一种生产丙酮的方法，所述方法包括培养根据权利要求1所述的细菌，由此所述细 菌产生丙酮。15. 根据权利要求14所述的方法，其还包括从培养物中回收所述丙酮。16. -种生产MEK的方法，所述方法包括培养根据权利要求1所述的细菌，由此所述细菌 产生MEK。17. 根据权利要求16所述的方法，其还包括从培养物中回收所述MEK。
【文档编号】C12P7/62GK105874057SQ201480072228
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年12月3日
【发明人】A·P·穆勒, M·科普克, B·艾尔-辛那维, R·O·延森, R·E·希尔
【申请人】朗泽科技新西兰有限公司