多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法
【专利摘要】本发明提供一种可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细胞增殖能力的多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。本发明提供：多肽组合物，其包含规定的多肽，所述规定的多肽包含来源于人玻连蛋白或玻连蛋白的规定的第1区域的氨基酸序列，且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下；多能干细胞的培养方法，其包含在该多肽组合物的存在下培养多能干细胞的阶段；培养器，其具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细胞培养表面上的多肽组合物所包含的多肽。
【专利说明】
多化组合物及使用其的多能干细胞的培养方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种多肤组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] W损伤组织的功能恢复等为目的开发了各种再生医疗。其中，报告了大量关于W 组织本身的再生等为最终目的的灵长类尤其人类的全能或多能干细胞的技术。尤其，诱导 型多能干细胞QPS细胞)与胚胎干细胞不同是从体细胞诱导，因此具有伦理方面的问题少 的优点。
[0003] 在培养运些灵长类的全能或多能干细胞(对运两者进行统称，本发明中简称为"多 能干细胞"。）的情况下，要求在未分化状态下经长期维持多能干细胞。为了长期培养未分化 状态的多能干细胞，通常使用小鼠成纤维细胞等饲养细胞。
[0004] 然而，指出因使用如小鼠成纤维细胞的来源于异种动物的饲养细胞，培养液中可 能混入来源于异种动物的抗原性物质等的异物。在将全能或多能干细胞用于医疗用途或与 此相当的用途的情况下，要求将运些细胞在不存在饲养细胞的条件下进行培养。
[0005] 鉴于运种情况，进行了代替饲养细胞功能的细胞粘附性材料的开发。例如化ture Biotechnology ,2001，Voll9，pp. 971-974中公开了作为饲养细胞的代替物使用小鼠肉瘤提 取成分即基质胶，始终良好地对维持了未分化状态的人胚胎干细胞进行培养。
[0006] 日本专利公开2001-17183号公报中公开有不含饲养细胞且含有增殖的灵长类原 始细胞的细胞性组合物，作为优选方式公开有还含有细胞外基质的细胞性组合物。并且，日 本专利公开2010-29186号公报中公开有W含有规定浓度的细胞外基质蛋白质及水性溶剂 的涂布溶液，涂布已进行等离子体聚合的细胞培养表面的细胞培养基质，并且记载有根据 该细胞培养基质具有有助于避免胚胎干细胞的分化的良好的粘附性。
[0007] Biomaterials,2010,Nov;Vol .31(32),卵.8281-8288及化ture Biotechnology, 2010，Vol. 28 ,No.6，pp.606-610中分别公开有由可有助于胚胎干细胞的长期培养的玻连蛋 白部分序列构成的重组肤或合成肤，具体而言，天然玻连蛋白的氨基酸序列中的第1个至第 52个的氨基酸序列的多肤（参考Biomaterials,2010，Nov;Vol.31 (32)，pp.8281-8288)及包 含RGD序列的第41个至第52个的氨基酸序列（参考化ture Biotechnology，2010，Vol. 28， No . 6，PP. 606-610)的多肤。已知由于运些多肤为非生物体试料，因此能够避免混入抗原性 物质等的混入的可能性，且可进行工业生产运一点上优异。
【发明内容】
[000引发明要解决的技术课题
[0009]然而，若考虑将多能干细胞用于再生医疗等的医疗用途或与此相当的用途，则应 尽量排除W来源于小鼠等的成纤维细胞等的异种饲养细胞或来源于小鼠的基质胶为首的 来源于异种动物的成分的使用。并且，即使是来源于同种动物的细胞或成分，也不能完全排 除混入抗原性物质等的可能性。而且，即使是同种及异种中任一种，来源于生物体的材料其 提取量极为微量，或根据给予体其性能有所偏差等，从工业上的观点考虑也不优选。近年， W医疗用途中的应用为目标，盛行没有混入来源于异种动物的成分或抗原性物质的化学上 认可的条件下对干细胞进行培养的研究。然而，未发现能够代替显示足W实用的细胞培养 性能的饲养细胞的材料。
[0010] 例如，作为避免使用来源于生物体的材料本身的方法，Biomaterials ,2010 ,Nov; Vol .31(32),卵.8281-8288及Na1:ure Biotechnology,2010,Vol .28,No.6,PP.606-610中公 开有使用由人玻连蛋白的部分序列构成的重组肤或合成肤来实施胚胎干细胞的长期培养 的例。
[0011] 然而，即使是运些重组肤，作为多能干细胞的细胞培养性能还不够充分。
[0012] 本发明能够提供一种可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细胞增殖 能力的多肤组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。
[0013] 用于解决技术课题的手段
[0014] 本发明为如下所述。
[0015] [1]一种多肤组合物，其包含选自由W下多肤(a)~（C)构成的组中的至少一种： (a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肤；（b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同 源性为80% W上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤;及山)具有序列号1中 缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤，多肤 (a)~(C)为包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域的多肤：（1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个~第44个氨基酸残基构成的氨基酸序列；（1-ii) 由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸序列构成且具有 对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列；及（1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代 或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序 列，且选自由多肤(a)~（C)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半脫氨酸残基 而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为组合物所包含的多肤的总质量的20质 量％^下。
[0016] [2]-种多肤组合物，其包含由40个~450个氨基酸残基构成的多肤(d)，多肤(d) 为包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由W下(2-i)~(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域的多肤：（1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中 由第1个~第44个氨基酸残基构成的氨基酸序列；（1-ii)由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨 基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的 氨基酸序列;及(1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序 列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，（2 - i )由 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRG服RGRNQN(序列号3)表示的氨基酸序列；（2-ii)与由序列号3表 示的氨基酸序列具有80% W上的同源性且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨 基酸序列;及(2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸且 具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列，且多肤(d)且通过第1区域所包含 的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为组合物所包含的多肤 的总质量的20质量％ W下。
[0017] [3]根据[1]或[2]所记载的多肤组合物，其中，通过多肤中的任一位置的半脫氨酸 残基而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为组合物所包含的多肤的总质量的 20质量下。
[0018] [4]根据[1]~[3]中任一项所述的多肤组合物，其中，组合物中的多肤(a)~(C)或 (d)包含如下至少一种多肤，即包含于第1区域且在由序列号1表示的氨基酸序列中相当于 第25个氨基酸残基的半脫氨酸残基及相当于第31个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间进行 分子内交联的多肤。
[0019] [5]根据[1]~[3]中任一项所述的多肤组合物，其中，组合物中的多肤(a)~(C)或 (d)包含如下多肤，所述多肤包含于第1区域且分别在由序列号1表示的氨基酸序列中，相当 于第5个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间、相当 于第19个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间、相 当于第25个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间、 及相当于第32个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半脫氨酸残基 之间进行分子内交联。
[0020] [6]根据[1]~[3]中任一项所述的多肤组合物，其中，组合物所包含的多肤与纤溶 酶原激活物抑制剂-1 (Plasminogen activator inhibitor-l)的结合常数大于0.06。
[0021] [7]根据[1]~[6]中任一项所述的多肤组合物，其中，作为组合物中的多肤(a)~ (C)或(d)包含如下至少一种多肤，所述多肤还包含由下述(3a-i)~(3a-iii)中的任一个氨 基酸序列构成的第3区域：（3a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第56个~第341个氨基 酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；（3a-ii)与（3a-i)的氨基酸序列或其部分 氨基酸序列具有80% W上的同源性的氨基酸序列;及(3a-iii)相对(3a-i)的氨基酸序列或 其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列。
[0022] [引根据[1]~[7]中任一项所述的多肤组合物，其中，作为组合物中的多肤(a)~ (C)或(d)包含如下至少一种多肤，所述多肤还包含由下述(4a-i)~(4a-iii)中的任一个氨 基酸序列构成的第4区域：（4a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第374个~第459个氨 基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；（4a-ii)与(4a-i)的氨基酸序列或其部 分氨基酸序列具有80% W上的同源性的氨基酸序列;及(4a-iii)相对(4a-i)的氨基酸序列 或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列。
[0023] [9]一种多肤组合物，其包含选自由W下多肤(a)~（C)构成的组中的至少一种： (a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肤；（b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同 源性为80% W上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤;及山)具有序列号1中 缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤，通过 多肤中所包含的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为组合物 所包含的多肤的总质量的20质量％ W下。
[0024] [10]-种多能干细胞的培养方法，其包含在[1]~[9]中任一项所述的多肤组合物 的存在下培养多能干细胞的阶段。
[0025] [ 11 ]-种培养器，其具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细胞培养 表面上的[1]~[9]中任一项所述的多肤组合物所包含的多肤。
[0026] 发明效果
[0027] 根据本发明，能够提供一种可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细胞 增殖能力的多肤组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。
【附图说明】
[0028] 图1是表示本发明的参考例中各多肤的培养板表面的吸附试验结果的曲线图。
[0029] 图2是表示本发明的参考例中使用各多肤的细胞的增殖曲线的曲线图。
[0030] 图3是在本发明的参考例中各多肤上进行培养时的iPS细胞菌落的形态图像（左 栏)及放大图像(右栏）。
[0031] 图4是本发明的参考例中各多肤上进行培养时的iPS细胞的DAPI染色图像(左栏） 及NANOG染色图像(右栏）。
[0032] 图5是本发明的实施例所设及的多肤组合物I-U泳道(B))与1-2(泳道(A))的SDS-PAGE的凝胶图像。
[0033] 图6是表示本发明的实施例所设及的多肤组合物中的多肤与PAI-I的结合关系的 曲线图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明的多肤组合物，包含选自由W下多肤(a)~(C)构成的组中的至少一种：
[0035] (a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肤；
[0036] (b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸序列且具 有多能干细胞的培养性能的多肤;及
[0037] (C)具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干 细胞的培养性能的多肤，
[0038] 多肤(a)~(C)为包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区 域的多肤：
[0039] (1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个~第44个氨基酸残基构成的氨基酸 序列；
[0040] (1-ii)由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸 序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列;及
[0041] (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构 成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，且
[0042] 选自由多肤(a)~(C)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半脫氨酸残 基而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为组合物所包含的多肤的总质量的20 质量下。
[0043] 并且，本发明的其他多肤组合物包含由40个~450个氨基酸残基构成的多肤(d)， 多肤(d)为包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由W下(2-i)~(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域的多肤：
[0044] (1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个~第44个氨基酸残基构成的氨基酸 序列；
[0045] (1-ii)由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸 序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列;及
[0046] (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加 I或数个氨基酸的氨基酸序列构 成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，
[0047] (2-i)由PRPSLAKKQRF畑RN服GYRSQRG服RGRNQN(序列号3)表示的氨基酸序列；
[0048] (2-ii)与由序列号3表示的氨基酸序列具有80% W上的同源性且具有对支撑体的 细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列;及
[0049] (2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸且具 有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列，且
[0050] 多肤(d)且通过第1区域所包含的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W 上的多聚体多肤为组合物所包含的多肤的总质量的20质量％ W下。
[0051] 本发明人等为了开发能够增殖多能干细胞的重组蛋白质不断进行深入研究发现， 通过在如下多肤组合物的存在下培养多能干细胞，能够提高多能干细胞的增殖能力，所述 多肤组合物不是W通过人玻连蛋白N末端侧的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体 W上的多聚体的形态，而是W没有分子之间交联的单体的形态，大量包含含有规定的人玻 连蛋白N末端侧的部分序列且具备具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列的多 肤。本发明是基于运个研究结果而完成的。
[0052] W下，对本发明的实施方式进行详细的说明。
[0053] 本发明的多肤组合物为如下的组合物，包含选自由上述的多肤(a)~(C)构成的组 中的至少一种，且选自由多肤(a)~（C)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半 脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为组合物所包含的多肤的总 质量的20质量％ ^下。本多肤组合物能够提高多能干细胞的增殖能力。
[0054] 并且，本发明的其他多肤组合物为如下的组合物，包含上述的多肤(d)，且多肤(d) 且通过第1区域所包含的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为 组合物所包含的多肤的总质量的20质量％^下。本多肤组合物能够维持未分化状态并提高 多能干细胞的增殖能力。
[0055] 在本说明书中"工序"运一用语，不只是独立的工序，即使无法与其他工序明显地 区别的情况下也能够实现本工序所期望的目的，则也包含在本用语中。
[0056] 并且，在本说明书中用"~"来表示的数值范围表示分别将"~"的前后所记载的数 值作为最小值及最大值来包含的范围。
[0057] 并且，在本说明书中，对于组合物中的各成分的量，在存在多个相当于组合物中各 成分的物质时，若无特别说明，表示组合物中存在的该多个物质的总量。
[0058] 在本说明书中，"同种"是指人，"异种"是指除人W外的动物。
[0059] 本说明书中，有时将氨基酸序列中的氨基酸残基W本技术领域中周知的单字母标 记(例如，将甘氨酸残基标记为"G")或S字母标记(例如，将甘氨酸残基标记为"Gly")来进 行标记。
[0060] 本发明中，对于与多肤的氨基酸序列有关的"％"，若无特别说明，W氨基酸(或亚 氨基酸)残基的个数为基准。
[0061] 在本说明书中，对于氨基酸序列的特定氨基酸残基所使用的"对应的氨基酸残基" 等的表述是指将进行对比的两个W上氨基酸序列，W本技术领域中周知的方法，在插入、缺 失及取代考虑在内的基础上，W相等的氨基酸残基达到最多的方式进行排列(对齐)时，与 成为基准的氨基酸序列中的特定氨基酸残基的位置一致的其他氨基酸序列中的氨基酸残 基。
[0062] 有关本说明书中的氨基酸序列的"同源性"可W是指使用BLAST软件包（参考 Ausubel等，1999Sho;rt Protocolsin Molecular Biology，4thEd-Qiapter 18)计算的值。 例如，相对序列号1的同源性为80% W上是指BLAST中的Max. Identities的值为80W上。
[0063] 在本说明书中，氨基酸序列中对于"缺失、取代或附加氨基酸的氨基酸序列"的表 述并不排除缺失、取代及附加的氨基酸序列所包含的氨基酸的两个W上组合。
[0064] < 多肤 >
[0065] 本发明所设及的多肤(a)~(C)为如下所述：
[0066] (a)具有由序列号1表不的氨基酸序列的多肤；
[0067] (b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸序列且具 有多能干细胞的培养性能的多肤;及
[0068] (C)具有序列号1中缺失、取代或附加 1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干 细胞的培养性能的多肤。
[0069] 序列号1:
[0070] D犯SCKGRCTEGFNVD邸CQC呢LCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTM阳DEYTVY孤GEEKNNATV肥QVGGP 化TSDLQAQSKGNPEQTPVLKP邸EAPAPEVGASK阳GIDSRPETLHPGRPQPPAE邸LCSGKP抑AFTDLKNGSLF AFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLI畑VWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRF邸GVLDPDYPRNISDGraGI PDNVDAALALPA服YSGRERVYFFKGKQYWEYQFQ册PS犯ECEGS化SAV阳HFAMMQ畑SWEDI巧LLFWGRTSA GTRQPQFIS畑W服VPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRF畑RN服GYRSQRG服RGRNQNSRRPSRATWLSL FS沈ESNLGANNY孤YRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
[0071] 在此，多肤中"具有多能干细胞的培养性能"是指具有多能干细胞的增殖活性。可 通过如下进行对于是否具有增殖活性的评价，例如在吸附多肤的细胞培养表面上接种多能 干细胞使其细胞密度达到250cells/孔，并培养8天后用PBS清洗方式除去非粘附细胞时，粘 附细胞是否存在2500cells/孔(接种细胞数的10倍)W上。
[0072] 在此粘附细胞数可通过对多能干细胞所表现的碱性憐酸酶的活性进行定量的方 法或MlT试验等来进行定量。
[0073] 由序列号1表示的全长459氨基酸残基构成的多肤为玻连蛋白，在本发明中，玻连 蛋白是指人玻连蛋白。另外，确认了天然的玻连蛋白为序列的一部分中具有糖链的糖蛋白 质。
[0074] 多肤(b)优选为具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为90% W上的氨基 酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤，更优选为具有与由序列号1表示的氨基酸序 列的同源性为95% W上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤。
[0075] 多肤(C)优选为具有序列号1中缺失、取代或附加 1个~5个氨基酸的氨基酸序列且 具有多能干细胞的培养性能的多肤。
[0076] 本发明所设及的多肤优选为(al)由序列号1表示的氨基酸序列构成的多肤、（bl) 由与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸序列构成且具有多能干细 胞的培养性能的多肤、或（Cl)由序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列 构成且具有多能干细胞的培养性能的多肤。
[0077] 在此，（bl)的多肤优选为由与序列号1所表示的氨基酸序列的同源性为90% W上 的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肤，更优选为由与序列号1所表示的 氨基酸序列的同源性为95% W上的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肤。
[0078] 并且，（Cl)的多肤优选为由序列号1中缺失、取代或附加1或数个优选1个~5个氨 基酸的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肤。
[0079] 多肤(a)~（C)包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区 域。
[0080] (1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个~第44个氨基酸残基构成的氨基酸 序列；
[0081] (1-ii)由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80% W上的氨基酸 序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列;及
[0082] (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构 成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列。
[0083] 由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个~第44个氨基酸残基构成的多肤部位是 作为人玻连蛋白的生长素介质B(SMB)域而所知的域。已知SMB域与纤溶酶原激活物抑制剂-I(PAI-I)相互作用。并且，SMB域中含有相当于玻连蛋白的氨基酸序列中第25个~第31个运 7个氨基酸残基的由CSYYQSC(序列号2)表示的氨基酸序列、及相当于玻连蛋白的氨基酸序 列中第45个~第47个运3个氨基酸残基的细胞粘附性基序的RGD序列两者。多肤(a)~k)中 的第1区域可具有选自由序列号2表示的氨基酸序列及RGD序列构成的组中的任一种，从细 胞粘附性及细胞增殖性的观点考虑，多肤(a)~(C)中的第1区域优选包含运些序列的两者。
[0084] 即，（1-i)~（1-iii)的第1区域为位于天然玻连蛋白的较N末端侧的序列，并发挥 与未分化多能干细胞的粘附性，其结果，可推测能够增殖多能干细胞。因此，包含第1区域的 多肤与不包含第1区域的多肤相比，细胞粘附性优异，细胞增殖能力更优异。
[0085] 本发明中的多肤(a)~(C)中包含规定氨基酸序列的第1区域具有优异的细胞粘附 性。因此本发明中的多肤能够良好地增殖细胞尤其是多能干细胞。具有运种氨基酸序列的 本发明所设及的(a)~(C)的多肤能够经长期增殖多能干细胞。
[0086] 多肤具有％多能干细胞的细胞粘附能力"是指多能干细胞对多肤显示附着性。可 通过已知的评价方法来评价多能干细胞对多肤是否显示附着性。例如，可在由多肤包覆的 培养表面接种多能干细胞并在24小时后，用憐酸缓冲液(PBS)等轻轻擦拭，并根据擦拭后培 养表面上残留的多能干细胞的量进行评价。
[0087] 由（1-ii)表示的氨基酸序列优选为由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的 同源性为90% W上的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列， 更优选为由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的同源性为95% W上的氨基酸序列构 成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列。
[0088] 由（1-iii)表示的氨基酸序列优选为由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1个 ~5个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列。
[0089] 序列号1表示的氨基酸序列中第1个~第44个氨基酸残基中，作为第5个氨基酸残 基、第9个氨基酸残基、第19个氨基酸残基、第21个氨基酸残基、第25个氨基酸残基、第31个 氨基酸残基、第32个氨基酸残基及第39个氨基酸残基包含有半脫氨酸残基。多肤(a)~（C) 可W不包含相当于运些8个半脫氨酸残基的半脫氨酸残基，或可包含至少一个。半脫氨酸残 基由于在生理条件下具有与其他半脫氨酸残基容易交联的倾向，因此当多肤(a)~(C)包含 半脫氨酸残基时，多肤中其他部位的半脫氨酸残基彼此之间可产生分子内交联。
[0090] 从促进并提高多能干细胞的增殖的观点考虑，多肤(a)~（C)优选包含序列号1中 示出的氨基酸序列中上述的8个半脫氨酸残基中的两个W上，尤其优选第1区域所包含的两 个W上的半脫氨酸残基相互分子内交联。
[0091] 从促进并提高多能干细胞的增殖的观点考虑，可形成分子内交联的半脫氨酸残基 的组合优选为相当于第5个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半脫 氨酸残基、相当于第19个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半脫氨 酸残基、相当于第25个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半脫氨酸 残基、及相当于第32个氨基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半脫氨酸 残基的组合。多肤(a)~(d)优选包含可形成分子内交联的半脫氨酸残基的四个优选组合中 的任一个，更优选包含所有运种四个组合。另外，本说明书中，有时将特定的半脫氨酸残基 W与表示序列号1中示出的氨基酸序列位置的数字的组合来表示，例如，当为序列号1中示 出的氨基酸序列中相当于第25个氨基酸残基的半脫氨酸残基时，表示为"Cys25"。
[0092] 第1区域的氨基酸残基数从多能干细胞的细胞粘附性及增殖性的观点考虑，可设 定为3~60氨基酸残基数，优选为10~55氨基酸残基数。
[0093] 多肤(a)~（C)所包含的氨基酸残基数(氨基酸长度）只要在400~550的范围内则 并无特别限制，从具有对人玻连蛋白的高相同性的方面考虑，优选为450~520,更优选为 450~459。
[0094] 本发明所设及的多肤(d)为如下所述。
[00M]包含由上述（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由W下（2-i)~(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域，且由40个~450个氨基酸残基构成的 多肤：
[0096] (2-i)由PRPSLAKKQRF畑RN服GYRSQRG服RGRNQN(序列号3)表示的氨基酸序列；
[0097] (2-ii)与由序列号3表示的氨基酸序列具有80% W上的同源性且具有对支撑体的 细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列;及
[0098] (2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸残基 且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列。
[0099] 多肤(d)为了具有多能干细胞的培养性能，具备"对多能干细胞的细胞粘附性"及 "对支撑体的细胞培养表面的吸附能力"，因此优选。在此，支撑体是指使用本发明的培养方 法进行细胞培养时，具有赋予本发明所设及的多肤的面的培养器的部位。
[0100] 目P，由上述（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域具有优异的细 胞粘附性，由此能够良好地增殖细胞尤其是多能干细胞。包含运种氨基酸序列的多肤(d)能 够在维持未分化状态的同时经长期增殖多能干细胞。
[0101] 并且，由上述(2-i)~（2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域有助于对支 撑体的细胞培养表面的吸附性。包含运种氨基酸序列的多肤(d)显示对支撑体的细胞培养 表面的良好的粘附性。多肤(d)通过同时包含第1区域及第2区域，培养期间内不会从支撑体 的细胞培养表面剥离而能够在维持未分化状态的同时经长期增殖多能干细胞。并且，多肤 (d)能够抑制从支撑体的细胞培养表面的剥离并增殖培养中未分化状态的多能干细胞，且 能够提高培养操作时的操作性。
[0102] 其结果，多肤(d)能够促进多能干细胞在未分化状态下的增殖，并且无需基于化学 键的对支撑体的细胞培养表面的固定处理而获得可在工业上生产的多肤。
[0103] 并且，多肤(d)与天然人玻连蛋白相比在排除抗原性物质、感染症源的混入风险的 同时能够保持与天然玻连蛋白同等的性能，即对多能干细胞的粘附性、细胞增殖性及未分 化维持性。
[0104] 在此，关于多肤"在未分化状态下能够增殖多能干细胞"是指多能干细胞在培养期 间维持分化能力。对于多能干细胞是否处于未分化状态，可通过已知的评价方法来进行评 价。例如，通过分子标记物的表达(SSEA-4及/或Oct-4等基于流式细胞仪的表达测定、Oct-4 及/或NANOG等免疫染色等）、体外实验时的多能分化的确认及基于对免疫缺陷小鼠等的移 植的崎胎瘤形成的确认等本领域技术人员已知的方法来进行。对于是否进行增殖可通过常 规方法，利用使用了各种显微镜W肉眼进行观察或ALP活性等的反应试验、流式细胞仪等的 方法或通过其他方法来进行评价。并且，作为本发明中的维持多能干细胞分化能力的培养 期间，根据培养条件及多能干细胞的细胞状态而有所不同，例如可设定为1个月的培养期 间。
[0105] 多肤(d)中的第1区域与多肤(a)~(C)中的第1区域含义相同。对于与多肤(d)中的 第1区域有关的事项，直接适用有关多肤(a)~(C)所记载的事项。
[0106] 第2区域包含由序列号3表示的32个氨基酸残基构成的氨基酸序列，从多肤(d)的 精制容易性的观点考虑，优选多肤(d)中的第2区域为由序列号3表示的氨基酸序列构成的 多肤。由序列号3表示的氨基酸序列包含于位于天然玻连蛋白的C末端侧的血红素结合蛋白 样结构域II的一部分中，且相当于由序列号1表示的氨基酸序列的第342个~第373个氨基 酸残基构成的肝素结合域。W下，有时将由序列号3表示的氨基酸序列称为肝素结合域。
[0107] 多肤(d)具有肝素结合域，由此可推测具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力。 其结果，通过使用多肤(d)，能够维持未分化状态而经长期培养未分化多能干细胞。
[0108] 并且，多肤(d)包含肝素结合域，由此具有确保多肤(d)的亲水性并抑制多肤的疏 水凝集的倾向。其结果，多肤(d)的精制变得容易，并能够提高制造效率。
[0109] 在此，"具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力"是指氨基酸序列不会对成为对 象的培养器的细胞培养表面（W下，有时简称为"培养表面"）产生化学反应而是进行物理性 的吸附。可通过如下进行是否对支撑体的细胞培养表面具有吸附能力的评价，例如，已进行 等离子体处理的聚苯乙締制培养器中添加含有该多肤的溶液使其达到20化mol/cm 2并在37 °C下放置2个小时后，用憐酸缓冲液清洗两次时，残留于培养皿表面的该多肤是否存在 IOpmol/cm2 W上。
[0110] 在此，残留于培养皿表面的多肤的量可通过对与识别多肤的抗体的结合量进行定 量的ElLISA化nzyme-Linked Immunosorbent Assay)法或水解吸附的多肤并将生成的氨基 酸通过HPLC等进行定量来测定。
[0111] 并且肝素结合域可W是与由序列号3表示的氨基酸序列具有80% W上、优选90% W上、更优选95% W上的同源性，并且在未分化状态下能够增殖多能干细胞，且具有对支撑 体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列。
[0112] 并且进而肝素结合域可W是由相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附 加 1个或数个、优选1个~5个氨基酸残基的氨基酸序列构成且具有对支撑体的细胞培养表 面的吸附能力的氨基酸序列。
[0113] 多肤(d)只要具有第1区域及第2区域即可，其相对位置并无特别限制。多肤(d)中 优选第1区域位于第2区域的N末端侧。
[0114] 具有第1区域及第2区域的多肤(d)由40个~450个氨基酸残基构成。通过设定为40 个氨基酸残基W上，细胞粘附性或细胞增殖性或对支撑体的细胞培养表面的吸附能力优 异，另一方面，通过设定为450个氨基酸残基W下，更能发挥细胞粘附性或细胞增殖性及对 支撑体的细胞培养表面的吸附能力，而且能够抑制蛋白质之间的缔合、交联或凝集的形成。 多肤(d)从难W引起凝集的形成等的观点考虑，优选为80个W上，更优选为90个W上，进一 步优选为100个W上，另一方面，优选为400个W下，更优选为250个W下，进一步优选为170 个W下，更进一步优选为150个W下。对于它们的上限值或下限值可任意组合，例如，优选由 40个~400个氨基酸残基构成，更优选由80个~250个氨基酸残基构成，进一步优选由80个 ~150个氨基酸残基构成，更进一步优选由100个~150个氨基酸残基构成。
[0115] 从防止疏水凝集的观点考虑，优选多肤(a)~（d)具有-2.0~-0.95的GRAVY值。 GRAVY 值化J. ,Doolittle R.F. (1982)，J.Mol.Biol ,157:105-132)表示多肤的疏水度 的总平均。表示GRAVY的值越大疏水度越高。若GRAVY值为-0.95 W下，则具有能够容易抑制 疏水凝集发生的倾向。另一方面，若为-2. OW上，则具有对支撑体的细胞培养表面的吸附及 未分化细胞的增殖变得容易，且随着GRAVY值变大吸附性及细胞增殖性提高的倾向。从兼顾 抑制凝集形成与吸附性或细胞增殖性的方面考虑，作为多肤的GRAVY值，更优选-1.70~-0.975,进一步优选-1.60~-1.10。由于氨基酸残基数越少越有凝集的倾向，因此当为氨基 酸残基数为80~170个的多肤时，从兼顾抑制凝集形成与吸附性或细胞增殖性的方面考虑， GRAVY值优选为-1.70~-0.975，进一步优选为-1.60~-1.10。
[0116] 01?4￥￥值可通过增减序列中的例如疏水性氨基酸（例如，1'巧^7'、？116、1^611、116、 化1或Met)比例或增减氨基酸残基数等来进行调整。
[0117] 多肤(a)~(d)优选还具有上述的氨基酸序列W外的其他氨基酸序列。从适当发挥 细胞粘附性及对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的观点考虑，多肤(a)~(d)优选包含由 序列号1表示的氨基酸序列即人玻连蛋白的氨基酸序列的部分序列。由此，多肤(a)~(d)能 够获得接近人玻连蛋白的性质例如对多能干细胞优异的粘附性及增殖性。
[0118] 作为可包含于多肤(a)~(d)中的人玻连蛋白的部分氨基酸序列，从多肤(a)~(d) 的细胞粘附性及细胞增殖性或对支撑体的细胞培养表面的吸附能力或抑制凝集形成的观 点考虑，优选包含选自由W下第3区域及第4区域构成的组中的至少一个：
[0119] (3)由下述氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列选自由序列号1表示的氨 基酸序列中由第56个~第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列及其部分氨基酸序列，及
[0120] (4)由下述氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列选自由序列号1表示的氨 基酸序列中由第374个~第459个氨基酸残基构成的氨基酸序列及其部分氨基酸序列。
[0121] 作为第3区域，从制作多肤时具有抑制疏水凝集的倾向的观点考虑，可选择(3a)由 序列号1表示的氨基酸序列中由第56个~第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分 氨基酸序列，可选择(3b)由第269个~第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基 酸序列，可选择(3c)由第274个~第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序 列，或可选择(3d)由第294个~第个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序 列。（3a)~（3d)的氨基酸序列中，具有减少氨基酸残基数而能够减轻疏水凝集的倾向。其 中，由于具有能够更可靠地抑制疏水凝集的倾向，因此优选选择(3d)的氨基酸序列。
[0122] 在此，多肤(a)~(d)优选还包含由下述(3a-i)~(3a-iii)中的任一个氨基酸序列 构成的第3区域的多肤。
[0123] (3a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第56个~第341个氨基酸残基构成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0124] (3a-ii)与（3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上、优选90% W 上、更优选95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0125] (3a-iii)相对(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加 1或数 个、优选1个~5个氨基酸的氨基酸序列。
[01%] 并且，多肤(a)~(d)优选还包含由下述(3b-i)~(3b-iii)中的任一个氨基酸序列 构成的第3区域的多肤。
[0127] (3b-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第269个~第341个氨基酸残基构成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[01%] (3b-ii)与（3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上、优选90% W 上、更优选95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0129] (3b-iii)相对(3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加 1或数 个、优选1个~5个氨基酸的氨基酸序列。
[0130] 第4区域从对培养皿的吸附性的观点考虑，可设定为由第374个~第459个氨基酸 残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，可设定为由第374个~第409个氨基酸残基构 成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，或可设定为由第374个~第379个氨基酸残基构成的 氨基酸序列或其部分氨基酸序列。
[0131] 其中，除了对培养皿的吸附性W外，从制作多肤时易于抑制疏水凝集的方面考虑， 优选第374个~第379个，通过减少所选择的氨基酸数具有减轻疏水凝集的倾向。
[0132] 在此，多肤(a)~(d)优选还包含由下述(4a-i)~(4a-i i i)中的任一个氨基酸序列 构成的第4区域的多肤。
[0133] (4a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第374个~第459个氨基酸残基构成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0134] (4a-ii)与(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上、优选90% W 上、更优选95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0135] (4a-iii)相对(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数 个、优选1个~5个氨基酸的氨基酸序列。
[0136] 并且，优选还包含由下述(4b-i)~(4b-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第4区 域的多肤。
[0137] (4b-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第374个~第409个氨基酸残基构成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0138] (4b-ii)与（4b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上优选90% W 上、更优选95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0139] (4b-iii)相对(4b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数 个、优选1个~5个氨基酸的氨基酸序列。
[0140] 多肤(a)~(d)进一步优选还包含由下述(4c-i)~（4c-iii)中的任一个氨基酸序 列构成的第4区域的多肤。
[0141] (4c-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第374个~第379个氨基酸残基构成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0142] (如-1〇与所述（4(3-〇的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80%^上、优选 90% W上、更优选95% W上的同源性的氨基酸序列、及
[0143] (4c-iii)相对(4c-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数 个、优选1个~5个氨基酸的氨基酸序列。
[0144] 构成第3区域及第4区域的氨基酸序列的部分氨基酸序列是指在规定范围的氨基 酸残基中由连续的3个W上氨基酸残基构成的氨基酸序列。运些部分氨基酸序列的氨基酸 残基数可在不超过上述的多肤(d)的总氨基酸残基数的范围内选择。
[0145] 多肤(a)~(d)通过包含第3区域，具有有利于提高与培养皿的吸附性的倾向。通过 包含第4区域，多肤(a)~(d)具有进一步有利于提高与培养皿的吸附性的倾向。多肤(a)~ (d)可只具有第3及第4区域中的任一个，也可具有两者。
[0146] 并且，多肤(a)~(d)的GRAVY值从调整容易性的观点考虑，优选通过构成第3及第4 区域的氨基酸序列中的氨基酸残基数的增减、氨基酸残基的缺失、取代或附加等来调整，尤 其，更优选调整构成第3区域的氨基酸序列的长度。
[0147] 多肤(a)~(d)可W不包含序列号1中示出的氨基酸序列中第56个~第131个中包 含的氨基酸残基，也可W不包含第56个~第268个中包含的氨基酸残基，也可W不包含第 269个~第273个中包含的氨基酸残基，或也可W不包含第50个~第293个中包含的氨基酸 残基。可推测由运些氨基酸残基构成的氨基酸序列对多肤(a)~(d)的多能性细胞培养的性 能没有帮助，从与培养皿的吸附的观点考虑可选择适当的序列。
[0148] 当第3区域包含与由序列号1表示的序列的半脫氨酸残基对应的氨基酸残基时，在 该半脫氨酸残基的位置可具有半脫氨酸残基W外的氨基酸残基。由此，能够防止由半脫氨 酸残基引起的分子内或分子之间交联的形成，因此优选。作为取代半脫氨酸残基的其他氨 基酸残基，并无特别限制，可优选列举丝氨酸残基、丙氨酸残基或甘氨酸残基。其中，从具有 与半脫氨酸类似的结构的方面考虑，优选丝氨酸残基或丙氨酸残基。
[0149] 并且，多肤(a)~(d)，在不损坏细胞粘附性及对支撑体的细胞培养表面的吸附性 的范围内，可具有上述W外的其他附加的任意氨基酸残基。作为由运种其他任意氨基酸残 基构成的序列，例如可举出为了通过重组技术容易地制作多肤(a)~（d)而附加的附加序 列。作为运种附加序列，可列举N末端侧的蛋氨酸残基、N末端侧的GPLG序列、标签序列(例如 谷脫甘肤S-转移酶(GST )、化AG标签、Hi S标签等）、各区域之间可附加的连接序列（例如， GGGS、GGGGS、GGGGGS等)等。
[0150] 多肤(a)~（d)可通过本领域技术人员已知的氨基酸合成技术或基因重组技术来 制造。
[0151] 当通过基因重组技术获得多肤(a)~(d)时，具体而言，首先取得对成为对象的氨 基酸序列进行编码的基因，并将其组装到表达载体中，W制作重组表达载体，并将其导入于 适当的宿主中W制作转化体。通过在适当的培养基中培养所得到的转化体，能够生成作为 目标的多肤，因此通过常规方法从培养物回收作为目标的多肤，由此能够获得多肤(a)~ (d)。
[0152] 多肤(a)~k)或(d)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖能 力等观点考虑，优选为由80个~450个氨基酸残基构成的多肤(A)，其包含：
[0153] (1)由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸 序列的第1个~第47个氨基酸残基构成；
[0154] (2)由下述氨基酸序列构成的第2区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸 序列的第342个~第373个氨基酸残基(序列号3,肝素结合域)构成；W及选自由W下第3区 域及第4区域构成的组中的至少一个：
[0155] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第269个~第341个氨基酸残基构成;及
[0156] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第374个~第459个氨基酸残基构成。
[0157] 并且，多肤(a)~（C)或(d)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的 增殖能力等的观点考虑，优选为由100个~450个氨基酸残基构成的多肤(B)，其包含：
[0158] (1)由下述氨基酸序列(包含由序列号2表示的氨基酸序列与RGD序列）构成的第1 区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第1个~第44个氨基酸残基构成；
[0159] (2)由下述氨基酸序列构成的第2区域(肝素结合域），所述氨基酸序列由序列号3 表示的氨基酸序列的第342个~第373个氨基酸残基构成；W及选自由W下第3区域及第4区 域构成的组中的至少一个：
[0160] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第269个~第341个氨基酸残基构成;及
[0161] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第374个~第459个氨基酸残基构成。
[0162] 多肤(a)~（C)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖能力等 的观点考虑，优选为由400个~550个氨基酸残基构成的多肤(A)，其包含：
[0163] (1)由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸 序列的第1个~第47个氨基酸残基构成；
[0164] (2)由下述氨基酸序列构成的第2区域(序列号3,肝素结合域），所述氨基酸序列由 序列号1表示的氨基酸序列的第342个~第373个氨基酸残基构成；W及选自由W下第3区域 及第4区域构成的组中的至少一个：
[0165] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第269个~第341个氨基酸残基构成;及
[0166] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第374个~第459个氨基酸残基构成。
[0167] 并且，多肤(a)~(C)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖能 力等的观点考虑，优选为由400个~550个氨基酸残基构成的多肤(B)，其包含：
[0168] (1)由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸 序列的第1个~第55个氨基酸残基构成；
[0169] (2)由下述氨基酸序列构成的第2区域(序列号3,肝素结合域），所述氨基酸序列由 序列号1表示的氨基酸序列的第342个~第373个氨基酸残基构成；W及选自由W下第3区域 及第4区域构成的组中的至少一个：
[0170] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第269个~第341个氨基酸残基构成;及
[0171] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序 列号1表示的氨基酸序列的第374个~第459个氨基酸残基构成。
[0172] 并且，上述多肤(A)或(B)进一步优选GRAVY值为-2.0~-0.95的多肤。
[0173] 并且，作为多肤(d)的上述多肤(A)优选氨基酸残基数为80个~250个。
[0174] 而且，作为多肤(d)的上述多肤(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-2.0~-0.95且氨 基酸残基数为80个~250个的多肤。
[01巧]进而，作为多肤(d)的上述多肤(A)，进一步优选GRAVY值为-1.70~-0.975且氨基 酸残基数为80个~250个的多肤。
[0176] 并且，作为多肤(d)的上述多肤(A)或(B)优选氨基酸残基数为100个~250个。
[0177] 而且，作为多肤(d)的上述多肤(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-2.0~-0.95且氨 基酸残基数为100个~250个的多肤。
[017引进而，作为多肤(d)的上述多肤(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-1.70~-0.975且 氨基酸残基数为100个~250个的多肤。
[01巧]进而，作为多肤(d)的上述多肤(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-1.70~-0.975且 氨基酸残基数为100个~170个的多肤。
[0180] W下列举多肤(a)~(C)或(d)的一例，但本发明并不限定于运些。
[0181] [表 1]
[0182]
[0183] 作为本发明所设及的多肤(a)~(C)或(d)的优选例可列举：
[0184] (dl)具有由序列号4~序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸 序列的多肤；
[0185] (d2)具有与由序列号4~序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基 酸序列的同源性为80% W上、优选90% W上、更优选95% W上的氨基酸序列且具有多能干 细胞的培养性能的多肤;或
[0186] (d3)具有序列号4~序列号23，序列号38及序列号39中的任一个表不的氨基酸序 列中缺失、取代或附加1或数个、优选1个~5个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培 养性能的多肤，
[0187] 作为更优选例可列举：
[0188] (d4)由序列号4~序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列 构成的多肤；
[0189] (d5)由与序列号4~序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序 列的同源性为80% W上、优选90% W上、更优选95% W上的氨基酸序列构成且具有多能干 细胞的培养性能的多肤;或
[0190] (d6)由序列号4~序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列 中缺失、取代或附加1或数个、优选1个~5个氨基酸的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的 培养性能的多肤。
[0191] 另外，在本说明书中，有时将多肤(a)、多肤化）、多肤(C)及多肤(d)统称为"特定多 肤"。即，"特定多肤"是指多肤(a)~(d)中的任一个或两个W上。
[0192] <多肤组合物>
[0193] 多肤组合物包含选自由上述多肤(a)~k)构成的组中的至少一种，且选自由多肤 (a)~k)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半脫氨酸残基而进行分子之间交 联的二聚体W上的多聚体多肤为多肤组合物所包含的多肤的总质量的20质量％ ^下。并 且，在多肤组合物为包含上述多肤(d)的组合物的情况下，多肤(d)且通过第1区域所包含的 半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体多肤为多肤组合物所包含的多 肤的总质量的20质量％ ^下。多肤组合物在各自的多肤组合物中可包含选自由多肤(a)~ (C)构成的组中的至少一种及多肤(d)两者，在运种情况下，选自由多肤(a)~（d)构成的组 中的至少一种且通过第1区域所包含的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W上的 多聚体多肤为多肤组合物所包含的多肤的总质量的20质量％ W下。
[0194] 目P，当多肤(a)~(d)所包含的第1区域中存在一个W上半脫氨酸残基时，第1区域 的半脫氨酸残基在与存在于其他多肤中的第1区域的半脫氨酸残基之间形成分子之间交 联，由此能够形成多肤的二聚体W上的多聚体。若通过第1区域所包含的半脫氨酸残基而进 行分子之间交联的多肤(a)~(d)的多聚体W超过组合物所包含的多肤的总质量的20%的 含率来存在于多肤组合物中，则多能干细胞的增殖能力被损坏。另外，相对于本说明书中的 多肤的总质量的多聚体的含率是指在组合物中存在多种多肤的情况下，设定为相对于组合 运些多肤的总体的总质量的多聚体的含量(率）。
[0195] 多肤组合物中的多肤(a)~(d)的多聚体的含率，从促进多能干细胞的增殖能力的 观点考虑，优选为组合物所包含的多肤的总质量的15质量％^下，更优选为10质量％ W下， 尤其优选为5质量％ W下。
[0196] 多肤组合物进一步从多能干细胞的培养性能的观点考虑，通过第1区域的半脫氨 酸残基的分子之间交联的多聚体W外的、通过多肤中任一位置的半脫氨酸残基而进行分子 之间交联的二聚体W上的多聚体多肤优选为组合物所包含的多肤的总质量的20质量％ W 下，更优选为15质量％^下，更优选为10质量％^下，进一步优选为5质量％ W下。
[0197] 多肤组合物中多肤(a)~(d)的多聚体的含率，例如，通过使用"ImageJ"(美国国立 卫生研究所(NIH:化tional Institutes of Health)提供)等图像分析软件分析能够算出 通过常规方法实施的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶电泳法)的结果。
[0198] 多肤组合物中的多肤(a)~(d)从促进并提高多能干细胞的增殖的观点考虑，更优 选包含含于第1区域且在由序列号1表示的氨基酸序列中相当于第25个氨基酸残基的半脫 氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间进行分子内交联的多肤，进一步 优选包含包含于第1区域且分别在由序列号1表示的氨基酸序列中相当于第5个氨基酸残基 的半脫氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间、相当于第19个氨基酸残 基的半脫氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间、相当于第25个氨基酸 残基的半脫氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间、及相当于第32个氨 基酸残基的半脫氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半脫氨酸残基之间进行分子内交 联的至少一种多肤(a)~(d)。
[0199] 本发明的多肤组合物可包含多肤(a)~(d) W外的多肤。当多肤组合物为包含选自 多肤(a)~（C)中的至少一种多肤的多肤组合物时，从更有效地获得本发明效果的观点考 虑，多肤(a)~(d)的总含率优选为组合物的85质量％^上，更优选为90质量％ W上，进一步 优选为95质量％ ^上，尤其优选为99质量％ ^上。并且，当多肤组合物为包含多肤(d)的多 肤组合物时，从更有效地获得本发明效果的观点考虑，多肤(a)~(d)的总含率优选为组合 物的85质量％ ^上，更优选为90质量％ ^上，进一步优选为95质量％ ^上，尤其优选为99质 量％ W上。
[0200] 多肤组合物所包含的多肤与纤溶酶原激活物抑制剂-1 (Plasminogen activator inhibitor-1 :PAI-1)的结合常数从多能干细胞的培养性能的观点考虑，优选大于0.06。具 有通过第25个的半脫氨酸残基与第31个的半脫氨酸残基形成的分子内交联的多肤已知有 相对纤溶酶原激活物抑制剂-1 (Plasminogen activator inhibitor-l: PAI-I)显示结合性 的情形。因此，表示相对PAI-I的结合常数越低，具有通过第25个半脫氨酸残基与第31个半 脫氨酸残基形成的分子内交联的多肤越少。从促进多能干细胞的增殖的观点考虑，组合物 中的多肤与PAI-I的结合常数优选为0.1 W上，进一步优选为0.22W上。另外，对于组合物中 的多肤与PAI-I的结合常数的上限值并无特别限制，但从与在所有多肤中各结合有1分子 PAI-I的情况相当的方面考虑，优选1.OW下。
[0201] 多肤中的半脫氨酸残基具有在与相同多肤中的其他半脫氨酸残基之间或其他多 肤中的半脫氨酸残基之间交联的倾向。通过调整氧化还原条件能够控制与其他多肤中的半 脫氨酸残基之间形成的分子之间交联的形成是公知的，例如，可举出Sinha N.K.et al. J Biol Chem. 250pp. 8624-8629，1975所记载的方法。
[0202] 具体而言，可通过包含如下工序的制造方法获得作为目的的多肤(a)~(d)，即，审U 备组合尿素、脈盐酸盐等改性剂W使改性剂浓度成为4M~8M的反应溶液的工序;在得到的 反应溶液中，W规定的比例例如还原剂与氧化剂WlO: 1~2:1的比例(还原剂:氧化剂(摩尔 比））来共存还原型谷脫甘肤及半脫氨酸等的还原剂与氧化型谷脫甘肤及脫氨酸等氧化剂 的工序;将包含还原剂及氧化剂的反应溶液中的改性剂的浓度逐渐降至OM~0.5M的工序。
[0203] 本发明的多肤组合物可W是如下多肤组合物，即包含选自由多肤(a)~(C)构成的 组中的至少一种，且通过多肤中所包含的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体W上 的多聚体多肤为组合物所包含的多肤的总质量的20质量％ ^下。本方式的多肤组合物中， 通过多肤(a)~（C)中的任一位置的半脫氨酸残基而进行分子之间交联的多聚体的含率为 组合物所包含的多肤的总质量的20质量％ ^下。因此，本方式的多肤组合物也与前述的多 肤组合物相同能够提高多能干细胞的增殖性能。
[0204] 关于可包含于本方式的多肤组合物中的多肤(a),对于所有与其他方式的多肤组 合物有关的前述的事项，只要能够适用于本方式的多肤组合物中的多肤(a),可直接沿用前 述的事项，优选范围也可直接沿用。
[0205] 可包含于本方式的多肤组合物中的多肤(b)只要是具有与由序列号1表示的氨基 酸序列的同源性为80% W上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤，可W是具 有任意序列的多肤，也可W不具有上述的（1-i)~（1-iii)的氨基酸序列。对于所有与由序 列号1表示的氨基酸序列的同源性有关的事项、可含有多肤(b)的氨基酸序列及GRAVY值等 其他方式的多肤组合物有关的前述的事项，只要能够适用于本方式的多肤组合物中的多肤 化），可直接沿用前述的事项，优选范围也可直接沿用。
[0206] 可包含于本方式的多肤中的多肤(C)，只要是具有序列号1中缺失、取代或附加1或 数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肤，可W是具有任意序列的多 肤，也可W不具有上述的（1-i)~（1-iii)的氨基酸序列。对于所有由序列号1表示的氨基酸 序列中缺失、取代或附加的氨基酸的数量及种类、可含有多肤(b)的氨基酸序列、GRAVY值等 其他方式的多肤组合物有关的前述的事项，只要能够适用于本方式的多肤组合物中的多肤 (C)，可直接沿用前述的事项，优选范围也可直接沿用。
[0207] <多能干细胞的培养方法>
[0208] 本发明的多能干细胞的培养方法包含在上述的多肤组合物的存在下培养多能干 细胞的阶段。根据本培养方法，能够更有效地增殖多能干细胞。
[0209] 多能干细胞的培养方法从促进多能干细胞的增殖的观点及操作性的观点考虑，包 含在支撑体的细胞培养表面赋予本发明所设及的多肤组合物，W得到多肤包覆培养表面的 阶段（W下，称为培养表面制备工序)及在多肤包覆培养表面上接种多能干细胞而进行培养 的阶段(W下，称为培养工序）。
[0210] 作为本发明所设及的多能干细胞优选为灵长类动物的多能干细胞，具体而言，包 含胚胎干细胞化S细胞）、诱导型多能干细胞（iPS细胞）、成体干细胞、受精卵内部细胞团细 胞及早期胚细胞等，运些细胞可使用一种或根据需要混合使用两种W上。iPS细胞中包含在 NaUire，2007July 19;Vol.448，pp.313-317;Cell,2006,August 25;Vol. 126(4)，卵.663-676中所记载的细胞或与此类似的细胞。
[0211] 其中，作为本发明中优选适用的多能干细胞的例，可列举细胞。
[0212] 另外，作为灵长类动物，可列举人、猴子及猩猩等，尤其优选与所使用的多肤(a)~ (d)同属的人。适用于本发明中的成分或物质，只要是来源于灵长类动物的成分或物质，贝U 作为来源于同种动物的成分或物质而能够优选适用于本发明中。
[0213] 作为用于培养的培养液，可根据成为培养对象的细胞的种类适当选择。作为可使 用的培养液，可W是公知的任何培养液，例如，可列举Essential8、DMEM、MEM、F12、DME、 RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、LI 5、SkBM 及 Basal 培养基等，优选为 Essent ial8。
[0214] 并且，运些培养液中可添加通常能够添加的各种成分，例如葡萄糖、FBS(胎牛血 清)或人血清、抗生素(青霉素、链霉素等）。另外，添加血清时的浓度，可根据当时的培养状 态进行适当变更，但通常可设定为10% (v/v)。
[0215] 其中，作为其他的成分优选为水、盐(钢、钟、儀、巧等的氯化物、氨氧化物、碳酸化 物等的无机盐及丙酬酸钢等的有机盐）、氨基酸（必需氨基酸及非必需氨基酸）、维生素(核 黄素、生物素、氯钻胺素、抗坏血酸及抗坏血酸衍生物等）、微量元素(砸、铁、锋、铜等）、碳源 (D-葡萄糖等）、FGF(碱性成纤维细胞生长因子FGF-2等）、TGF-e、膜岛素及转铁蛋白的培养 基。
[0216] 本发明的培养方法中，优选在不存在来源于异种动物的成分下培养多能干细胞。 由此，能够W较高的精度来排除混入来源于异种动物的异物的可能性。作为不存在来源于 异种细胞的成分下的培养，可举出使用不含有来源于异种动物的成分的培养液的培养及不 使用来源于异种动物的饲养细胞等的培养等。
[0217] 而且，本发明的培养方法中，优选在不存在来源于异种动物的成分及血清成分下 培养多能干细胞。由此，能够进一步排除来源于异种动物的成分的混入。
[0218] 作为不含有来源于异种动物的成分的培养基，可使用由含有非必需氨基酸、谷氨 酸、e-琉基乙醇、FGF-2、TGF-e、膜岛素及转铁蛋白等培养基成分中的至少一种的低渗透压 培养基构成的混合培养基。具体而言，可使用TeSR2(StemCell Technologies Inc.)及 Essential8(Life Technology, Inc.)等培养基，但并不限定于此。
[0219] 另外，细胞的培养中，可适用常规培养条件例如在37°C的溫度下5%(v/v)0)2浓度 的培养箱（in州bator)内的培养。
[0220] 多能干细胞的培养及继代方法中，可使用用于维持多能干细胞而使用的常规的培 养基。具体而言，例如可列举mTeSR、TeSR2(StemCell Technologies Inc.)等。通过常规方 法进行对培养基的多能干细胞的接种。另外，一系列继代中使用的培养基可W不一定相同， 只要能够将多能干细胞维持在未分化状态，则也可W是不同的培养基。
[0221] 培养表面制备工序中包含多肤包覆培养表面对于支撑体的培养表面赋予含有规 定量的特定多肤的涂布溶液的阶段。由此，通过特定多肤能够包覆培养表面。
[0222] 涂布溶液中的特定多肤的总含量，根据成为涂布对象的培养表面的种类或大小有 所不同，但从对培养表面的吸附能力的观点考虑，优选设定为Ipmol/cm 2~1000 pmo Vcm2，更 优选设定为10化mol/cm2~300pmol/cm2。作为为了制备涂布溶液而使用的水性介质并无特 别限制，例如可列举憐酸缓冲液、Tris缓冲液及超纯水等。
[0223] 对于涂布，可赋予涂布溶液后，保持规定时间例如30分~24小时左右，由此无需特 别处理，而能够在培养表面包覆特定多肤。
[0224] 培养工序包含在多肤包覆培养表面上接种多能干细胞而进行培养的阶段。
[0225] 对于多能干细胞的接种密度及培养，并无特别限制，可直接适用常规进行的条件。 例如，作为IX IO3个/cm2~IX IO5个/cm2左右的接种密度，可按照上述的培养及继代条件来 进行培养。并且可W Wl个/cm2~5个/cm2左右的接种密度并按照上述的培养及继代条件来 培养10皿~100皿的细胞团。
[0226] 由此，W特定多肤包覆的培养表面上使多能干细胞操作性良好，并且在使用多肤 (d)的情况下，能够维持未分化状态而进行良好地增殖。
[0227] 而且，在特定多肤的存在下(优选进一步来源于异种动物的成分等的非存在下)培 养的多能干细胞能够几乎完全或大幅度地排除来源于试料等抗原性物质等异物混入的可 能性，通过该培养方法培养的多能干细胞对于医疗用途或与此相当的用途的使用能够充分 地确保安全性。
[0228] 另外，根据使用特定多肤的培养方法，能够W更低的成本且简便的操作来培养多 能干细胞，不仅对医疗用途而且对研究领域中的需要也能够作出巨大的贡献。
[0229] <培养器>
[0230] 本发明中培养器是指具备具有细胞培养中使用的表面的支撑体的培养器。作为运 种支撑体，可直接使用本领域中作为细胞培养用支撑体而周知的培养器。作为支撑体原材 料的例，可包含塑料(例如，聚苯乙締、丙締腊-下二締-苯乙締树脂、聚碳酸醋树脂、聚醋树 脂）、玻璃、微孔过滤器材料(例如，纤维素、尼龙、玻璃纤维、聚醋及聚碳酸醋）、W间歇式或 连续式在细胞培养中或基因工程学(例如生物反应器等）中使用的生物反应器用材料(可包 含中空纤维管或微载体珠。）及聚对苯二甲酸乙二醋、Teflon(注册商标）、陶瓷及其相关聚 合物材料等。
[0231] 并且，支撑体也可W是由等离子体聚合薄膜包覆培养表面的支撑体。
[0232] 作为培养器的形态并无特别限制，可W是能够适用于多能干细胞的培养的任何形 态。作为运种形态的容器的例，可列举多孔板(例如，6孔、12孔、24孔、96孔）、培养皿(例如， 有盖培养皿等）、管、培养瓶、滚瓶、振荡培养瓶等。
[0233] 本发明所设及的培养器是具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细 胞培养表面上的多肤组合物所包含的多肤的培养器。
[0234] 本培养器具有具备前述的本发明所设及的多肤组合物中的多肤即选自由多肤(a) ~(d)构成的组中的至少一种的培养表面。因此，特定多肤良好地吸附在培养表面，在特定 多肤上接种多能干细胞的情况下，操作性良好，并且，在使用多肤(d)的情况下，在维持未分 化状态下能够增殖多能干细胞。
[0235] 在此，培养器中的培养表面是指在接种细胞并进行生长发育时细胞能够附着的表 面。
[0236] 本发明所设及的培养器可通过包含如下工序的制造方法制造，即准备具备具有细 胞培养表面的支撑体的培养器（W下，称为"准备工序"）；在细胞培养表面赋予选自由多肤 (a)~(d)构成的组中的至少一种而进行吸附处理（W下，称为"吸附处理工序"）。由此，能够 容易地获得本发明所设及的培养器。
[0237] 准备工序中准备具备具有培养表面的支撑体的培养器。支撑体在培养表面具有等 离子体聚合薄膜的情况下，可包含在支撑体上形成等离子体聚合薄膜的工序。对于形成等 离子体聚合薄膜的方法，可直接适用常规方法。
[0238] 吸附处理工序中包含在培养表面赋予特定多肤并进行保持的工序。吸附处理工序 中，可通过制备W规定量含有特定多肤的吸附液而赋予培养表面并保持规定时间，由此特 定多肤吸附于培养表面。
[0239] 对于吸附处理工序，可直接适用在培养方法中W多肤包覆培养表面制备工序来说 明的事项。
[0240] 实施例
[0241] W下，通过实施例详细说明本发明。但是，本发明并不受它们的任何限定。另外，若 无特别说明，"％"为质量基准。
[0242] [参考例1]
[0243] <多肤的制备>
[0244] 通过利用PCR的常规方法，对将具有表2及表3所示的氨基酸序列的RCP-I~RCP-17 的各多肤进行编码的基因序列进行扩增。另外，RCP-Il相当于天然人玻连蛋白的序列。另 夕h将与各多肤的氨基酸序列对应的天然人玻连蛋白的氨基酸序列（序列号1)中的位置示 于表2及表3中的"NOTE"栏。其中，各多肤的氨基酸序列中，有时包含对表中所记载的对应范 围的天然人玻连蛋白的氨基酸序列进行附加、删除或取代的氨基酸序列。另外，RCP-I~ RCP-IO及RCP-17相对于由上述的序列号4~13及序列号38表示的各个氨基酸序列，除了在N 末端具有蛋氨酸W外，由相同的氨基酸序列构成。
[0245] 对于RCP-I~RCP-IO及RCP-17,在预先通过NcoKTAKARA BIO INC.)进行切断处理 的pET-28b( + )中，使用InI^sion Advantage PCR Cloning Kit(商品名，Clontech Laboratories , Inc)插入目标基因，W构筑各表达用载体。对于RCP-Il~RCP-16，预先通过 BamHKTAKARA BIO INC.)进行切断处理的 pGEX-6P-l(GE Healthcare Japan Corporation)中，W与上述同样的方法插入目标基因，W构筑各表达用载体。表达用载体的 序列，通过序列分析进行确认。
[0246] [表 2]
[0247]
[0248] [表 3]
[0249]
[0250] 使用已制作的RCP-I~RCP-IO及RCP-17的表达载体，通过常规方法转换为化21 (DE3)pLysS(Novagen)，并涂布于含卡那霉素 LB板上，在37°C下解育16个小时。通过菌落直 接PCR法确认载体的导入后，在添加 ImM的IPTG(异丙基-P-D-硫代半乳糖巧，Wako Pure 化emical Industries,Ltd.)的含卡那霉素 LB中，在37°C下振荡培养5个小时，W诱导多肤 的表达。
[0251] 通过离屯、处理回收菌体，并用清洗用缓冲液(20mM Tris，150mM化Cl，pH7.6)再悬 浮菌体。通过声波降解法破碎菌体后，W1500化pm、30min、4°C的条件进行离屯、，W回收不溶 性级分。用包含0.5质量％Triton XlOO的清洗用缓冲液进行清洗后，用低浓度尿素缓冲液 (Xow Urea BufferJOmM IYisJSOmM PfeClJM尿素，pH7.6)进行再悬浮，并进行声波降解 法处理。通过离屯、处理回收不溶性级分后，添加高浓度尿素缓冲液化igh Urea Buffer: 20mM化is，150mM化Cl，8M尿素，pH7.6)，并通过声波降解法处理对不溶性级分进行可溶 化。
[0巧2] 将包含通过上述方法得到的目标肤的溶液，使用AKTA E邱IorerlOO(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)及HiTrap Heparin HP 5ml(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)进行精制。将前述的高浓度尿素缓冲液作为结合用缓冲液，并将高盐 浓度调整缓冲液(20mM Tris，lM NaCl，8M尿素，pH7.6)作为溶出用缓冲液进行阶段性溶出， W精制目标多肤。
[0巧3]使用上述中制备的RCP-Il~RCP-16的表达载体，通过常规方法转换为BL21 (Novagen),并涂布于含氨节青霉素 LB板上，在37°C下解育16个小时。通过菌落直接PCR法确 认载体的导入后，在添加 IOOyM的IPTG的含氨节青霉素 LB中，在20°C下振荡培养24个小时， W诱导多肤的表达。
[0254]回收菌体，并用B-PER(注册商标）Bacterial Protein Extraction Reagent in Phosphate Buffer(商品名，Thermo FisherScientific Inc.)进行再悬浮后，通过声波降 解法破碎菌体。Wl50(K)rpm、30min、4°C的条件进行离屯、，W除去不溶性级分，并使用AKTA E邱IorerlOO及GSlYapHPSml X 2(商品名，GE Healthcare Japan Coloration)精制上清 液。使用化prep 26/lODesalting(商品名，GE Healthcare Japan Coloration)对溶出级 分进行脱盐，进一步W溶液量的1/2000添加 GST融合蛋白切断用蛋白酶（PreScission Protease )，并在4°C下解育24个小时，切断GST标签。再通过GS化apHP 5ml X 2进行精制，将 已切断的GST标签吸附于色谱柱而除去。使用Slide-A-Lizer(商品名，3.5K MWCO. :Thermo Fisher Scientific Inc.,下同）对通过色谱柱的级分进行透析，并取代为PBS。
[0巧引将与上述一样得到的RCP-I的多肤，利用LADY GEL(12.5% ,Bio-Rad Laboratories , Inc .)进行电泳，利用GelCode? BlueStain Reagent (商品名，Thermo Scientific Inc.)进行染色。其结果，在相当于由氨基酸序列预测的分子量为28.3kDa的位 置上可W确认到单一的条带。对于其他多肤也得到了同样的结果。
[0巧6] 对于RCP-I~RCP-IO及RCP-17,将精制后的各多肤溶液，使用Slide-A-Lizer(商品 名，3.5K丽CO.)进行透析。透析外液是W透析用缓冲液(PBS，1.5M化C1，0.5M心精氨酸， ImM EDTA，抑7.4)为基础，并通过阶段透析除去尿素。最终透析产物使用Nano化OP(商品名， Thermo Fisher Scientific Inc.)并根据280nm的吸光度计算出浓度。有无透析后的凝集 示于表4。
[0257] 并且，GRAVY值作为将每个氨基酸所确定的疏水性指标进行总和并除W氨基酸数 的值进行计算（参考 Kyte J. ,Doolittle R.F.( 1982)，J.Mol. Biol ,157:105-132) eGRA VY 值 为从各多肤所包含的氨基酸的疏水度计算的多肤的亲疏水性的指标，值越大则表示越疏 水，值越小则表示越亲水。将结果示于表4。
[0258] 并且对于有无凝集，则W W下的G、A及B来进行评价。结果一并示于表4。
[0259] G:未见凝集物形成。
[0260] A:可确认到粒径IOOnm左右的颗粒形成。
[0261 ] B:可确认到粒径Imm W上的可见凝集的形成。
[0%2][表 4]
[0264] 如表4所示，RCP-2~RCP-5、RCP-7~RCP-8、及RCP-17是氨基酸残基数为约80个~ 约170个的多肤，虽然容易发生凝集，但GRAVY值在-1.70~-0.975的范围，由此可知凝集的 形成被抑制。
[02化][参考例2]
[0%6] <对培养皿的吸附性评价>
[0267] 将通过上述方法得到的各多肤在规定的缓冲液中进行稀释，W使其能够WO~ 2(K)pmol/cm2的规定的最终浓度添加于孔中，并在结束等离子体处理的聚苯乙締制96孔板 (Tissue Culture-IYeated,falcon公司）中每次添加64化。在37°C下解育2个小时而将各多 肤吸附于板上后，用PBS清洗两次，得到RCP-I~RCP-16的各多肤包覆表面。
[0268] 通过上述的方法得到的各多肤包覆表面中，对包覆RCP-I及RCP-Il~16的表面，分 别赋予64化棚酸缓冲液与IN的化0H，并在80°C且100%湿度下解育24个小时。空气冷却后， 在各孔中添加75化棚酸缓冲液，进一步添加 W1:100 (质量比）混合OPA(邻苯二甲醒:Wako Pure 化emical Indushies ,Ltd.)/甲醇溶液（160mg/ml)与NAC(N-乙酷基-心半脫氨酸： Wako Pure Qiemical Industries,Ltd.)/棚酸缓冲液溶液（2mg/ml)的50化反应液。在40°C 下解育30分钟后，使用Envision多标记分析仪（商品名，Perki址Imer公司）测量巧光强度 (激发355nm/巧光486nm)。通过另外各多肤溶液制作校准曲线，算出吸附量。将结果示于图 1。图1中黑色菱形表示RCP-I，黑色四边形表示RCP-11，黑色S角形表示RCP-12，黑色圆形表 示RCP-13,白色菱形表示RCP-14,白色四边形表示RCP-15,白色=角形表示RCP-16。
[0269] 如图1所示，试验中使用的多肤中，使用包含PRPSLAKKQRFRHRNWGYRSQI^fflSRGRNQN (序列号3[由序列号1中的第342个~第373个氨基酸残基构成的氨基酸序列])的RCP-U15、 16的多肤时，可知具有与具有人玻连蛋白序列的RCP-Il同等的良好的对板的吸附性。另一 方面，可知不含PRPSLAKKQRFRHRN服GYRSQRG服RGRNQN的RCP-13、14的吸附量相对于包含该 序列的多肤约为1/4较低。
[0270] [参考例3]
[0271] <细胞粘附性评价1>
[0272] 对于上述多肤的人iPS细胞（"Tic":细胞编号NO.JCRB1331:独立行政法人医药基 盘研究所[567-0085大阪府茨木市彩都浅木7下目6番8号]分售)的细胞粘附性评价，按如下 进行。
[0273] 作为用于维持人iPS细胞的饲养细胞，使用EmbryoMax(注册商标）（第一代小鼠胚 胎成纤维细胞：潮霉素抗性，经丝裂霉素 C处理，来源于巧7/化6,继代第3代KMillipore Corporation)，并用DMEM(Invitrogen Corporation)、10% (v/v)胎牛血清培养基培养24个 小时，W粘附于T25烧瓶（商品名，Corning Inco巧orated)上。人细胞用培养基使用在表 5的组成的物质中添加 FGF-2(Sigma-al化ich Co丄LC.)使其最终浓度达到lOng/ml的物质。
[0274] [表 5]
[0275]
[0276] iPS细胞使用上述培养基，并在37°C下5%(v/v，下同）0)2培养箱内进行维持培养。 培养基除了细胞的接种次日W外，每天更换新的培养基。继代操作通过用DISPASE(注册 商标）II (neutral protease GradeII ,Roche公司）剥离细胞，并通过移液操作将细胞分离 成适当尺寸来实施。
[0277] 将与上述一样培养的人iPS细胞，利用化ypLE Select(商品名，Invitrogen公司） 并在37 °C下处理5分钟，分离成单个细胞。并W 30化pm离屯、2min回收细胞，并悬浮包含终浓 度IOiiM Y-27362((R)-( + )-反式-N-(4-化晚基）-4-(1-氨乙基)-环己酷胺? 2肥1 ?出0、化〇 结合激酶抑制剂，Wako化re化emical Industries,Ltd.)的TeSR2(商品名，不含来源于异 种动物的成分及血清成分的培养基，Stemcell Technologies Inc.)。
[027引将RCP-I~RCP-IO及亂?-17、肪?-11、亂?-15及亂?-16、及作为比较对照将人玻连 蛋白（从人血浆提取，BD bioscience Company)、重组层粘连蛋白（rLaminin-SiOriental Yeast Co. ,Ltd.及Human Recombinant Laminin-511 :Biolamina公司）分另。从达到表6所不 的添加浓度的方式，悬浮于规定的缓冲液(RCP-1~RCP-IO及RCP-17为上述的GRAVY值及凝 集特性的评价中使用的透析用缓冲液，3〔口-11、15、16、天然玻连蛋白及重组层粘连蛋白为 PBS)中，制备试料1~17,并添加于96孔板的各孔中，并在37°C下保持2个小时后进行吸附。 在得到的肤处理96孔板的各孔中，接种iPS细胞使其达到30000cells/孔的细胞密度。培养 24个小时后，通过PBS清洗除去非粘附细胞，并用4%多聚甲醒（Wako Pure化emical Industries ,Ltd.)只固定粘附细胞。使用Atto地OS(注册商标)AP Fluorescent Substrate System(P;romega Coloration)计算出ALP活性，从校准曲线计算出具有ALP活性的未分化 iPS细胞数。将结果示于表6。表6中，对于细胞粘附率采用将基于使用天然玻连蛋白的试料 15的细胞粘附率设定为100时的相对值。n = 3。
[0279][表 6]
L0281J 如表6所示，具有序列号I所记载的序列的第I个~第44个的RCP-I~RCP-10、RCP-17及RCP-Il与天然人玻连蛋白的iPS细胞的细胞粘附率良好。尤其，不含序列号1所记载的 序列的第56个至第268个氨基酸的一部分或全部的RCP-I~RCP-IO及RCP-17与天然人玻连 蛋白W及具有与天然人玻连蛋白相同氨基酸序列的RCP-Il相比细胞粘附率更为良好。由 此，可知序列号1所记载的第1个~第44个序列中存在对细胞粘附重要的序列。
[0282] [参考例4]
[0283] <细胞粘附性评价2>
[0284] 通过Fmoc固相合成法合成表7所示的多肤。制作W13化mol/cm2的浓度吸附天然玻 连蛋白的表面后，W30,000cells/孔的比例接种添加 IOOiiM的上述合成肤的细胞悬浮液。W 与<细胞粘附性评价1>同样的方法计算出接种24h后的粘附细胞数。将结果示于表7。表7 中，对于细胞粘附率采用将不含合成肤的培养液中的细胞粘附率设定为100时的相对值。n =3。
[0285] [表 7]
[0286]
[0287] 如表7所示，可知相对于通过添加包含CSYYQSC或RGD的化ptide-4、5及6而有意阻 碍细胞对天然玻连蛋白的粘附，在添加将不含CSYYQSC及RGD的P邱tide-1、2、3及化Ptide-5、6的RGD序列取代为RGE的Peptide-7、8时，没有阻碍粘附。因此，可知通过多肤包含 CSYYQSC及RGD中的至少一个，能够发挥细胞粘附能力。
[028引[参考例5]
[0289] <增殖评价>
[0290] 在吸附RCP-Ull及天然人玻连蛋白的96孔板中，W250cells/孔的比例接种W与 上述<细胞粘附性评价1 >同样回收的iPS细胞，并在37°C下5 %C〇2培养箱内培养8天。W与 上述 <细胞粘附性评价1>同样的方法计测各经时后的粘附细胞数，得到增殖曲线。将增殖 曲线示于图2。另外图帥，黑色菱形表示使用RCP-I的例，黑色四边形表示使用RCP-Il的例。 [0巧 1] 同样地，将RCP-I~10及RCP-17、及作为比较对照将Human Recombinant Laminin- 511分别W达到表8所示的添加浓度的方式制备试料I~12,在与上述<细胞粘附性评价1> 同样地吸附各多肤的96孔板中，WSOOOcells/孔的比例进行接种，并在37°C下C〇2培养箱内 培养3天。W与上述 <细胞粘附性评价1>同样的方法计测3天后的细胞数。将结果示于表8。 [0 巧 2][表 8] 「0巧31
[0294] 根据图2，RCP-1显示比具有天然玻连蛋白的氨基酸序列的RCP-Il更高的细胞增殖 性。RCP-11的细胞数在培养第8天为RCP-I的细胞数的约2/3左右。从得到的细胞数的增减计 算出倍增时间的结果，使用RCP-I的情况下为46.4± 2.1小时，使用RCP-11的情况下为67.7 ±2.1小时。
[0295] 并且根据表8，可知RCP-I~RCP-IO及RCP-17均比与玻连蛋白相同的细胞外基质即 层粘连蛋白的细胞增殖率高。可知即使将序列号1中的第274个半脫氨酸残基取代为丝氨酸 残基同样也能获得运种高的细胞增殖率。
[0296] 从图2及表8的结果令人吃惊地发现，由对细胞增殖与培养皿的吸附有效的序列构 成，且不含相当于天然人玻连蛋白的第56个至第268个氨基酸的一部分或全部的序列的 RCP-I~RCP-IO及RCP-17具有比具有与人玻连蛋白同等的序列的RCP-Il及作为比较例的 Laminin-511更高的增殖能力。
[0巧7] 而且，根据表8,可知包含CSYYQSC的序列及RGD序列、 PRPSLAKKQRFRHRN 服 GYRSQRGHSRGRNQN 序列双方的 RCP-I ~RCP-IO 及 RCP-17 均显示高的细胞 增殖性。
[0巧引[参考例6]
[0299] <细胞粘附性评价3>
[0300] 除了将RCP-I用PBS来调整为125pmol/cm2~lOOOpmol/cm 2的浓度而使用W外，与上 述<细胞粘附性评价1>同样地评价细胞粘附性。将结果示于表9。表9中，对于细胞粘附率 采用将相对于W13化mol/cm 2的浓度吸附天然玻连蛋白的培养器的细胞粘附率设定为100 时的相对值。n = 3。
[0301] [表 9] 「nono1
[0303] ~如表9所示，对RCP-I的iPS细胞的粘附性通过添加125pmol/cm2W上而显示与天然' 玻连蛋白同等的细胞粘附率。
[0304] [参考例7]
[0305] <未分化维持评价>
[0306] 在TeSR2中悬浮与上述 <细胞粘附性评价1>同样地回收的iPS细胞。在与上述< 细胞粘附性评价1>同样地分别吸附上述<细胞粘附性评价1>中使用的试料1、试料2、试 料5、试料6及试料7的6孔板（Tissue culture-treated，Falcon Company)中接种iPS细胞， 并在37°C下C〇2培养箱内进行培养。培养基除了接种次日W外，每天更换新的培养基。每隔6 天W与前述同样的方法进行继代。将在各自的试料上培养的细胞的形态示于图3。
[0307] 并且W本条件来培养1个月后，将细胞用4% (v/v)多聚甲醒来进行固定，并通过 l%(v/v)T;riton-X/PBS亢进膜透性。通过Image 口 Si即al Enhancer(商品名，Invitrogen 公司）进行粘连处理后，添加抗人NANOG抗体(AF1997，R&D Systems, Inc)、Alexa Fluor555 结合兔抗山羊I gG抗体（Invi trogen公司）及DAPI ( DOJINDO公司）并进行标记，并用巧光显微 镜进行拍摄。将运些巧光显微镜图像示于图4。
[0308] 图3及图4的各图中，（A)表示在RCP-I上培养的iPS细胞，（B)表示在RCP-Il上培养 的iPS细胞，（C)表示在天然人玻连蛋白上培养的iPS细胞，（D)表示在rLaminin-5上培养的 iPS细胞，化)表示在rLaminin-511上培养的iPS细胞。比例尺：100皿。图3中，左栏表示菌落 整体图像，右栏表示放大图像，图4中，左栏表示DAPI染色图像，右栏表示基于抗NANOG抗体 的染色图像。图3及图4中的比例尺:200wii。
[0309] 如图3所示，在包含对细胞增殖与培养皿的吸附有效的序列的RCP-Ull与天然人 玻连蛋白上进行培养的巧S细胞显示出具有均质的菌落、且高的核占有率的未分化细胞的 特征形态。并且如图4所示，在具有细胞增殖域及吸附域的RCP-Ull与天然人玻连蛋白上进 行培养的细胞在菌落整体中强烈表达NANOG，可知良好地维持了未分化状态。
[0310] 从上述参考例1~7的评价结果可知，由包含CSYYQSC及RGD序列中的任一个与 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRG服RGRNQN序列的40个~450个氨基酸残基构成的多肤对支撑体 的细胞培养表面的吸附性优异。并且，运种多肤在与细胞的共培养条件下，就细胞的 细胞粘附性及未分化状态的维持而言，与具有与天然玻连蛋白及人玻连蛋白同等序列的 RCP-Il是同等的，且就iPS细胞的增殖性而言，是比RCP-Il更优异的结果。可知RCP-I~RCP-10及RCP-17在巧S细胞的细胞粘附性及未分化状态的维持方面均为良好。运种各能力的全 部中，在其他多肤或作为比较例的重组层粘连蛋白中未能获得良好的结果。
[031。 因此，根据本发明所设及的（d)的多肤，能够在未分化状态下增殖多能干细胞，并 且能够提供对细胞培养表面的吸附性优异的多肤与使用该多肤的多能干细胞的培养方法 及培养器。
[0312] [实施例。
[0313] <多肤组合物的制备>
[0314] 上述中得到的RCP-I~RCP-IO及RCP-17中，将RCP-17用于W下的实施例。
[0315] 将参考例1中得到的精制后的多肤RCP-17的溶液使用S1 i de-A-Li Z er (商品名， 3.5K MWCO.)进行透析。透析外液是W透析用缓冲液(PBS，1.5M化C1，0.5M k精氨酸，ImM 邸TA，pH7.4)为基础，进行阶段透析直至尿素浓度达到2M，并除去尿素。
[0316] 透析后，将多肤溶液Wl/10倍（v/v)稀释于稀释用缓冲液（2M尿素，PBS，1.5M 化Cl，0.5Mレ精氨酸，ImM抓TA，pH7.4)，接着为了进行多肤的氧化，将氧化缓冲液（2M尿 素，2mM氧化型谷脫甘肤[Wako Pure化emical Indushies,Ltd.]，20mM还原型谷脫甘肤 [Wako Pure 畑emical Industries，Ltd.]，PBS，1.5M 化C1，0.5M レ精氨酸，ImM EDTA， pH7.4)作为透析外液透析5天。接着在透析用缓冲液(PBS，1.5M化Cl，0.5M k精氨酸，ImM EDTA，pH7.4)进行透析而除去尿素。最终透析产物使用Amicon Ultra 3K(商品名， Mi 11 ipore Co;rporat ion)进行浓缩直至多肤浓度达到0.5mg/ml。
[0317]将最终透析产物在4 °C下静置24h，并充分进行氧化，作为最终产物得到多肤组合 物1-1。使用NanoDrop(商品名，Thermo Fisher Scientific Inc.)并根据280nm的吸光度计 算出最终产物的浓度。
[0；31引另一方面，将参考例1中得到的精制后的多肤RCP-17的溶液使用Sl ide-A-Li zer (商品名，3.5K MWCO.)，并且将透析外液W透析用缓冲液(PBS，1.5M化C1，0.5M心精氨酸， ImM抓TA,pH7.4)为基础，进行阶段透析直至尿素浓度达到0M，W除去尿素，作为最终产物 得到比较用多肤组合物1-2。
[0319] <多肤组合物的性状>
[0320] 分别将含有W上述方法得到的RCP-17的多肤的多肤组合物I-I及1-2与作为比较 例包含VTN-N(商品名，重组人玻连蛋白，Life Technologies)的多肤组合物1-3,使用非还 原SDS-PAGE(15质量％ ,ATTO CORPORATION)进行分离，并使用GelCode? Blue Stain Reagent(ThermC) Scientific Inc.)进行染色。将结果示于图5。并且，通过使用ImageJ分析 得到的染色图像来定量Band强度，并计算出单体及多聚体的存在比。将结果示于表10。
[0321] [表 10]
[0322]
[0323] 图5中，对于通过阶段透析只除去尿素的多肤组合物1-2及含有VTN-N的多肤组合 物1-3中的、能够确认分子之间交联的多聚体的形成，经多肤的氧化处理得到的多肤组合物 I-I中，没有确认到RCP-17的多聚体。
[0324] 并且，如表10所示，实施例所设及的多肤组合物I-I中多聚体为约5质量％ W下。
[0325] [实施例2]
[0326] <细胞增殖性评价2>
[0327] 使用实施例1中得到的多肤组合物I-I~多肤组合物1-3进行了 W下的细胞增殖性 评价。
[0328] 将各多肤组合物I-I~I-3W使其在组合物中的多肤的浓度达到表11所示的最终 浓度的方式悬浮于规定的缓冲液(对于包含RCP-17的多肤组合物I-I及1-2采用参考例的 GRAVY值及凝集特性的评价中使用的透析用缓冲液，而对于包含VTN-N的多肤组合物1-3采 用PBS)中，W制备多肤液，并添加到具有等离子体处理细胞培养表面的等离子体处理剂聚 苯乙締制96孔板(BD Falcon)的各孔中，并在37°C下保持2个小时而进行吸附，得到具有多 肤包覆表面的肤处理96孔板。在得到的肤处理96孔板的各孔中，接种Wl: 1(体积比）混合 TeSR2(Stemcell Technologies Inc.)与Nutristem(注册商标，Bio Industries Inc.)的 培养基中悬浮的细胞使其细胞密度达到1000 Ocel 1 s/孔。培养72个小时后，通过PBS清洗 除去非粘附细胞，用4质量％多聚甲醒(Wako Pure化emical Industries,Ltd.)只固定粘 附细胞。用Attophos(注册商标）AP Fluorescent Substrate System(P;romega Corporation)计算出ALP活性，并从校准曲线计算出具有ALP活性的未分化iPS细胞数。将结 果示于表11。表11中，细胞增殖率W将使用重组层粘连蛋白进行培养时经过72个小时后的 细胞数设定为1OO %时的比例来表示。n = 3。
[0329] [表 11]
[0330]
[0331] 如表11所示，可知本发明的实施例所设及的多肤组合物I-I比多肤组合物1-2细胞 增殖性更优异。运表示通过多肤的多聚体的形成细胞增殖活性遭到破坏。
[0332] [实施例3]
[0333] <多肤组合物的制备>
[0334] 上述中得到的RCP-I~RCP-IO及RCP-17中，对于RCP-5WW下的方法实施了还原处 理。
[0335] 在包含RCP-5 的多肤溶液中添加 Tris(S-Carboxyethyl)Phosphine Hy化Ochloride(Wakc)化re 化emical Industries,Ltd.)使其终浓度达到IOOmM,并在4°C 下静置2地，W制备试料A。
[0336] 作为比较，将包含RCP-5的多肤溶液W未处理的状态在-80°C下进行冻结，W制备 试料B。
[0337] 将各自的试料使用Sl ide-A-Lizer (商品名，3.5K MWCO.)进行了透析。透析外液是 W透析用缓冲液(PBS，1.5M化C1，0.5M k精氨酸，ImM抓TA，pH7.4)为基础，并通过阶段透 析除去尿素，分别得到多肤组合物II-U试料A)及11-2(试料B)。
[033引 < 多肤的结构分析>
[0339] 使用化ptide Mass Finge巧rint法进行了二硫化物键的分析。详情如下。
[0340] 1)蛋白质的酶消化
[0%1] 将50mM碳酸氨锭缓冲液(pH7.8)900化加入微量离屯、管中，并且分别添加10化L的 多肤组合物II-I及11-2。另外，添加10化的lOOiig/ml膜蛋白酶（Wako化re Chemical Industries ,Ltd.)或500ng/ml的Glu-C(Promega)，并在37°C下静置一个晚上。将被消化的 片段化肤使用离屯、浓缩装置(Buchi)进行浓缩直至达到10化L。
[0342] 2)脱盐
[0%3] 将上述消化物10化使用Ziptip C15CHIP(商品名，Millipore)进行脱盐，并作为测 量试料。
[0344] 3)MALDI-MS 测量
[0345] 使用叫traflexTOF/TOF(商品名，Bruker Daltonics)，并W33化m激光波长来测量 了试料。采用反射模式进行测量，同样使用P邱tide calibration standard II(商品名， Bruker Daltonics，产品编号222570)，对m/z 700~4000的范围进行了质量校正。非还原测 量中，混合肤消化物1化与C肥A基质(a-氯基-4-径基肉桂酸）的0.1%TFA/此0-MeCN(2:1)饱 和溶液4化，并载持于祀板上。还原测量中，在祀板上混合肤消化物0.化L与40mM DTT溶液 (抑9.0 )0.扣L，并静置20分钟后，载持CHCA基质饱和溶液0.扣L，并进行干燥。将试料载持于 革己板之后的最终目标（On-target)清洗（脱盐）按照从化址er Daltonics Co巧oration获得 的操作指南进行实施。
[CX346] 4)测量值的评价
[0347] 对于得到的质量分析值通过Mascot server(商品名，Mahix Science Ltd.)进行 捜索，确定基于各自酶的片段化肤的序列。同样，通过调查基于还原处理的片段化肤的质量 变化，确定片段化肤内所包含的半脫氨酸有关的二硫化物键的交联位置。
[0；34引分析结果，关于多肤组合物II-I所包含的RCP-5的N末端侧4个残基（Cys5、切s9、 切sl9及切s21)，检测出作为主成分的W切巧与切s9、切sl9与切s21为一对的进行分子内交 联的组合物。并且只在多肤组合物II-2所包含的RCP-5中，观测到切s39彼此进行分子之间 交联的成分。
[0349] <PAI-1结合性评价>
[0350] 使用已知的与具有Cys25与Cyc31交联的结构的多肤结合的Plasminogen Acitivator Inhibitor-I(PAI-I)，尝试了Cys25与Cyc31 交联结构的检测。
[0巧1] 将上述多肤组合物II-I及11-2( lOOiig/ml)添加到聚苯乙締制的平面底、黑色96孔 板化alf-Area)中使其达到64化/孔。使用密封薄膜(Funakoshi Co . ,Ltd.)包覆板整体，并 在4°C下静置而对各多肤组合物中的RCP-5进行固相。12个小时后，去掉孔内的液体，并添加 包含5%Bovine Serum A化Umin(Sigma)的TBS(NIPP0N GE肥 00.，1；10.)使其达到150化/ 孔。在37°C下静置1个小时后，去掉孔内的液体，再添加 Blocker Casein(商品名，Thermo scientific)使其达到ISOiiL/孔，同样在37°C下静置而实施粘连。1个小时后，添加包含 0. 05%Tween20的TBS(TBST)使其达到15化L/孔，并连续从孔内去掉液体。实施4次该操作， 清洗孔内。
[0352] 接着，将使用TBS并从170nM至2.6nM依次进行等倍稀释的重组体PAI-I(目录编号 1786-PI，R&D systems)溶液，分别添加到孔内使其达到50化/孔，并在37°C下进行静置。1个 小时后，从孔内去掉PAI-I溶液，W与前述同样的方法并用TBST共清洗4次，除去未结合PAI- 1。 接着，将未标记anti-goat IgG H+L(目录编号A10537，Life technologies)原液用TBS进 行700倍稀释，并添加使其达到15化L/孔，在37 °C下静置而再进行粘连。1个小时后，从孔内 去掉抗体溶液，W与前述同样的方法并用TBST共清洗4次。然后，将抗PAI-I抗体（目录编号 AF1786，R&D systems)原液用TBS进行100倍稀释，并添加使其达到10化L/孔。在37°C下静置 1个小时后，从孔内去掉抗体溶液，W与前述同样的方法用共TBST清洗4次而除去未结合 Anti-PAI-I 抗体。
[0353] 而且，将HRP标记抗goat IgG抗体（目录编号81-1620，Life technologies)原液用 TBS进行7500倍稀释，并添加使其达到10化L/孔。在37°C下静置1个小时后，从孔内去掉抗体 溶液，W与前述同样的方法并用TBST共清洗4次而除去未结合标记抗体。接着，使用 QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate Kit(商品名，Thermo scientific)，并按 照说明书所记载的方法调整HRP基质，并添加使其达到50化/孔。在37°C下静置20分钟后，添 加附属于同kit的停止液使其达到50化/孔，W停止反应。将激发、巧光波长分别设定为 330nm、410nm，并使用Envision(商品名，Perkinelmer)将RCP-5与PAI-I的结合作为相对巧 光单位进行了测量。
[0354]将得到的测量值设定为X轴，将测量值除WPAI-I添加浓度(nM)的值设定为巧由来 标绘的结果示于图6。得到的直线相当于W下Scatchard Plot的式，因此从倾斜度可W计算 出结合常数化A)。
[0355]试）
[0；356] PAI-I 结合量/PAI-I 添加量= -KA X PAI-I 结合量
[0357] 将算出的结果示于表12。可知多肤组合物II -1中的RCP-5与多肤组合物II -2中的 RCP-5相比PAI-I的结合常数大，即存在较多Cys25、Cys31、分子内交联体。
[0；35 引[表 12] L〇36〇」 < 细胞增殖性评价>
[0361] W与实施例3的<细胞增殖性评价2>所记载的方法同样的方法，评价了多肤组合 物II-I及II-2的细胞增殖性。将结果示于表13。可知多肤组合物II-I与多肤组合物II-2相 比细胞增殖活性优异，即Cys25、Cys31、分子内交联体结合的多肤的细胞增殖活性优异。
[0362] [表 13]
[0363]
[0364] 如此，本发明的多肤组合物为不是W通过人玻连蛋白N末端侧的半脫氨酸残基而 进行分子之间交联的二聚体W上的多聚体的形态，而是W没有进行分子之间交联的单体的 形态，包含较多的包含规定的人玻连蛋白N末端侧的部分序列且具备具有对多能干细胞的 细胞粘附能力的氨基酸序列的多肤的肤组合物。可知在运种多肤组合物的存在下有效地增 殖多能干细胞。
[0365] 因此，根据本发明，能够提供可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细 胞增殖能力的多肤组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。
[0366] 2013年10月31日于日本申请的日本专利申请第2013-227583号的公开，通过参考 并将其内容全部援用于本说明书中。
[0367]本说明书中所记载的所有的文献、专利申请及技术标准，通过参考而援用于此的 每个文献、专利申请及技术标准与具体且个别记载时相同程度地通过参考援用于本说明书 中。
【主权项】
1. 一种多肽组合物，其包含选自由以下多肽(a)~(c)构成的组中的至少一种： (a) 具有由序列号1表不的氣基酸序列的多妝； (b) 具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列且具有多 能干细胞的培养性能的多肽;及 (c) 具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有多能干 细胞的培养性能的多肽， 多肽(a)~(c)为包含由以下（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域的 多肽： (1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个~第44个氨基酸残基构成的氨基酸序 列； (1-ii)由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列 构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列;及 (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列构 成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，且 选自由多肽(a)~（c)构成的组中的至少一种中的通过第1区域所包含的半胱氨酸残基 而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质 量％以下。2. -种多肽组合物，其包含由40个~450个氨基酸残基构成的多肽(d)，多肽(d)为包含 由以下（1-i)~（1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由以下(2-i)~(2-iii)中 的任一个氨基酸序列表示的第2区域的多肽： (1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个~第44个氨基酸残基构成的氨基酸序 列； (1-ii)由与由氨基酸序列（1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列 构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列;及 (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列构 成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列， (2-i)由PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN即序列号3表示的氨基酸序列； (2-ii)与由序列号3表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有对支撑体的细胞 培养表面的吸附能力的氨基酸序列;及 (2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加了 1或数个氨基酸且具有 对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列，且多肽(d)中的通过第1区域所包含的 半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的 总质量的20质量％以下。3. 根据权利要求1或2所述的多肽组合物，其中， 通过多肽中的任一位置的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体 多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的多肽组合物，其中， 组合物中的多肽(a)~(c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽包含于第1区域且在 相当于由序列号1表示的氨基酸序列中的第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31 个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间进行分子内交联。5. 根据权利要求1~3中任一项所述的多肽组合物，其中， 组合物中的多肽(a)~(c)或(d)包含如下多肽，所述多肽包含于第1区域且分别在相当 于由序列号1表示的氨基酸序列中的下述半胱氨酸残基之间进行分子内交联： 相当于第5个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半胱氨酸残基 之间、 相当于第19个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半胱氨酸残 基之间、 相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残 基之间、及 相当于第32个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半胱氨酸残 基之间。6. 根据权利要求1~3中任一项所述的多肽组合物，其中， 组合物所包含的多肽与纤溶酶原激活物抑制剂-1的结合常数大于0.06。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的多肽组合物，其中， 作为组合物中的多肽(a)~（c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽还包含由下述 (3a_i)~(3a_iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域： (3a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第56个~第341个氨基酸残基构成的氨基酸 序列或其部分氨基酸序列； (3a_ii)与（3a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸 序列;及 (3a_iii)相对(3a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨 基酸而成的氨基酸序列。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的多肽组合物，其中， 作为组合物中的多肽(a)~（c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽还包含由下述 (4a_i)~(4a_i i i)中的任一个氨基酸序列构成的第4区域： (4a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第374个~第459个氨基酸残基构成的氨基 酸序列或其部分氨基酸序列； (4a_ii)与(4a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸 序列;及 (4a_iii)相对(4a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨 基酸而成的氨基酸序列。9. 一种多肽组合物，其包含选自由以下多肽(a)~(c)构成的组中的至少一种： (a) 具有由序列号1表不的氣基酸序列的多妝； (b) 具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列且具有多 能干细胞的培养性能的多肽;及 (c) 具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有多能干 细胞的培养性能的多肽， 通过多肽中所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽 为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。10. -种多能干细胞的培养方法，其包含在权利要求1~9中任一项所述的多肽组合物 的存在下培养多能干细胞的阶段。11. 一种培养器，其具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细胞培养表面 上的权利要求1~9中任一项所述的多肽组合物所包含的多肽。
【文档编号】C12M3/00GK105874058SQ201480058971
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年10月29日
【发明人】萩屋启太, 森冈早苗, 村上裕太, 半户里江, 铃木晃生, 岩木义英, 佐佐木翼
【申请人】富士胶片株式会社