用于食道癌的分子诊断测试的制作方法
【专利摘要】提供鉴别用于食道腺癌(OAC)的分子诊断测试的方法和组合物。该测试定义了新的DNA损伤修复缺陷分子亚型，并使得能够在该亚型内对患者进行分类。本发明可用于在施用任何化疗之前确定OAC患者在临床上对治疗方案有响应还是无响应。该测试可以与直接或间接影响DNA损伤或修复的不同药物，例如许多目前正在使用的标准细胞毒性化疗药物一起使用。特别地，本发明涉及预测标志物的特定组合，其中预测标志物的表达与对治疗方案的响应性或无响应性相关联。
【专利说明】用于食道癌的分子诊断测试 发明领域
[0001] 本发明设及用于预测食道癌对特定治疗的响应性的分子诊断测试，包括DNA损伤 修复缺陷亚型的使用。本发明包括各种分类器Classifiers)的产生和使用，所述分类器衍 生自食道癌患者(特别是食道腺癌(OAC)患者）中该亚型的鉴别，例如44-基因分类器模型的 使用，用于鉴别该DNA损伤修复缺陷分子亚型。一种应用是将对食道癌治疗药物类别的响应 分层，并针对食道癌治疗药物类别选择患者，所述药物类别包括引起DNA损伤的试剂和DNA 修复祀向疗法。本发明提供测试，其能指导传统治疗选择并且在新型治疗剂的临床试验评 估过程中选择用于富集策略的患者群。可W，例如，从新鲜/冷冻(f reslV打OZen，FF)或福尔 马林固定的石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded,FF阳）患者样品鉴别DNA修复 缺陷亚型。
【背景技术】
[0002] 制药行业一直在寻求比当前施用药物更有效的、更具有特异性的或具有更少不良 副作用的新型药物治疗选择。由于人类群体内的遗传变异性使许多药物的有效性产生了显 著差异，一直在开发替代药物疗法。因此，虽然当前有多种多样的药物疗法可供选择，但是 在患者无法产生响应的情况下总是需要更多疗法。
[0003] 传统上，医师所使用的治疗模式一直是开出在治疗疾病方面可能得到最高成功率 的一线药物疗法。如果一线疗法无效，则开出替代性药物疗法。对于某些疾病来说，运种模 式明显不是最佳的治疗方法。例如，在例如癌症的疾病中，第一次治疗经常是最重要的并且 为成功治疗提供了最佳机会，因此存在更高的需求选择对于特定患者的疾病最有效的初始 药物。
[0004] 食道癌(食道的癌症)是高度侵袭性的癌症，属于世界上10种最常见的癌症。在英 国在过去30年间它变得越来越常见。它在成人中是第9位最常见的癌症，在英国每年诊断的 有大约8500个病例(CRUK统计资料）。食道癌发生在男性中是发生在女性中的大约两倍。腺 癌意味着癌症是从腺细胞开始的。在食道癌中，在食道内壁上存在制造粘液的细胞。在过去 20年间，腺癌的数量增加。它们现在构成全部诊断的食道癌的超过一半，鱗状细胞癌构成其 余的病例。腺癌主要在食道下=分之一中被发现。
[0005] 早期食道腺癌(OAC)的治疗通常是手术。手术治疗是唯一的重复显示出提供延长 生存期的治疗，虽然仅仅是在大约20%的病例中（Miiller JM et al.Br J Surg(1990)77: 845)。手术切除的效果可W是很好的。当肿瘤局限于粘膜，W及当设及粘膜下层时在50%到 80%之间时，五年生存率超过80%。BonavinaL.BrJSu巧（1995)82:98;；H糾s地:erAH，et al.化 J Su巧（1997)84:1470.
[0006] 微阵列和分子基因组学的出现有可能对疾病的诊断能力和预后分类产生显著影 响，它们可W帮助预测单个患者对确定的治疗方案的响应。微阵列提供了对大量遗传信息 的分析，从而提供个体的遗传指纹。更值得关注的是，运一技术最终将为定制药物治疗方案 提供必要工具。
[0007] 当前，健康护理专业人员很少有途径来帮助他们鉴别将受益于化疗剂的癌症患 者。最佳一线药物的鉴别一直很难，因为没有可用的方法来准确地预测哪种药物治疗对于 特定癌症的生理学将是最有效的。运一不足导致相对较差的单一药剂响应率W及增加的癌 症发病率和死亡。而且，患者经常不必要地经受无效、有毒的药物疗法。
[0008] 分子标记已被用于选择合适的治疗，例如，在乳腺癌中。不表达雌激素和孕激素受 体W及皿R2生长因子受体的乳腺肿瘤，被称为阴"，其表现出响应PARP-1抑制剂疗法 (Xinn'S.C.'and Van't Veer'L.'J.Eur J Cancer 45Suppl 1,11-26(2009);0' Siau曲nessy，J.，et al.N Engl J Med 364,205-214(2011)。近来的研究表明乳腺肿瘤的 =阴状态可W指示对于包括PARP-I抑制剂在内的组合疗法具有响应性，但是可能不足W指 示对于个体PARP-I抑制剂的响应性(O'Shaughnessy et al.,2011)。
[0009] 而且，已有其它的研究尝试鉴别与分子亚型有关的基因分类器，W指示对于化疗 剂的响应性（F'armer et al.Nat Med 15,68-74(2009);Konstantinopoulos,P.A.,et al., J Clin Oncol 28,3555-3561(2010))〇
[0010] WO 2012/037378描述了一种44-基因的DNA微阵列测定，DNA损伤修复缺陷（孤畑） 巧憶。该测定鉴别出丧失了 DNA损伤反应FA/服CA途径的癌症的分子亚组，导致对于DNA损伤 性化疗剂的敏感性化ennedy&D'An化ea Journal of Clinical 0ncology(2006)24:3799, et al Na1:ure Reviews &nce;r(2004)4:814)。
[0011] 在乳腺癌中，孤RD测定已表明在203个乳腺癌患者中可W预测对于肿瘤辅助DNA损 伤化疗(5-氣脈喀晚、蔥环霉素和环憐酷胺）的响应（比值比4.01)(95%C1:1.69-9.54)。在 191名用辅助剂5-氣脈喀晚、表柔比星和环憐酷胺治疗进行治疗的早期乳腺癌患者群中，该 测定5年无复发生存的风险比是0.37(95%Cl:0.15-0.88)。
[0012] 发明简述
[0013] 在许多OAC的病例中，手术在肿瘤辅助化疗之后进行，所述肿瘤辅助化疗通常是顺 销和氣脈喀晚的组合。运种疗法用于缩小肿瘤的尺寸。但是，已知不是所有的患者对于运种 形式的疗法都有响应，而且，尚没有测试可W鉴别那些将会从肿瘤辅助化疗受益的OAC患 者。因此，许多患者在接受化疗，经受与之相关的副作用和生活质量的降低，但没有治疗益 处。已表明DNA损伤反应途径在食道癌的进展中很重要化e et al(2013)Carginogeneisis 34:139;Motoo;ri et al International Journal of 0ncology(2010)37:1113)。因此存在 极大的临床需要，需要某种测试W在手术之前的肿瘤辅助化疗方面将OAC患者分层。
[0014] 本发明是基于运样的方法的应用，该方法鉴别DNA损伤修复中的缺陷，W确定哪些 患者将会从特定的疗法，例如基于销的疗法中受益，W治疗食道癌，特别是0AC。本发明设及 使用在食道癌中表达的基因产物的集合的方法，W使得当一些或全部转录物过表达或低表 达(over or under-e邱ressed)时，它们鉴别出在DNA损伤修复中有缺陷的食道癌亚型。本 发明还提供指示对于DNA损伤治疗剂的响应性或抵抗的方法。在不同的方面，该基因或基因 产物列表可W形成单参数或多参数预测测试的基础，所述单参数或多参数预测测试可W用 本领域已知的方法，例如微阵列、Q-PCR、免疫组化、ELISA或其它可W定量mRNA或蛋白质表 达的技术来实现。
[0015] 因此，根据本发明的一个方面，提供预测患有食道癌例如(特别是)食道腺癌(0AC 的个体对于用DNA损伤治疗剂进行的治疗的响应性的方法，包括：
[0016] a.测量从该个体获得的测试样品中的一个或多个生物标志物/基因的表达水平， 其中一个或多个生物标志物选自表14、18、24、28、3和/或4，例如一个或多个生物标志物选 自由 CX 化 10、]\?1、1001、1尸14化、〔02、68口5、口尺416、口641^、0?^和4口01^3组成的组；
[0017] b.得到记录(cap化res)表达水平的测试得分；
[0018] C.提供阔值得分，该阔值得分包含将测试得分与响应性相关联的信息；
[0019] d. W及将测试得分与阔值得分相比较;其中当测试得分超过阔值得分时，预测为 有响应性，和/或当测试得分未超过阔值得分时，预测为无响应性。
[0020] 该方法可W作为为个体选择合适治疗的方法或者作为测试或治疗方法来实施。因 此，在特定的实施方案中，如果测试得分超过阔值得分(预测为有响应性），则用DNA损伤治 疗剂治疗个体。类似地，如果测试得分未超过阔值得分(预测无响应性），则不用DNA损伤治 疗剂治疗个体。在那些情况下，可W考虑替代的治疗。对于0AC，替代的治疗可W包括施用有 丝分裂抑制剂，例如长春花生物碱或紫杉烧。长春花生物碱的实例包括长春瑞滨。紫杉烧的 实例包括紫杉醇或多西紫杉醇。或者，治疗可W完全排除化疗。在一些实施方案中，该方法 还可W包括被鉴别为有响应性的个体的后续治疗。还设及相应的试剂盒。该方法典型地在 体外进行。因此，使用分离的，或预分离的样品进行该方法。在一些实施方案中，该方法可W 包括从个体获得测试样品的步骤。在特定的实施方案中，该方法包括测量测试样品中的至 少10个生物标志物的表达水平，所述生物标志物来自于表1-4的任一个。更特别地，在一些 实施方案中，该方法可W包括测量表2B中所列的至少10个W及多达全部44个不同生物标志 物的表达水平。在特定的实施方案中，使用与表iA、iB或3中所示的祀序列^dseqidno=I-24、SEQ ID N0:25-50或SEQ ID N0:51-230)的至少一个结合的引物或探针测量表达水平。
[0021] 在一些实施方案中，该方法进一步包括测量测试样品中的一个或多个生物标志物 的表达水平，其中所述一个或多个生物标志物选自由CDRl、FYB、TSPAN7、RAC2、KL皿C7B、 GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、0LFM4、PI15、F0SB、FAM19A5、MJ?C5、 PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、0R211P、EGFR、NAT1、 1^\152、〔￥?286、？1?亂、？?？11?14和41^37218.1组成的组。在一些实施方案中，测试得分记录 了全部生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，当测试得分超过阔值得分时，可W预测 为有响应性，所述阔值得分的值在大约0.巧IjO.5之间，例如0.1、0.2、0.3、0.4或0.5，例如大 约0.3681。
[0022] 食道癌典型地是食道腺癌(OAC)并且可W是早期的。或者，OAC可W是晚期的或转 移性疾病。被预测响应性的治疗典型地是肿瘤辅助治疗。但是，它还可W额外地或者替代性 地包括辅助治疗。
[0023] 本文所述的本发明不限于任何一种DNA损伤治疗剂;它可W用于鉴别对一些DNA损 伤治疗剂中的任何一个的响应者和无响应者，所述DNA损伤治疗剂例如是那些直接或间接 影响DNA损伤和/或DNA损伤修复的治疗剂。在一些实施方案中，DNA损伤治疗剂包含选自由 DNA损伤剂、DNA修复祀向疗法、DNA损伤信号传导抑制剂、DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑 制剂、组蛋白脱乙酷酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂和DNA合成抑制剂组成的组的一种或多种 物质。更具体地，DNA损伤治疗剂可W选自含销的剂、核巧类似物例如吉西他滨或5-氣脈喀 晚或其前药例如卡培他滨、蔥环霉素例如表阿霉素或阿霉素、烧化剂例如环憐酷胺、电离福 射或福射和化疗的组合(放化疗)的一种或多种。在特定的实施方案中，DNA损伤治疗剂包括 含销的剂，例如选自顺销、卡销和奥沙利销的基于销的试剂。例如，本文中通过实验表明本 发明的方法可W预测更有可能从基于销的疗法受益的OAC患者的响应性/作为运种患者的 预后指标。该方法可W预测对于用DNA损伤治疗剂与其它治疗或药物一起治疗的响应性。因 此，该方法可W预测对于组合疗法的响应性。因此，在一些实施方案中，其它药物是有丝分 裂抑制剂。有丝分裂抑制剂可W是长春花生物碱或紫杉烧。在具体的实施方案中，长春花生 物碱是长春瑞滨。在其它的实施方案中，紫杉烧是紫杉醇或多西紫杉醇。在特定的实施方案 中，在食道癌的治疗中，鉴别对于下述(组合)治疗的响应者:顺销/卡销和5-氣脈喀晚(CF), 顺销/卡销和卡培他滨(CX)，表阿霉素/阿霉素、顺销/卡销和氣脈喀晚化CF)，表阿霉素/阿 霉素、奥沙利销和卡培他滨巧OX)，W及与紫杉醇、伊立替康和长春瑞滨、使用或不使用紫杉 烧的放疗或放化疗的组合。
[0024] 本发明设及使用不同的响应分类预测对药物(DNA损伤治疗剂）的响应，所述响应 分类例如总生存率，无进展生存率，无疾病生存率，放射响应，如RECIST所定义的，全响应， 部分响应，稳定疾病和血清标志物例如，但不限于?54、〔64、〔4125、〔415-3和〔419-9。在本发 明的其它实施方案中，它可用于评价食道癌患者(OAC)中的超声内镜、CT、螺旋CT、抑G-PET、 病理、组织响应，所述食道癌患者用DNA损伤组合疗法，单独地或在标准治疗的环境中进行 治疗。
[0025] 本发明依赖于DNA损伤响应缺陷（DDRD)分子亚型，其最初是在乳腺癌和卵巢癌中 被鉴别的(W02012/037378;通过引用合并入本文）。在一些实施方案中，运种分子亚型可W 通过使用两种不同的基因分类器进行检测-一种长度为40个基因，一种长度为44个基因。 孤畑分类器首次在Almac Rreast Disease Specific Array(DSA?)上由53个探针集组成的 分类器定义。为了验证该分类器在预测对含有DNA损伤的化疗方案的响应的能力方面的功 能相关性，需要在基因水平上重新定义该分类器。运有助于利用来自独立数据集的微阵列 数据评价DDRD分类器，所述独立数据集是在Almac化east DS乂饭化外的微阵列平台上给 出的。为了帮助在基因水平上定义分类器，需要确定Almac化eastDSA?探针集对应的基 因。运包括使用公众可获得的基因组浏览器数据库例如Ensembl和NCBI Reference Sequence"44-基因 DDRD分类器模型取代了 40-基因 DDRD分类器模型。本文给出的结果证明 44个和40个基因的分类器模型W及衍生自本文公开的标志物的相关分类器模型在OAC中对 含有DNA损伤治疗剂的化疗方案的响应是有效的且重要的预测方案。
[00%] 使用W选自从表1A和IB(或表3和4)基因为基础的分类器模型对DD畑亚型的鉴别， 例如通过40-基因分类器模型（参见表2A和2B) W及44-基因分类器模型二者进行的鉴别，可 用于预测对标准OAC治疗药物类别的响应，或者选择用于标准OAC治疗药物类别的患者，所 述标准OAC治疗药物类别包括引起DNA损伤的试剂和DNA修复祀向疗法。
[0027]在另一个方面，本发明设及用于W上所列的常规诊断应用的试剂盒，所述常规诊 断应用例如核酸扩增，包括PCR及其所有变形形式例如实时和终点方法W及qPCR，第二代测 序(NGS)，微阵列和免疫测定例如免疫组化、ELISA、Western印迹等。运种试剂盒包括合适的 试剂和说明书，W测定基因或基因产物的表达或者定量mRNA或蛋白表达。试剂盒可W包括 合适的引物和/或探针，W检测表1A和/或IB和/或2A和/或2B和/或3和/或4中的基因的至少 一个的表达水平。试剂盒可W含有与表1AUB和/或3中所示的祀序列结合的引物和/或探 针。祀序列可W包含沈Q ID NO: 1-24、SEQ ID NO: 25-50或SEQ ID NO: 51-230,基本上由它 们组成或者由它们组成。当在蛋白质水平上确定表达时，试剂盒可W含有对感兴趣蛋白质 特异性的结合试剂。结合试剂可W包含针对包括所有片段及其衍生物的抗体。在本发明的 不同实施方案中，术语"抗体"包括对相关蛋白质具有特异性结合亲和力的所有免疫球蛋白 或免疫球蛋白样分子饱括，W举例而非限制的方式，IgAa曲、I巧、IgG和IgM,它们的组合， W及在任何脊椎动物，例如在哺乳动物如人、山羊、兔和小鼠中的免疫反应过程中产生的类 似分子）。可用于本发明的不同实施方案中的具体免疫球蛋白包括IgG同种型。可用于本发 明的不同实施方案的抗体在起源上可W是单克隆或多克隆的，但通常是单克隆抗体。抗体 可W是人抗体、非人抗体或非人抗体的人源化形式、或嵌合抗体。抗体人源化的各种技术都 是完善的，并且可W使用任何合适的技术。术语"抗体"还指包含至少特异性识别并结合抗 原表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肤配体，并且它扩展到所有保留了与相关蛋白 质特异性结合能力的抗体衍生物和片段。运些衍生物和片段可W包括化b片段、F(ab'）2片 段、Fv片段、单链抗体、单域抗体、Fc片段等。术语抗体包括由重链和轻链二者组成的抗体， 但是也包括重链(仅有)抗体(其可W来自于各种软骨鱼类或骆驼科物种）。在特定的实施方 案中，抗体可W被工程化，W对于多于一种蛋白质具有特异性，例如双特异性，W允许结合 两种不同的本文所鉴别的祀蛋白（参见表1-4)。
[0028] 在一些实施方案中，试剂盒还可W含有在该测试预测响应性的事件中要施用的特 定DNA损伤治疗剂。提供的该试剂可W是特别为OAC治疗定制的方式，例如剂型。该试剂可W 同时提供适当的说明，用于根据OAC治疗方案进行施用。
[0029] 本发明还提供鉴另化NA损伤反应缺陷伽RD)人OAC月中瘤的方法。有可能本发明可用 于鉴别对DNA损伤治疗剂敏感并响应，或者对它抵抗并且无响应的患者，所述DNA损伤治疗 剂例如是直接损伤DNA、间接损伤DNA或抑制正常DNA损伤信号传导和/或修复过程的药物。
[0030] 本发明还设及指导患者的常规治疗。本发明还设及选择用于临床试验的患者，所 述临床试验中要特别测试新型DNA损伤治疗剂，例如直接或间接影响DNA损伤和/或DNA损伤 修复的药物对OAC的治疗。
[0031] 本发明和方法使用所保存的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织活检材料，包括 细针抽吸(fine needle aspiration，FNA)W及新鲜/冷冻(FF)组织，进行本发明中所有转 录物的测定，因此与最广泛可得的组织活检材料类型是相容的。可W利用从FF阳组织、新鲜 冷冻组织或储存于溶液例如RN Ala化r蟹中的新鲜组织获得的RNA来确定表达水平。
[0032] 发明详述
[0033] 除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术 人员的通常理解相同的意义。虽然在本发明的实施或测试中可W使用任何与本文描述的那 些类似或等同的方法、装置和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。
[0034] 本申请中所引用的所有出版物、公布的专利文献、W及专利申请表明了本申请所 属领域的技术水平。本文所引用的所有出版物、公布的专利文献、W及专利申请通过引用的 方式合并入本文，其引用程度就如同明确且单独表明每一个单个出版物、公布的专利文献、 或专利申请W引用的方式合并入本文。
[0035] 本文中使用的冠词"一 (a)"和"一 (an)"指一个或超过一个(即至少一个)该冠词的 语法对象。例如，"要素"表示一个要素或超过一个要素，除非明确有相反说明。
[0036] 当前癌症研究工作的主要目标是通过将分子参数结合到临床治疗决策中来增加 患者围术期系统疗法的效力。遗传药理学/基因组学是个体对外来化合物或药物的反应中 所设及的遗传/基因组因素的研究。对本发明的标志物的表达具有刺激或抑制作用的药剂 或调节剂可W被施用给个体W治疗(预防性地或治疗性地）患者的癌症。理想的情况是，还 结合考虑个体的药物基因组学与运种治疗。治疗剂代谢的差异有可能通过改变药理学活性 药物的剂量与血液浓度之间的关系而导致严重毒性或治疗失效。因此，了解个体的药物基 因组学允许选择对预防性或治疗性治疗有效的试剂(例如药物）。运种药物基因组学可W进 一步用于确定合适的剂量和治疗方案。相应地，可W确定本发明的标志物在个体中的表达 水平，W便由此选择适合于个体的治疗性或预防性治疗的一种或多种试剂。
[0037] 本发明设及在特定食道癌组织中表达的基因或基因产物标志物（W下被称为"生 物标志物"）的集合的应用，用于预测对于使用DNA损伤治疗剂进行的治疗的响应性。在不同 的方面，该生物标志物列表可W形成单参数或多参数预测测试的基础，所述单参数或多参 数预测测试可W用本领域已知的方法，例如微阵列、Q-PCR、NGS、免疫组化、ELISA或其它可 W定量mRNA或蛋白质表达的技术来实现。
[0038] 本发明还设及试剂盒和方法，其可用于食道癌（特别是0AC)的细胞毒性化疗之后 的预后或者具体治疗的选择。提供方法，W使得当一些或全部转录物过表达或低表达时，表 达谱表明对DNA损伤治疗剂有响应性或抵抗。运些试剂盒和方法利用在食道腺癌(OAC)患者 的肿瘤中差异表达的基因或基因产物标记物。在本发明的一个实施方案中，在统计学方法 或关联模型下，将所保存的组织样品中的运些生物标志物的表达谱与临床结果（响应或生 存率)相关联，W产生将表达谱与对一种或多种DNA损伤治疗剂的响应性相关联的数据库或 模型。预测模型然后可用于在对DNA损伤治疗剂的响应性未知的患者中预测响应性。在许多 其它的实施方案中，可基于患者的临床结果、预后或对DNA损伤治疗剂的响应性将患者群分 为至少两类，且生物标志物与运些类患者之间的类差异大体上相关联。本文所描述的生物 途径已表明可W预测对于用DNA损伤治疗剂对OAC进行的治疗的响应性。
[0039] 预测标志物套组/表达分类器
[0040] 提供了在食道癌/OAC组织中表达的作为基因分类器的生物标志物的集合，它可用 于确定对用于治疗食道癌/OAC的治疗剂例如DNA损伤治疗剂的响应性或抵抗。运种集合可 被称为"标志物套组"、"表达分类器"或"分类器"。该集合在表1中显示。该集合是来自于表1A和IB中所示的原始生物标志物集合(参见WO 2012/037378)，所述原始生物标志物集合然 后被对应到OAC相关的平台上（参见本文的实施例）。分类器例如表2B所示的44基因分类器 的应用允许确定OAC患者对于DNA损伤治疗剂的响应性。本发明可W包括确定运些基因或祀 序列的任何一个或多个的表达水平。
[0041] 因此鉴别了在本方法中有用的生物标志物，见表1-4。运些生物标志物被鉴别为对 于确定患者(患有0AC)对治疗剂有响应或无响应具有预测价值。它们的表达与对药剂(更具 体地，对DNA损伤治疗剂）的响应相关。通过在食道肿瘤(特别是腺癌或鱗状细胞癌）中检查 所鉴别生物标志物的集合的表达，能够确定哪种治疗剂或试剂的组合最有可能降低癌症的 生长速度，在一些实施方案中，所述癌症为OAC细胞。通过检查所鉴别的转录基因或基因产 物标志物的集合，能够确定哪种治疗剂或剂的组合最不可能降低癌症的生长速度。通过检 查生物标志物的集合的表达，从而能够排除无效的或不合适的治疗剂。重要的是，在特定的 实施方案中，可W逐个患者地或逐个试剂地进行运种确定。因此，可W确定特定的治疗方案 是否可能使特定的患者或患者类型受益，和/或特定的方案是否应当继续。
[0042] 表1A-在乳腺癌中测试并对应到OAC(通过Xcel阵列）的基因的原始列表
[0043]
[004引
[0049]表1B-在乳腺癌中测试并对应到OAC(通过Xcel阵列）的基因的原始列表 [(K)加 ]
[0化1]表1A和/或IB和/或3中所列的全部或部分生物标志物都可W用在预测生物标志物 套组中。例如，可W使用本文提供的方法产生生物标志物套组，所述生物标志物套组选自表 IA和/或IB和/或3中的生物标志物，其可W包含表1A和/或IB和/或3中所示的一个至全部生 物标志物，W及它们之间的每一个和所有的组合(例如四个选定的生物标志物、16个选定的 生物标志物、74个选定的生物标志物等）。在一些实施方案中，预测生物标志物集包含至少 5、10、20、40、60、100、150、200或300或更多个生物标志物。在其它实施方案中，预测生物标 志物集包含不超过5、10、20、40、60、100、150、200、300、400、500、600或700个生物标志物。在 一些实施方案中，预测生物标志物集包括表1A和/或IB和/或3中所列的多个生物标志物。在 一些实施方案中，预测生物标志物集包括表1A和/或IB和/或3中所列的生物标志物的至少 约1 %、约 5%、约 10%、约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%、约 80%、约 90%、约 95%、约96%、约97%、约98%或约99%。选定的预测生物标志物集可利用本文所述的方法 和本领域中已知的类似方法由所提供的预测生物标志物汇集。在一个实施方案中，生物标 志物套组含有表1中的全部50个生物标志物或表3中所列的全部生物标志物。在另一个实施 方案中，生物标志物套组相应于表2A或2B中的40或44个生物标志物。
[0052] 可结合不同量度的实际标度上的相应的标量权重来确定预测生物标志物集，通过 线性或非线性的、代数的、=角学的或相关的方法经由代数算法、统计学习算法、贝叶斯算 法、回归算法或相似的算法将其进一步组合为单一标量值，连同标量值的数学推导的决策 函数一起提供预测模型，来自样品的表达谱通过所述预测模型可被解析为对于特定药物或 药物类别响应者或无响应者、抵抗或不抵抗的不连续的类。运种预测模型，包括生物标志物 成员，是在交叉验证、自助法或类似的取样技术下，由来自具有已知药物响应和/或抵抗或 者具有已知分子亚型（即孤RD)分类的既往患者样品的一组代表性表达谱，通过学习权重和 决策阔值而开发的，并对灵敏度、特异性、阴性和阳性预测值、风险比或它们的任何组合进 行优化。
[0053] 在一个实施方案中，生物标志物用于形成它们的信号的加权和，其中单个的权重 可W是正的或负的。将所得的和（"决策函数"）与预定的参考点或值相比较。与参考点或值 的比较可用于诊断或预测临床病况或结果。
[0054] 如上所述的，本领域普通技术人员将理解，表1A和/或IB和/或3提供的分类器中包 括的生物标志物在治疗剂的响应性或抵抗分类器中具有不同的权重。因此，虽然可仅用一 个序列来诊断或预测结果例如对于治疗剂的响应性，利用更多序列可提高特异性和灵敏度 或诊断或预测准确度。
[0055] 如本文所用的，术语"权重"指统计计算中项目的相对重要性。每个生物标志物在 基因表达分类器中的权重可利用本领域已知的分析方法根据患者样品的数据集来确定。可 W应用基因特定偏差值(Gene specific bias values)。可能需要基因特定偏差值来表示 分类器中每一个基因相对于训练数据集的中屯、，如本领域技术人员所能理解的。特定偏差 值显示在表4中，并且可W根据本发明的方法和试剂盒被应用。
[0化6] 在一个实施方案中，生物标志物套组设及表2A中详列的40个生物标志物，相应的 排序和权重详列于表中，或者可供选择的排序和权重取决于，例如，疾病情况。在另一个实 施方案中，生物标志物套组设及表2B中详列的44个生物标志物，相应的排序和权重详列于 表中，或者可供选择的排序和权重取决于，例如，疾病情况。表2A和2B将生物标志物W在分 类器中权重降低的顺序进行排序，确定为在交叉验证下测量的综合决策得分函数中的平均 权重的排序。在另一个方案中，生物标志物套组设及表4中详列的44个生物标志物，相应的 排序、权重和偏差详列在表中，或者可供选择的排序、权重和偏差取决于，例如，疾病情况。 [0057]表2A
[0化引具有相关排序和权重的40-基因孤畑分类器模型的基因 ID和化trezGene ID [0化9]
[0060]
[0061] 表 2B
[0062] 具有相关排序和权重的44-基因孤畑分类器模型的基因 ID和化trezGene ID
[0063]
[0064]
[0065] 表3显示了来自Xcel Array(Almac)的探针集，其代表了表2A和2B中的基因，并给 出了它们的序列ID编号。
[0066] 表3-对应到Xcel平台的44-基因标签中含有的基因的祀序列的探针集ID和SEQ号
[0076]
[0077] 在不同的实施方案中，表1A和/或IB、表2A和/或表2B和/或表3和/或4中所列的生 物标志物的子集可用于本文所述的方法中。运些子集包括但不限于在表2A或表2B中排序为 1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-44、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、 36-40、36-44、11-20、21-30、31-40和31-44的生物标志物。
[0078] 在一方面，通过在来自个体的测试(生物)样品上进行测定并检测生物标志物值， 在个体中预测治疗响应性，所述生物标志物值的每一个对应于生物标志物GBP5XXCL10、 IDOl和MXl中的至少一个，W及选自表2B中的生物标志物的列表的至少N个另外的生物标志 物，其中 N 等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。如本文所使用的，术语"生物标志物"可指基因、 mRNA、cDNA、反义转录物、miRNA、多肤、蛋白、蛋白片段或指示基因表达水平或蛋白产生水平 的任何其他核酸序列或多肤序列。在一些实施方案中，当提到生物标志物CX化10、IDOl、 CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、AP0L3、CDRl、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRBl4、 AC138128.1、KIF26A、CD274、ETV7、MFAP5、0LFM4、PI15、F0SB、FAM19A5、r^LRC5、PRICKLEl、 EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、0R2I1P、EGFR、NAT1、LATS2、 CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A 或 AL137218.1时，所述生物标志物分别包含 CX 化 10、ID01、CD2、 GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、AP0L3、CDRl、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、 KIF26A、CD274、ETV7、MFAP5、0LFM4、P115、FOSB、FAMl9A5、NLRC5、PRICKLE1、EGRl、CLDNl0、 ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESRl、IKZF3、0R211P、EGFR、MT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、 PPP1R1A或AL137218.1的mRNA。在进一步的或其它的实施方案中，当提到生物标志物MXl、 GBP5、IFI4化、BIRC3、IGJ、IQGAP3、L0C100294459、SIX1、SLC9A3R1、STAT1、T0B1、U抓、C1QC、 C2orfl4、EPSTI、GALNT6、HISTlH4H、HIST2H4B、KIAA1244、L0C100287927、L0C100291682或 L0C100293679时，所述生物标志物分别包含MX1、IFIML、GBP5、BIRC3、IGJ、IQGAP3、 L0C100294459、SIXl、aX9A3Rl、STATl、T0Bl、UBD、ClQC、C2orfl4、EPSTI、GALNT6、HISTlH4H、 阳512拟8、1(1441244、11)(：100287927、11)(：100291682或11)(：100293679的反义转录物。
[0079] 在另一方面，通过在来自个体的测试（生物）样品上进行测定并检测生物标志物 值，在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断，所述生物标志物值的每一个对应于生物标 志物GBP5、CX化10、ID(n和MX1，和选自表2B中的生物标志物的列表的至少N个另外的生物标 志物其中之一，其中 N 等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。在进一步的方面，通过在来自个体的测 试(生物)样品上进行测定并检测生物标志物值，在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊 断，所述生物标志物值的每一个对应于生物标志物GBP5和选自表2B中的生物标志物的列表 的至少N个另外的生物标志物其中之一，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、：34、35、36、37、38 或 39。在进 一步的方面，通过在来自个体的测试(生物)样品上进行测定并检测生物标志物值，在个体 中预测治疗响应性或指示癌症诊断，所述生物标志物值的每一个对应于生物标志物CX化10 和选自表2B中的生物标志物的列表的至少N个另外的生物标志物其中之一，其中N等于2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38或39。在进一步的方面，通过在来自个体的测试(生物)样品上进 行测定并检测生物标志物值，在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断，所述生物标志物 值的每一个对应于生物标志物IDOl和选自表2B中的生物标志物的列表的至少N个另外的生 物标志物其中之一，其中 N 等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、：34、35、36、37、38 或 39。在进一步的方面，通过 在来自个体的测试(生物)样品上进行测定并检测生物标志物值，在个体中预测治疗响应性 或指示癌症诊断，所述生物标志物值的每一个对应于生物标志物MX-I和选自表2B中的生物 标志物的列表的至少N个另外的生物标志物其中之一，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38或39。
[0080] 在进一步的方面，通过在来自个体的测试(生物)样品上进行测定并检测生物标志 物值，在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断，所述生物标志物值的每一个对应于生物 标志物CX化10、1乂1、100巧日^14化中的至少两个和选自表28中的生物标志物的列表的至少 N 个另外的生物标志物，其中 N 等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40。在进一步的方 面，通过在来自个体的测试(生物)样品上进行测定并检测生物标志物值，在个体中预测治 疗响应性或指示癌症诊断，所述生物标志物值的每一个对应于生物标志物CX化10、MX1、 IDOl和IFI4化和选自表2B中的生物标志物的列表的至少N个另外的生物标志物其中之一， 其中 N 等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在进一步的方面，通过在来自个体的测 试(生物)样品上进行测定并检测生物标志物值，在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊 断，所述生物标志物值的每一个对应于生物标志物CX化10和选自表2B中的生物标志物的列 表的至少N个另外的生物标志物其中之一，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、：34、35、36、37、38、39、 40、41、42或43。在进一步的方面，通过在来自个体的测试(生物)样品上进行测定并检测生 物标志物值，在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断，所述生物标志物值的每一个对应 于生物标志物MXl和选自表2B中的生物标志物的列表的至少N个另外的生物标志物其中之 一，其中 N 等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在进一步的方面，通过在 来自个体的测试(生物)样品上进行测定并检测生物标志物值，在个体中预测治疗响应性或 指示癌症诊断，所述生物标志物值的每一个对应于生物标志物IDOl和选自表2B中的生物标 志物的列表的至少N个另外的生物标志物其中之一，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42或43。在进一步的方面，通过在来自个体的测试(生物)样品上进行测定 并检测生物标志物值，在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断，所述生物标志物值的每 一个对应于生物标志物IFI4化和选自表2B中的生物标志物的列表的至少N个另外的生物标 志物其中之一，其中 N 等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、：34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。
[0081] 在其它的实施方案中，表1A、1B和/或3中所列的祀序列，或其子集，可用于本文所 述的方法中。可W为设计与祀序列杂交的引物和/或探针的目的使用运些祀序列。一旦鉴别 了祀序列，合适的引物和/或探针的设计在本领域技术人员的能力之内。可W自由获得各种 引物设计工具W帮助进行该过程，例如NCBI Primer-BLAST工具；参见Ye et al，BMC Bioinformatics. 13:134(2012)。可W设计引物和/或探针W使得它们在严谨条件(如本文 所定义的）下与祀序列杂交。引物和/或探针的长度可W是至少15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24或25(或更多)个核巧酸。应当理解，每一个子集可W包括针对相同生物标志物的多个 引物和/或探针。运些表显示在某些情况下，在同一个完整基因内存在多个祀序列。运些引 物和/或探针可W被包括在用于实施本发明方法的试剂盒中。试剂盒可W是例如基于阵列 或PCR的试剂盒，并且可W包括另外的试剂，例如聚合酶和/或dNTPs。
[00剧利用分类器模型测量基因表达
[0083] 已使用多种方法试图鉴别生物标志物和诊断疾病。对于基于蛋白的标志物，运些 方法包括双向电泳、质谱测定法和免疫测定方法。对于核酸标志物，运些方法包括mRNA表达 谱、微小RNA谱、测序、FISH、基因表达系列分析(SAGE)、甲基化谱和大型基因表达阵列。
[0084] 当生物标志物在个体中指示异常过程、疾病或其它病况或作为它们的标志时，与 在个体中指示正常过程、无疾病或其它病况或作为它们的标志的生物标志物的表达水平或 值相比较，该生物标志物通常被描述为过表达的或低表达的。"上调"、"上调的"、"过表达"、 "过表达的"和它们的任何变化形式可互换使用，指高于在健康或正常个体的类似生物样品 中通常检测到的生物标志物的值或水平(或值或水平的范围）的生物样品中的生物标志物 的值或水平。该术语还可指高于在特定疾病的不同阶段可检测到的生物标志物的值或水平 (或值或水平的范围）的生物样品中的生物标志物的值或水平。
[0085] "下调"、"下调的"、"低表达"、"低表达的"和它们的任何变化形式可互换使用，指 低于在健康或正常个体的类似生物样品中通常检测到的生物标志物的值或水平(或值或水 平的范围）的生物样品中的生物标志物的值或水平。该术语还可指低于在特定疾病的不同 阶段可检测到的生物标志物的值或水平(或值或水平的范围）的生物样品中的生物标志物 的值或水平。
[0086] 进一步，与在个体中指示正常过程或无疾病或其它病况或作为它们的标志的生物 标志物的"正常"表达水平或值相比较，过表达的或低表达的生物标志物还可被称作"差异 表达的"或被称作具有"差异水平"或"差异值"。因此，生物标志物的"差异表达"还可称作生 物标志物的"正常"表达水平的变化形式。
[0087] 术语"差异生物标志物表达"和"差异表达"可互换使用，指运样的生物标志物，相 对于它在正常受试者中的表达，或相对于它在对特定治疗具有不同响应的患者或在具有不 同预后的患者中的表达，在患有特定疾病的对象中它的表达被激活至较高或较低水平。该 术语还包括其表达在相同的疾病的不同的阶段被激活至较高或较低水平的生物标志物。还 应当理解的是，差异表达生物标志物可在核酸水平或蛋白质水平上被激活或被抑制，或可 经受可变剪接W产生不同的多肤产物。运种差异可通过多种改变，包括mRNA水平、miRNA水 平、反义转录物水平或蛋白表面表达、分泌或多肤的其他划分来证实。差异生物标志物表达 可包括两个或更多个基因或它们的基因产物之间的表达的比较;或两个或更多个基因之间 或它们基因产物之间的表达比率的比较;或甚至相同基因的两个不同加工产物的比较，其 在正常受试者和患病受试者之间是不同的；或在相同疾病的不同阶段是不同的。差异表达 包括例如在正常细胞和病态细胞中或在经历不同的疾病事件或疾病阶段的细胞中的生物 标志物中的瞬时表达模式或细胞表达模式中的定量和定性的差异。
[0088] 在特定的实施方案中，所获得的表达谱是基因组或核酸表达谱，其中样品中的一 种或多种核酸的量或水平被确定。在运些实施方案中，被测定W产生诊断或预后方法中所 用的表达谱（即测量样品中一个或多个生物标志物的表达水平)的样品包含核酸样品。核酸 样品包括核酸群体，所述核酸群体包括被分析的细胞或组织的表型决定生物标志物的表达 信息。在一些实施方案中，核酸可W包括RNA或DNA核酸，例如，mRNA、CRNA、CDNA等，只要该样 品保留了获得它的宿主细胞或组织的表达信息。样品可W本领域中已知的多种不同的方法 来制备，例如，通过从细胞分离mRNA，其中分离的mRNA被分离的、扩增，或用来制备CDNA、 CRNA等，如差异基因表达领域已知的。相应地，确定样品中mRNA的水平包括从mRNA制备CDNA 或cRNA，然后测量CDNA或cRNA。通常从由需要治疗的受试者中收获的细胞或组织来制备样 品，例如通过组织活检，使用标准方案，其中可W产生运种核酸的细胞类型或组织包括其中 存在待确定表型的表达模式的任何组织，包括，但不限于，疾病细胞或组织、体液等。
[0089] 可利用任何常规方案从初始核酸样品中产生表达谱，该表达谱代表了测试样品中 一个或多个生物标志物的测量的表达水平。虽然已知多种不同的产生表达谱的方式，例如 在差异基因表达/生物标志物分析领域中所使用的那些，产生表达谱的一个代表性的和方 便类型的方案是基于阵列的基因表达谱产生方案。运种应用是杂交测定，其中使用表面例 如(玻璃)忍片，针对数千基因的每一个的几个探针被固定在其上。在运些表面上通常在每 一个待分析的基因中存在多个祀区域，并且每个祀区域存在多个探针(通常是从11到100 个）。运样，通过与该表面上的多个(数十个)探针的杂交评价每一个基因的表达。在运些测 定中，首先从被测定的初始核酸样品中制备祀核酸的样品，其中制备可W包括用标记物标 记祀核酸，所述标记物例如是信号产生系统的成员。制备祀核酸样品后，在杂交条件下使样 品与阵列相接触，从而在与附着于阵列表面的探针序列互补的祀核酸之间形成复合物。然 后定性地或定量地检测杂交复合物的存在。可被实施W产生主题方法中所使用的表达谱的 特定的杂交技术包括在下述文献中描述的技术:美国专利Nos.5143854、5288644、5324633、 5432049、5470710、5492806、5503980、5510270、5525464、5547839、5580732、5661028、 5800992;通过引用将其公开内容合并入本文；W及WO 95/21265、W0 96/31622、W0 97/ 10365、W0 97/27317、EP 373203和EP 785280。在运些方法中，使"探针"核酸阵列与上述的 祀核酸接触，所述"探针"核酸阵列包括其表达待测定的每一个生物标志物的探针的一个或 几个探针。接触在杂交条件，例如上述的严谨杂交条件下进行，然后除去未结合的核酸。所 得的杂交核酸的模式提供了有关已被探针杂交的每一个生物标志物的表达的信息，其中表 达的信息是基因是否被表达，W及，且通常W何种水平表达，其中表达数据，即表达谱，可W 同时是定性的和定量的。该方法可W包括相对于该阵列中所有其它探针子集标准化该杂交 模式。
[0090] 产生生物标志物表达分类器
[0091] 在一个实施方案中，测量癌症组织中的生物标志物的相对表达水平，W形成基因 表达谱。W综合决策得分(或测试得分）的形式，总结来自患者组织样品的生物标志物的集 合的基因表达谱，并与从患者数据的训练集中数学推导的得分阔值相比较。得分阔值根据 不同的特征将患者组分开，所述特征例如但不限于，对治疗的响应性/非响应性。患者训练 集数据优选地来源于已由预后、复发可能性、长期存活、临床结果、治疗响应、诊断、癌症分 类或个体化的基因组谱表征的OAC组织样品。或者，它可W代表来自分子亚型(孤RD)已得到 良好定义和表征的患者群体的数据集。来自患者样品的表达谱和相应的决策得分(测试得 分)可W与位于数学推导的得分决策阔值的同侧的训练集中的患者样品的特征相关联。可 W优化线性分类器标量输出的阔值W使如在训练数据集中所观察到的交叉验证下的灵敏 度与特异性之和最大化。可选地，根据在不同的疾病适应症中所述测试的建议的临床可用 性，可WW特异性W及阴性预测值为代价来提高测定的灵敏度和阳性预测值，或者反之。
[0092] 利用本领域技术人员已知的方法对给定样品的整体表达数据进行标准化，W校正 起始物质的不同量、提取和扩增反应的不同效率等。利用基于标准化数据的线性分类器来 有效地形成诊断或预后描述(例如，对于治疗剂的响应性或抵抗)意味着通过分离超平面的 方式将数据空间，即分类器中全部基因的表达值的所有可能的组合，分割为分开的两半。该 分割可W基于一大组训练实例凭经验来获得，所述训练实例例如来自对治疗剂表现出响应 性或抵抗的患者。不失一般性地，对于除一个生物标志物W外的全部生物标志物可假定某 一固定组的值，其将自动定义关于该其余生物标志物的阔值，其中决策由，例如，对治疗剂 的响应性或抵抗而改变。然后，高于该动态阔值的表达值将指示抵抗(对于具有负权重的生 物标志物)或响应性(对于具有正权重的生物标志物）。该阔值的精确值取决于分类器中所 有其它生物标志物的实际测量表达谱，但某些生物标志物的通用指示仍然是固定的，即，高 的值或"相对过表达"通常有助于响应性(具有正权重的基因）或抵抗(具有负权重的基因）。 因此，在整体基因表达分类器中，相对表达可W指示特定生物标志物的上调或下调是否代 表对治疗剂的响应性或抵抗。
[0093] 在一个实施方案中，通过线性分类器评价测试样品，例如患者组织样品的生物标 志物表达谱。如本文所使用的，线性分类器指单独的生物标志物强度的加权和形成综合决 策得分（"决策函数"）。然后将该决策得分与预定的截断得分阔值相比较，所述预定的截断 得分阔值对应于按灵敏度和特异性方式的特定设定点，该设定点指示是否样品高于得分阔 值(决策函数为正)或低于得分阔值(决策函数为负）。
[0094] 实际上，运意味着数据空间，即，生物标志物表达值的所有可能的组合的集，被分 割为对应于不同的临床分类或预测的互斥的两半，例如，一个对应于对治疗剂的响应性，另 一个对应于抵抗。在整体分类器中，某些生物标志物的相对过表达可提高决策得分(正权 重)或降低决策得分(负权重），且因此有助于整体决策，例如，对治疗剂的响应性或抵抗的 整体决策。
[0095] 术语"曲线下面积"或"AUC'指受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积，运二者都 是本领域中熟知的。AUC测量对于在全部数据范围上比较分类器的准确度是有用的。具有较 高AUC的分类器具有更大的能力在两个目标组(例如，OAC癌症样品和正常样品或对照样品） 对未知项进行正确的分类。ROC曲线对于在两个群体(例如，对治疗剂响应和无响应的个体） 之间进行区别时描绘特定特征(例如，本文所述的任何生物标志物和/或另外的生物医学信 息的任何条目）的性能是有用的。通常，W单个特征的值为基础W升序顺序对整个群体(例 如，病例和对照)特征数据进行排序。然后，对于该特征的每个值，计算数据的真阳性和假阳 性率。通过对高于该特征的值的病例的数量进行计数并除W病例总数来确定真阳性率。通 过对高于该特征的值的对照的数量进行计数并除W对照总数来确定假阳性率。虽然该定义 指与对照相比较在病例中特征是升高的情况，该定义还应用于与对照相比较在病例中特征 较低的情况(在该情况中，将对低于该特征的值的样品进行计数）。可W对单一特征W及对 其它单一输出产生ROC曲线，例如，两个或更多个特征的组合可用数学方法结合(例如，相 加、相减、相乘等）W提供单一的总和值，并且该单一的总和值可绘制于ROC曲线中。此外，多 个特征的任意组合，其中该组合源自于单一的输出值，可绘制于ROC曲线中。特征的运些组 合可包括测试。ROC曲线是测试的真阳性率(灵敏度)相对于测试的假阳性率（I-特异性）的 图。
[0096] 对于该量，即，对治疗剂的截断阔值响应性或抵抗的解释，是在发展阶段（"训练"） 源自于具有已知结果的患者的集。决策得分的相应权重和响应性/抵抗截断阔值通过本领 域技术人员已知的方法由训练集先验地固定。在本方法的优选实施方案中，使用偏最小二 乘法判别分析（PLS-DA)来确定权重。（L. S 巧 hie,S. WoldJ.畑 emom. 1(1987) 185-196; D.V.Nguyen,D.M.Rocke ,Bioinformatics 18(2002)39-50)。本领域技术人员已知的用于进 行分类的其他方法也可与本文所述的方法一起使用，例如当应用于食道癌(OAC)分类器的 转录物时。
[0097] 可使用不同的方法将在运些生物标志物基础上测量的定量数据转换为预后或其他 预测用途。运些方法包括，但不限于来自模式识别(Duda et al.化ttern Classification,2nd ed., John Wiley,New York 2001)，机器学习 （SchSlkopfet al.Learning with Kernels,MIT Press , Cambridge 2002, Bi shop , Neural Networks for Pattern Recognition,Clarendon Press ,Oxford 1995)，统计学（Hastie et al. The Elements of Statistical Learning,Springer,New York 2001)，生物信息学（Dudoit et al.,2002, J.Am.Statist.Assoc.97:77-87,Tibshirani et al.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99: 6567-6572)或化学计量学（Vandeginste,et al.,Handbook of 化emometrics and 如alimetrics,Part B,Elsevier,Amsterdam 1998)领域的方法。
[0098] 在训练步骤中，对于响应性/抵抗病例二者测量一组患者样品，并利用来自该训练 数据的固有信息优化预测方法，W最佳地预测训练集或未来的样品集。在该训练步骤中，所 用方法被训练或被参数化，W从特定强度类型预测特定预测描述。在其被用于预后方法或 算法之前，可用测量的数据进行适当的转化或预处理步骤。
[0099] 在本发明的优选实施方案中，对于每个转录物形成预处理强度值的加权和，并将 其与基于训练集优化的阔值相比较(Duda et al.Pattern Classification,2nd ed.,John Wiley,化W York 2001)。可W通过多种线性分类方法获得权重，包括但不限于偏最小二乘 法（PLS, (Nguyen et al.，2002，Bioinformatics 18(2002)39-50))或支持向量机（SVM，（ Scholkopfet al ?Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002))。
[0100] 在本发明的另一个实施方案中，在应用于上述的加权和之前将数据转化为非线性 的。该非线性转化可W包括增加数据的维数。该非线性转化和加权和可W隐式地进行，例如 通过使用核函数（Schdlkopf et al 丄earning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002)O
[0101] 在本发明的另一个实施方案中，将新数据样品与作为真实测量的训练样品或人工 产生的原型的两种或更多种原型相比较。该比较利用适当的相似方式来进行，例如，但不限 于，欧几里德距离（Duda et al.Pattern Classification,2nd ed.,John Wiley,化W York 2001)，相关系数(化n't Veer,et al.2002,化化re 415:530)等。然后将新样品分配到具有 最接近的原型或在附近具有最高数量原型的预后组。
[0102] 在本发明的另一个实施方案中，使用决策树(化Stie et al. ,The Elements of Statistical Learning , Springer ,New York 2001)或随机森林（Breiman ,Random 化rests,Machine Learning 45:5 2001)从转录物集或它们的产物的测量强度数据生成预 后描述。
[0103] 在本发明的另一个实施方案中，使用神经网络（Bishop,Neural Networks for Pattern Reco即ition,Clarendon Press,Oxford 1995)从转录物集或它们的产物的测量 强度数据生成预后描述。
[0104]在本发明的另一个实施方案中，使用判别分析（Duda et al . ,Pattern Classification,2nd ed.,John Wiley,New York 2001)，其包括但不限于线性分析、对角线 性分析、二次判别分析和逻辑判别分析，从转录物集或它们的产物的测量强度数据生成预 后描述。
[0105]在本发明的另一个实施方案中，使用微阵列预测分析(PAM, (TibsMrani et al.， 2002 ,Proc.化tl. Acad. Sci .USA 99:6567-6572))从转录物集或它们的产物的测量强度数 据生成预后描述。
[0106] 在本发明的另一个实施方案中，使用类比软独立建模分类法(SIMCA，（Wold, 1976， 化ttern Recogn.8:127-139))从转录物集或它们的产物的测量强度数据生成预后描述。
[0107] 在本发明的另一个实施方案中，使用C-指数对预测能力进行定量。该指数使用针 对可检查的连续响应变量的生物标志物。C指数是所有的受试者对的比例，所述受试者的生 存时间可W进行排序，W使得具有较高预测生存率的受试者是生存时间较长的受试者。如 果两个受试者都被检查或者如果一个受试者失败而另一个受试者的随访时间少于第一个 受试者的失败事件，则两个受试者的生存时间不能被排序。C指数是预测的和观察的生存率 之间的吻合概率，对于随机预测来说C = 0.5,对于完美判别模型来说C = I。（Frank E.Harrell,Jr.Regression Modeling Strategies,2001)。
[0刪治疗剂
[0109] 如上所述，本文所述的方法允许将患有OAC(包括早期OAC)的患者分类为对治疗剂 (下文称作"DNA损伤治疗剂"）响应或无响应，所述治疗剂祀向具有异常DNA修复的肿瘤。如 本文所使用的，"DNA损伤治疗剂"包括已知直接损伤DNA的剂，阻止DNA损伤修复的剂，抑制 DNA损伤信号传导的剂，抑制DNA损伤诱导的细胞周期停滞的剂和抑制间接导致DNA损伤的 过程的剂。目前一些用来治疗OAC的运种治疗剂包括，但不限于，下述DNA损伤治疗剂。
[0110] 1)DNA 损伤剂：
[0111] a.烧化剂(含销的剂，例如顺销、卡销和奥沙利销;环憐酷胺；白消安）。
[0112] b.拓扑异构酶I抑制剂(伊立替康;托泊替康）
[0113] C.拓扑异构酶II抑制剂(依托泊巧;蔥环类例如阿霉素和表阿霉素）
[0114] d.电离福射
[0115] 2) DNA修复祀向疗法
[0116] a.非同源末端连接抑制剂(DNA-PK抑制剂、Nu7441、NU7026)
[0117] b.同源重组抑制剂
[0118] C.核巧酸切除修复抑制剂
[0119] d.碱基切除修复抑制剂(PARP 抑制剂、46014699、4202281、481'-888、]\?4827、851-201、INO-IOOl、TRC-102、APEX 1抑制剂、APEX 2抑制剂、连接酶HI抑制剂
[0120] e.范可尼贫血途径抑制剂
[0121] 3)DNA损伤信号传导的抑制剂
[0122] 3.4了]\1抑制剂化?466722)
[0123] b.C服l抑制剂（Xレ844，UCN-01、AZD7762、PF00477736)
[0124] 。.(：服2抑制剂村心844、4207762、？。00477736)
[0125] d.ATR抑制剂(AZ20)
[0126] 4)DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂
[0127] a.Weel激酶抑制剂
[0128] b.CDC25a、b或 C抑制剂
[0129] 5)对间接导致DNA损伤的过程的抑制
[0130] a.组蛋白脱乙酷酶抑制剂
[0131 ] b.热休克蛋白抑制剂(格尔德霉素、AUY922)，
[0132] 6) DNA合成的抑制剂：
[0133] a.喀晚类似物(5-FU、吉西他滨）
[0134] b.前药(卡培他滨）
[0135] 如上所述，对其响应性被预测的治疗剂可用于肿瘤辅助疗法中。但是，它们在辅助 疗法中可W另外地或替代性地使用。
[0136] 本文所述的本发明不限于任何一种DNA损伤治疗剂，它可用于鉴别对多种DNA损伤 治疗剂的任一种的响应或无响应者，所述DNA损伤治疗剂例如那些直接或间接影响DNA损伤 和/或DNA损伤修复的。在一些实施方案中，DNA损伤治疗剂包含一种或多种选自由W下各项 组成的组的物质:DNA损伤剂、DAN修复祀向疗法、DNA损伤信号传导的抑制剂、DNA损伤诱导 的细胞周期停滞的抑制剂、组蛋白脱乙酷酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂和DNA合成抑制剂。 更特别地，DNA损伤治疗剂可W选自一种或多种含销试剂、核巧类似物例如吉西他滨或5-氣 脈喀晚或其前药例如卡培他滨、蔥环类例如表阿霉素或阿霉素、烧化剂例如环憐酷胺、电离 福射或（电离)福射和化疗的组合(放化疗）。在特定的实施方案中，DNA损伤治疗剂包括含销 试剂，例如选自顺销、卡销、奥沙利销的基于销的试剂。该方法和试剂盒可W预测对于用DNA 损伤剂与其它疗法(例如放疗)或药物一起进行的治疗的响应性。因此，该方法和试剂盒可 W预测对于组合疗法的响应性。在一些实施方案中，其它药物是有丝分裂抑制剂。有丝分裂 抑制剂可W是长春花生物碱或紫杉烧。在特定的实施方案中，长春花生物碱是长春瑞滨。在 其它实施方案中，紫杉烧是紫杉醇或多西紫杉醇。在特定的实施方案中，鉴别在OAC的治疗 中对下述治疗有响应者:顺销/卡销和5-氣脈喀晚(CF)，顺销/卡销和卡培他滨(CX)，表阿霉 素/阿霉素、顺销/卡销和氣脈喀晚巧CF),表阿霉素/阿霉素、奥沙利销和卡培他滨巧OX)，W 及与紫杉醇、伊立替康和长春瑞滨的组合，使用或不使用紫杉烧的放疗或放化疗。
[0。7] 疾病和组织来源
[0138] 本文所述的预测分类器对于确定对治疗食道癌(特别是0AC)的治疗剂的响应性或 抵抗是有用的。食道癌典型地是食道腺癌(OAC)并且可W是早期的。
[0139] 在一个实施方案中，本文所述的方法指用下列种类的化疗剂治疗的OACs = DNA损伤 审IJ剂、DNA修复祀向疗法、DNA损伤信号传导的抑制剂、DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制 剂和间接导致DNA损伤的过程的抑制，但不限于运些种类。运些化疗剂中的每一种被认为是 如本文所用的术语"DNA损伤治疗剂"。
[0140] "生物样品"、"样品"和"测试样品"在本文中可W互换使用，指从个体获得或用其 他方式取得的任何物质、生物流体、组织或细胞。其包括血液(包括全血、白血球、外周血单 核细胞、血沉栋黄层、血浆和血清）、疲液、泪液、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、呼吸样、尿液、精 液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋己液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑膜液、关节抽吸物、腹 水、细胞、细胞提取物和脑脊液。其还包括上述全部的实验分离的级分。例如，血液样品可分 级为血清或含特定类型的血细胞的级分，例如红细胞或白细胞（白血球）。如果需要，样品可 W是来自个体的样品的组合，例如组织和流体样品的组合。术语"生物样品"还包括含均质 固体物质的物质，例如来自粪便样品、组织样品或组织活检的物质。术语"生物样品"还包括 来源于组织培养或细胞培养的物质。可W使用用于获得生物样品的任何适当的方法;示例 性的方法包括，例如，静脉切开术、擦拭(例如，口腔擦拭），和细针穿刺活检过程。在一些实 施方案中，还可通过内窥镜检查获得样品。从个体获得或来源于个体的"生物样品"包括在 从个体获得之后已W任何适当的方式处理的任何运样的样品。
[0141] 在运种的情况下，祀细胞可W是肿瘤细胞，例如OAC细胞。祀细胞来源于任何组织 来源，包括人和动物组织，例如但不限于，新获得的样品、冷冻样品、活检样品、体液样品、血 样、保存的组织例如石蜡包埋固定的组织样品（即组织块)或细胞培养物。
[0142] 在一些特定的实施方案中，样品可W包含或可W不包含囊泡。
[01创方法和试剂盒
[0144] 用于基因表达分析的试剂盒
[0145] 用于进行本文所述的方法的试剂、工具和/或说明书可在试剂盒中提供。例如，试 剂盒可W含有用于确定食道癌癌症患者的适合疗法的试剂、工具和说明书。运种试剂盒可 W包括用于从患者收集，例如通过活检收集组织样品的试剂，和用于处理该组织的试剂。试 剂盒还可包括用于进行生物标志物表达分析的一种或多种试剂，例如用于进行核酸扩增， 包括RT-PCR和qPCR、NGS、RNA印迹、蛋白质组分析或免疫组化W确定患者的样品中的生物标 志物的表达水平的试剂。例如，运种试剂盒中可W包括用于进行RT-PCR的引物，用于进行 RNA印迹分析的探针，和/或用于进行蛋白质组分析例如Western印迹、免疫组化和ELISA分 析的抗体。还可包括用于测定的适合的缓冲液。还可包括运些测定中的任何一种所需的检 测试剂。W下详细描述了适合的试剂和方法。
[0146] 在特定的实施方案中，表14(569 10側：1-24)、18(沈9 10側:25-50)和/或3(569 ID N0:51-230)中所列的祀序列，或它们的子集，可用在本文所述的方法和试剂盒中。可W 为设计与祀序列杂交的引物和/或探针的目的使用祀序列。一旦鉴别了祀序列，适合的引物 和/或探针的设计在本领域技术人员的能力之内。可W自由获得各种引物设计工具，W帮助 进行该过程，例如NCBI Primer-BLAST工具。可W设计引物和/或探针，W使它们在严谨条件 下与祀序列杂交。引物和/或探针可W是长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25 个(或更多个)核巧酸。应当理解，每一个子集可W包括针对同一个生物标志物的多个引物 和/或探针。运些表显示在某些情况下，在同一个完整基因中存在多个祀序列。运些引物和/ 或探针可W被包括在用于实施本发明方法的试剂盒中。该试剂盒可W是例如基于阵列或 PCR的试剂盒，并且可W包括其它试剂，例如聚合酶和/或dNTPs。本文所述的试剂盒还可W 包括描述如何进行用于测量生物标志物表达的测定的说明书。说明书还可包括有关如何确 定参考组群的说明，包括如何确定参考组群中生物标志物的表达水平和如何组合表达数据 W建立用于与测试患者相比较的参考。说明书还可包括用于测定测试患者中的生物标志物 表达和用于将该表达水平与参考组群中的表达相比较从而确定用于测试患者的合适化疗 的说明。W上描述了用于确定合适的方法，且该方法可在说明书中详细描述。
[0147] 试剂盒中包括的信息材料可W是与本文所述的方法和/或用于本文所述的方法的 试剂的用途相关的描述的、指导的、销售的或其它的材料。例如，试剂盒的信息材料可W含 有联系信息，例如，物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中试剂盒的使用者可获得 有关进行基因表达分析和解析结果的大量信息，特别是当应用于可能对特定治疗剂具有响 应的人时。
[0148] 本文所述的试剂盒还可W含有从生物标志物表达推断可能对特定的治疗剂具有 阳性响应的患者所需的软件。
[0149] 在一些实施方案中，该试剂盒可W另外含有在个体被预测为响应的情况下施用的 DNA损伤治疗剂。本文所述的治疗OAC的任何特定试剂或试剂的组合都可W被加入到试剂盒 中。可W W特别为OAC治疗定制的形式，例如剂量形式提供试剂或试剂的组合。试剂盒可W 配有适当的用于根据OAC治疗方案进行施用，例如在肿瘤辅助治疗和/或辅助治疗中使用的 说明。
[0150] a)基因表达谱分析方法
[0151] 在生物样品中测量mRNA可W被用作生物样品中的相应蛋白质水平检测的替代。因 此，本文所述的任何生物标志物或生物标志物套组还可通过检测合适的RNA来检测。基因表 达谱分析的方法包括，但不限于，微阵列、RT-PCT、qPCR、NGS、RNA印迹、SAGE、质谱测定法。
[0152] mRNA表达水平可W通过反转录定量聚合酶链式反应(RT-PCR，然后进行qPCR)来测 量。RT-PCR被用来从mRNA产生cDNAdcDNA可用于qPCR测定W随着DNA扩增过程的进行而产生 巧光。通过与标准曲线的比较，qPCR可产生绝对测量，例如每个细胞的mRNA拷贝数。与毛细 管电泳结合的Nodhern blots、微阵列、侵入测定和RT-PCR均已用于测量样品中的mRNA的 表达水平。参见Gene Expression Prof i 1 in邑：Methods and Protocols , Richard A.Shi址ets,编者，Humana Press,2004。
[0153] miRNA分子是非编码但可调苄基因表达的小RNA。适合测量mRNA表达水平的任何方 法也可用于相应的miRNA。最近许多实验室已研究了 miRNA作为疾病的生物标志物的用途。 许多疾病设及广泛的转录调节，miRNA可能具有生物标志物的作用并不令人惊讶。miRNA浓 度和疾病之间的关联常常不如蛋白质水平和疾病之间的关联那么清楚，然而，miRNA生物标 志物的价值可能是重要的。当然，与疾病过程中差异表达的任何RNA-样，开发体外诊断产 品面临的问题将包括W下要求:miRNA存在于疾病细胞中且易于提取W进行分析，或miRNAs 被释放到血液或其他基质中，它们在那里存在的时间必须足够久W被测量。蛋白质生物标 志物有相似的要求，虽然许多潜在的蛋白质生物标志物在病理位点被有意地分泌，并在疾 病过程中W旁分泌的方式发挥作用。许多潜在的蛋白质生物标志物被设计为在合成那些蛋 白的细胞外发挥作用。
[0154] 基因表达还可利用质谱测定法来评价。多种配置的质谱仪可用于检测生物标志物 的值。可W获得几种类型的质谱仪或者可W用不同的配置来产生几种类型的质谱仪。通常， 质谱仪具有W下主要组件:进样口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统和仪器控制系统 和数据系统。进样口、离子源和质量分析器的差异通常决定了仪器的类型及其性能。例如， 进口可W是毛细管柱液相色谱来源，或可W是直接进样探头或平台，例如基质辅助激光解 吸中所用的。常见的离子源为，例如，电喷雾，包括纳喷雾和微喷雾或基质辅助激光解吸。常 见的质谱仪包括四极滤质器、离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器。其它质谱测定法 是本领域中熟知的（参见BurIingame et al. ,Anal.化em. 70 :647R-716R( 1998);Kinter and Sherman,化W York(2000))。
[01W] 蛋白质生物标志物和生物标志物值可通过任何W下方法来检测和测量：电喷雾电 离质谱法化SI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱测 定法(MALDI-TOF-MS )、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱测定法(沈LDI-TOF-MS )、娃上 的激光解吸/电离(DIOS)、次级离子质谱法（SIMS)、四极飞行时间（Q-TOF)、串联飞行时间 (T0F/T0F)技术，称为uUraflex III T0F/T0F，大气压化学电离质谱法(4?(：1-]\15)、4?(：1-MS/MS、APCI-(MS) .S叩.N、大气压光离子质谱法（APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS) .sup.N、四极质谱测定法、傅立叶变换质谱测定法(FTMS)、定量质谱测定法和离子阱质谱测 定法。
[0156] 在对蛋白值生物标志物进行质谱表征和确定生物标志物值之前使用样品制备策 略来标记和富集样品。标记方法包括但不限于用于相对和绝对定量的等量异位标签 (iTRAQ)和细胞培养中用氨基酸进行的稳定同位素标记(SILAC)。在质谱分析之前用来针对 候选生物标志物蛋白质选择性富集样品的捕捉试剂包括但不限于适体、抗体、核酸探针、嵌 合体、小分子、F(ab'）2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受 体、亲和体(af f ybodieS)、纳米抗体、错蛋白、域抗体、可选的抗体支架(例如双体抗体等）印 迹聚合物、高亲和性多聚体(avimer)、模拟肤、类肤、肤核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子 受体和合成受体，W及运些的修饰形式和片段。
[0157] 前述测定能够检测生物标志物的值，所述生物标志物的值在用于预测对癌症治疗 剂的响应性的方法中是有用的，其中所述方法包括在来自患OAC的个体的生物样品中检测 至少N个生物标志物值，其中每个生物标志物值对应于选自由表1至4中提供的生物标志物 组成的组，其中使用生物标志物值进行的分类，如W下所详细描述的，指示个体对治疗剂是 否具有响应性。虽然所描述的预测性生物标志物中的某些仅对于预测对治疗剂的响应性是 有用的，本文还描述了生物标志物的多个子集的分组，所述每个子集可用作两个或更多个 生物标志物的套组。因此，本申请的各个实施方案提供了包含N个生物标志物的组合，其中N 为至少3个生物标志物。应当理解N可W被选择为W上所描述的范围，W及相似的但更高级 别范围中的任何范围中的任何数目。根据本文所述的任何方法，生物标志物值可W被单独 检测并分类，或可W共同检测并分类，例如W多重测定的形式。
[0158] b)微阵列方法
[0159] 在一个实施方案中，本发明利用了"寡核巧酸阵列"（在本文中也被称作"微阵 列"）。微阵列可用来分析细胞中生物标志物的表达，特别是用来测量癌症组织的生物标志 物的表达。
[0160] 在一个实施方案中，生物标志物阵列通过将代表细胞中存在的mRNA转录物的可检 巧时示记的多核巧酸(例如，从总细胞mRNA或标记的CRNA合成的巧光标记的cDNA)与微阵列杂 交而产生。微阵列是表面，该表面具有细胞或生物体基因组中许多基因的产物的结合(例如 杂交)位点的有序阵列，所述许多基因优选为大多数基因或几乎全部的基因。可W用本领域 中已知的多种方法来制备微阵列。不管如何产生，微阵列都具有某些共同特征。阵列是可复 制的，运允许产生给定阵列的多个拷贝并易于相互比较。优选地，微阵列是小的，通常小于 5cm2,而且它们由在结合(例如核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中给定的结合位 点或结合位点的独特的集合将特异性地结合细胞中的单个基因的产物。在特定的实施方案 中，使用在每个位置处含有附着的已知序列的核酸的位置可寻址阵列。
[0161] 应当理解，当制备与细胞的RNA互补的CDNA并在适合的杂交条件下将其与微阵列 杂交时，与阵列中对应于任何特定基因的位点的杂交水平将反映出由该基因/生物标志物 转录的mRNA在细胞中的发生率。例如，当与总细胞mRNA互补的可检测标记(例如利用巧光素 标记)的CDNA或CRNA与微阵列杂交时，阵列上对应于未在细胞中转录的基因（即能够特异性 结合基因的产物）的位点将具有很少的信号或没有信号（例如巧光信号），而编码mRNA普遍 存在的基因将具有相对强的信号。选择核酸杂交和洗涂条件W便探针与特定的阵列位点 "特异性结合"或"特异性杂交"，即，探针与具有互补核酸序列的序列阵列位点杂交、形成双 链体或结合，而不与具有非互补核酸序列的位点杂交。如本文所使用的，如果多核巧酸的较 短部分少于或等于25个碱基，利用标准碱基配对法则无错配，或者，如果多核巧酸的较短部 分长于25个碱基，不存在5% W上的错配，运时则认为一个多核巧酸序列与另一个互补。优 选地，多核巧酸完全互补(无错配）。通过利用常规实验通过进行包括阴性对照的杂交测定 可W证明，特定杂交条件导致特异性杂交。
[0162] 最佳杂交条件将取决于标记的探针和固定的多核巧酸或寡核巧酸的长度(例如， 寡聚体相对于超过200个碱基的多核巧酸)和类型（例如，RNA、DNA、PNA)。核酸的特定（即，严 谨）杂交条件的一般参数在Sambrook et al S叩ra和Ausubel et al "Current Protocols in Molecular Biology",Greene Publishing and Wiley-interscience,NY (1987)中描述，为所有目的，将其全文合并入本文。当使用cDNA微阵列时，典型的杂交条件 是在65 °C在5xSSC加0.2 % SDS中杂交4小时，然后在25 °C在低严谨洗涂缓冲液（IxSSC加 0.2 % SDS)中洗涂，然后在25 °C在高严谨洗涂缓冲液(0.1SSC加0.2 % SDS)中洗涂10分钟（参 见Siena et al. ,Proc.化tl.Acad.Sci.USA,Vol.93，p.10614(1996))。有用的杂交条件也 提供于，例女日，Tijessen,Hybridization With Nucleic Acid Probes",Elsevier Science Publishers B. V. (1993似及Kricka, "Nonisotopic DNA Probe Techniques" ,Academic Press,San Diego,&lif. (1992)。
[0163] 微阵列平台包括由例如Affymehi X, 11 Iumina和Agi lent的公司制造的那些。由 Affymetrix制造的微阵列平台的实例包括U133Plus2阵列、Almac proprie^iT Xcel?阵列 和Almac proprietaiT CancerDSAs敏,包括I^reast (^incerD'SJL?and Lung Cancer 臟細。
[0164] c)免疫测定方法
[0165] 免疫测定方法基于抗体与其相应祀标或分析物的反应，且可根据特定的测定形式 检测样品中的分析物。为了提高基于免疫响应性的测定方法的特异性和灵敏度，单克隆抗 体由于其特异性表位识别而经常被使用。在许多免疫测定中也已成功地使用了多克隆抗 体，原因是它们与单克隆抗体相比对于祀标的亲和力提高。已设计了免疫测定用于宽范围 生物样品基质。已设计了免疫测定形式提供定性、半定量和定量的结果。
[0166] 可通过利用待检测的特定分析物的已知浓度产生的标准曲线的应用来产生定量 结果。基于标准曲线绘制来自未知样品的反应或信号的图，且建立对应于未知样品中的祀 标的量或值。
[0167] 已设计了多种免疫测定形式。ELISA或EIA可W定量地检测分析物/生物标志物。该 方法基于标记物与分析物或抗体的连接，且标记物组分直接地或间接地包括酶。可设计 ELISA测试的形式可W是对分析物进行直接、间接、竞争性或夹屯、法检测。其它方法基于标 记物例如，放射性同位素 Qi25)或巧光。另外的技术包括，例如，凝集法、浊度法、比浊法、 Western印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组化、流式细胞术、Luminex测定和其他技术 (参见ImmunoAssay = A Practical Guide,Brian Law编辑，Taylor&Francis,Ltd.出版，2005 版)。
[0168] 示例性的测定形式包括酶联免疫测定化LISA)、放射免疫测定、巧光测定、化学发 光测定和巧光共振能量转移(FRET)或时间分辨-FRET(TR-FRET)免疫测定。用于检测生物标 志物的程序的实例包括生物标志物免疫沉淀，然后进行允许区分大小和肤水平的定量方 法，例如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱等。
[0169] 检测和/或定量可检测的标记或信号产生物质的方法取决于标记物的性质。由适 当的酶催化的反应产物(其中可检测的标记物是酶;见上文)可W是，但不限于，巧光产物、 发光产物或放射活性产物，或者它们可W吸收可见光或紫外光。适用于检测运种可检测标 记物的检测物的实例包括，但不限于，X-射线薄膜、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度 计、比色计、巧光光度计、光度计和光密度计。
[0170] 可W W允许进行任何适合反应制备、处理和分析的任何形式来进行任何用于检测 的方法。运可W是，例如，在多孔测定板(例如，96孔或384孔）中进行或利用任何适合的阵列 或微阵列进行。用于不同的试剂的胆液可W人工地或由机器配制，并且所有随后的吸取、稀 释、混合、分配、洗涂、解育、样品读数、数据采集和分析可W利用能够检测可检测标记物的 商业上可获得的分析软件、机器和检测设备在机器上进行。
[0171] 临床应用
[0172] 在一些实施方案中，提供了用于鉴别和/或选择对于治疗方案有响应的癌症患者 的方法。特别地，该方法设及鉴别或选择对于治疗方案有响应的癌症患者，所述治疗方案包 括施用直接或间接损伤DNA的剂。还提供了用于鉴别对于治疗方案无响应的患者的方法。运 些方法通常包括确定患者肿瘤(原发性、转移性肿瘤或来自肿瘤的其他衍生物，例如，但不 限于，血液或血液中的组分、尿液、唾液和其他体液）中一系列预测标志物的表达水平，将表 达水平与参考表达水平相比较，并鉴别样品中的表达是否包括所选的预测标志物或标志物 集合的表达模式或表达谱，所述表达模式或表达谱对应于对治疗剂有响应或无响应。
[0173] 在一些实施方案中，预测患食道腺癌(OAC)的个体对用DNA损伤治疗剂进行的治疗 的响应性的方法包括：
[0174] a.测量由个体获得的测试样品中的一个或多个生物标志物的表达水平，其中所述 一个或多个生物标志物选自表1A和/或IB和/或2A和/或2B和/或3和/或4;
[01巧]b.得到记录表达水平的测试得分；
[0176] C.提供阔值得分，其包含将测试得分与响应性相关联的信息；
[0177] d. W及将测试得分与阔值得分相比较;其中当测试得分超过阔值得分时预测为有 响应性。
[0178] 在特定的实施方案中，预测患食道腺癌(OAC)的个体对DNA损伤治疗剂的响应性的 方法包括下述步骤:从个体获得测试样品；测量测试样品中一个或多个生物标志物的表达 水平，其中一个或多个生物标志物选自由CX化10、MX1、ID01、IF1ML、CD2、GBP5、PRAME、 ITGAL、LRP4和AP化3组成的组;获得记录表达水平的测试得分;提供阔值得分，其包含将测 试得分与响应性相关联的信息；W及将测试得分与阔值得分相比较;其中当测试得分超过 阔值得分时预测为有响应性。本领域普通技术人员利用本文提供的教导，包括实施例1的教 导，可W确定合适的阔值得分，和合适的生物标志物权重和偏差。
[0179] 在其它实施方案中，预测患食道腺癌(OAC)的个体对DNA损伤治疗剂的响应性的方 法包括测量测试样品中一个或多个生物标志物的表达水平，其中一个或多个生物标志物选 自由 CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、AP0L3、CDR1、FYB、TSPAN7、 RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、0LFM4、PI15、F0SB、 FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXAl、RSAD2、ESR1、IKZF3、 0尺211?、66。3、魁1'1、1^^152、〔￥?286、？1?亂、？？？11?14和41^37218.1组成的组。表24和28提供 了示例性的基因标签(或基因分类器），其中生物标志物分别由其中所列的40或44个基因产 物组成，并且其中阔值得分来源于其中所列的单个基因产物权重。在运些实施方案中的一 个中，其中生物标志物由表2B所列出的44个基因产物组成，并且该生物标志物与表2B中所 提供的权重相关联，超出阔值得分，例如0.3681的阔值得分的测试得分指示了个体可能对 DNA损伤治疗剂有响应性。
[0180] 如果与在不接触治疗剂情况下的生长相比较，癌症与治疗剂接触的结果是生长速 率被抑制时，则癌症对于治疗剂是"有响应的"。癌症的生长可W用多种方法来测量，例如， 可测量肿瘤的尺寸或适用于该肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。
[0181] 如果与在不接触治疗剂情况下的生长相比较，癌症与治疗剂接触的结果是癌症的 生长速率没有被抑制，或被抑制的程度非常低，则癌症对于治疗剂是"无响应的"。如上所 述，癌症的生长可用多种方法来测量，例如，可测量肿瘤的尺寸或适用于该肿瘤类型的肿瘤 标志物的表达。对治疗剂无响应的性质是高度可变的，在不同的条件下，不同的癌症对于给 定的治疗剂表现出不同水平的"无响应性"。更进一步地，除了肿瘤的生长大小之外，利用其 它标准，包括患者的生活质量、转移的程度等，可W评估无响应性的测量。
[0182] 该测试的可预测终点，包括但不限于，总生存率，无进展生存率，放射响应，如 RECIST所定义的，完全响应，部分响应，稳定病情和血清学标志物，例如但不限于，PSA、CEA、 CA125、CA15-3和CA19-9。在本发明的其它实施方案中，它可用于在用单独进行的或在标准 治疗环境中进行的DNA损伤组合疗法治疗的食道癌中评价超声内镜、CT、螺旋CT、FDG-PET、 病理性、组织学响应。
[0183] 可W使用在一种或多种核酸或它们的生物学衍生物例如编码蛋白的样品中用于 检测、定量和定性RNA、DNA或蛋白的基于阵列或非阵列的方法，包括定量PCR(QPCR)、酶联免 疫吸附测定化LISA)或免疫组化(MC)等。
[0184] 从被测定的样品获得表达谱之后，将表达谱与参考或对照谱相比较W对细胞或组 织的治疗响应表型进行诊断，并由此对获得样品的宿主的治疗响应表型进行诊断。本文所 使用的关于表达谱的术语"参考"和"对照"表示基因或基因产物表达或特定生物标志物的 表达水平的标准化模式，其是用于解释给定患者的表达分类器并归类于预后或预测类别 的。参考或对照表达谱可W是从已知具有所需表型的样品获得的谱，所述所需表型例如，响 应表型，且因此可W是阳性参考或对照谱。此外，参考谱可W来自已知不具有所需表型的样 品，且因此是阴性参考谱。
[0185] 如果使用定量PCR作为定量一种或多种核酸的水平的方法，该方法可W通过测量 由双重标记的巧光探针（例如TaqMan獲探针或分子信标或FRET/Li曲t切Cler探针)释 放的巧光来定量PCR产物积累。一些方法可能不需要单独的探针，例如Scorpion和 Ampliflyor系统，其中探针被构建到引物中。
[0186] 在特定的实施方案中，将获得的表达谱与单一参考谱相比较W获得关于被测定的 样品的表型的信息。在其它的实施方案中，将获得的表达谱与两种或更多种不同的参考谱 相比较W获得关于测定的样品的表型的更深入的信息。例如，可将获得的表达谱与阳性和 阴性参考谱相比较W获得关于样品是否具有感兴趣的表型的确定的信息。
[0187] 可利用任何方便的方法进行所获得的表达谱与一种或多种参考谱的比较，其中多 种方法是阵列领域的技术人员已知的，例如，通过比较表达谱的数字图像、通过比较表达数 据的数据库等。描述表达谱比较的方法的专利包括，但不限于，美国专利Nos. 6308170和 6228575,通过引用将其公开内容合并入本文。比较表达谱的方法也在上面描述。
[0188] 比较步骤产生了有关所获得的表达谱与一种或多种参考谱的相似或相异程度的 信息，该相似信息被用来确定被测定的样品的表型。例如，与阳性对照的相似性表明测定的 样品具有与响应性参考样品相似的响应性表型。相似地，与阴性对照的相似性表明测定的 样品具有与无响应性参考样品相似的无响应性表型。
[0189] 可进一步将生物标志物的表达水平与不同的参考表达水平相比较。例如，参考表 达水平可W是预定的标准表达参考水平，W评价生物标志物或生物标志物集合的表达是否 提供信息，并作出评价确定患者是有响应还是无响应。此外，确定生物标志物的表达水平可 W与同生物标志物同时测量的表达的内部参考标志物水平相比较，W作出评价确定患者是 有响应还是无响应。例如，并非由本发明的生物标志物组成但已知证明为恒定表达水平的 不同的标志物套组的表达可作为内部参考标志物水平被评估，并与该参考相比较而确定生 物标志物的表达水平。在一个可选的实例中，非肿瘤样品的组织样品中的选定生物标志物 的表达可W作为内部参考标志物水平被评估。在某些方面，生物标志物的表达水平可被确 定为具有提高的表达。在其它方面，生物标志物的表达水平可被确定为具有降低的表达。表 达水平可被确定为与参考水平相比较在表达上提供的信息无变化。在其它方面，相对于由 本文所提供的方法确定的预定的标准表达水平来确定表达水平。
[0190] 本发明还设及指导患者的常规治疗。诊断测试显示其为对于直接或间接影响DNA 损伤和/或DNA损伤修复种类的药物的响应者的患者，可被施用该疗法，并且该患者和肿瘤 学家都能有信屯、认为患者将会受益。由诊断测试确定无响应者的患者可被鉴别为使用更可 能为他们提供益处的替代疗法。
[0191] 本发明还设及选择用于临床测试的患者，其中新型药物种类直接或间接影响DNA 损伤和/或DNA损伤修复，W治疗OAC。具有潜在的响应者的试验群体的富集将有助于在相关 标准下对该药物进行更彻底的评价。
[0192] 本发明还进一步设及将患者诊断为患有或者易于发展为与DNA损伤响应缺陷 (DDRD)有关的OAC的方法。DDRD在本文中被定义为其中患者的一个或多个细胞具有降低的 修复DNA损伤的能力的任何病况。DDRD诊断可W与范可尼贫血/BRCA途径中的突变相关联。 DDRD诊断还可W与腺癌相关联。诊断患有食道腺癌(OAC)的个体的方法可W包括：
[0193] a.测量从个体获得的测试样品中的一个或多个生物标志物的表达水平，其中一个 或多个生物标志物选自表14、18、24、28、3或4;
[0194] b.得到记录表达水平的测试得分；
[01 %] C.提供阔值得分，其包含将测试得分与OAC的诊断相关联的信息；
[0196] d. W及将测试得分与阔值得分相比较;其中当测试得分超过阔值得分时，确定个 体患有OAC或易于发展为0AC。
[0197] 诊断方法可W包括W下步骤:从个体获得测试样品；测量测试样品中一个或多个 生物标志物的表达水平，其中一个或多个生物标志物选自由CX化10、MX1、IDOl、IFlMU CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4和AP化3组成的组;得到记录表达水平的测试得分;提供阔值 得分，其包含将测试得分与OAC的诊断相关联的信息；W及将测试得分与阔值得分相比较； 其中当测试得分超过阔值得分时，确定个体患有该癌症或易于发展为该癌症。利用本文提 供的教导，包括实施例1的教导，本领域普通技术人员可W确定合适的阔值得分和合适的生 物标志物权重。
[0198] 在其它实施方案中，将患者诊断为患有或者易于发展为与DDRD有关的OAC的方法 包括测量测试样品中一个或多个生物标志物的表达水平，其中一个或多个生物标志物选自 由CXCLlO、MX1、IDOl、IF14化、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、AP0L3、CDR1JYB、TSPAN7、 RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、0LFM4、PI15、F0SB、 FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXAl、RSAD2、ESR1、IKZF3、 0尺211?、66。3、魁1'1、1^^152、〔￥?286、？1?亂、？？？11?14和41^37218.1组成的组。表24和28提供 了示例性的基因标签(或基因分类器），其中生物标志物分别由其中所列的40个基因产物或 44个基因产物所组成，且其中阔值得分来源于其中所列的单个基因产物权重。在运些实施 方案中的一个中，其中生物标志物由表2B所列的44个基因产物所组成，并且生物标志物与 表2B中提供的权重相关联，超过阔值得分，例如0.3681的阔值得分的测试得分指示着OAC或 易于发展为OAC的诊断。
【附图说明】
[0199] 图1:DD畑标签的Kap 1 an Meier曲线图，预测用肿瘤辅助化疗治疗的EAC患者中的 无复发生存率(RFS)。：
[0200] 图2: DD畑标签的Kap 1 an Me i er曲线图，预测用肿瘤辅助化疗治疗的EAC患者中的 总体生存率(PFS)。
[0201] 图3:DD畑标签的Kaplan Meier曲线图，预测没有用肿瘤辅助化疗治疗的EAC患者 中的生存率(PFS)。
[0202] W举例的方式，而非限制的方式提供下述实施例。 实施例
[0203] 实施例1 -孤畑测定对食道腺癌(OAC)的应用和验证
[0204] 互空
[0205] 样品
[0206] 46个FF阳化疗前(基于销的；顺销治疗)食道内窥镜组织活检样品被用于证明孤畑 测定(基于表2B中所列的44个基因）在食道癌(OAC)中的预测能力，其中所述样品具有适当 的人组织使用的伦理学声明和知情同意书。每个样品收到五个FF阳组织切片W及每个样品 具有"被标记的"苏木精&曙红化&E)染色切片。对于病理亚型复查H&E切片，并标记进行显微 解剖。
[0207] 基因表达谱分析
[0208] 根据合适的标准操作程序(SOPs)在质控环境下处理所有样品。
[0209] 每个样品的所有5个切片被宏观解剖，并用Ambion RecoverAll试剂盒提取。裂解 物被分为两半，并且对于大部分情况来说，仅需要一半材料就足W进行谱分析。在两种情况 下，宏观解剖材料的两个等分样都被提取。样品被随机分为3批并被提取。
[0210] 在提取样品之后，使用化no化OP 1000分光光度计确定浓度。对于5个样品需要真 空浓缩W产生适合于CDNA扩增的RNA浓度。
[0211] 所有36个RNA样品，无论其是原始的初步提取物、是真空浓缩的还是次级重提取 的，使用NUGEN V3FFPE Amplification试剂盒进行扩增。使用Ovation⑩FFPE WTA System对46个样品进行谱分析。在使用分光光度计和Agilent2100Bioanalyze;r对产生的 CDNA进行质控之后，将样品片段化，并使用NuGEN化core Biotin模组进行标记。在片段化 QC之后，使片段化的和标记的产物与Xcel阵列杂交，根据NuGEN的在Affymetrix GeneChip⑩阵列上杂交的指导进行。
[0212] 阵列QC
[0213] 在微阵列谱分析之后，进行质控(QC)评估。使用Almac的专有工具箱评估样品和阵 列的质量。四十六个样品没有通过微阵列QC。该样品在图像分析、当前描述（present call)、比例因子和分布上没有通过。因此在后续分析中使用45个样品。
[0214] 数据准备
[0215] 使用Almac的具有RMA设定(背景校正，使用平均值的中位数进行的分位数标准化； W及中位数平滑汇总(median polish summarisation))的预处理工具箱对样品进行预处 理。对于代表DDRD基因的探针集进行交叉作图，W提取相关的探针集进行分析。
[0216] 计算分类器得分
[0217] 确定映射到分类器中的基因的探针集，排除反义探针集(如果可W的话）。计算与 分类器中每一个基因相关的所有探针集的中位数强度，获得缩减基因强度矩阵。如果对于 在特定阵列平台上的基因不存在探针集，则使用观察到的来自训练数据的平均值作为替 换。计算每一个样品的所有探针集的中位数值，并从缩减基因强度矩阵中减去该值。
[0218] 分类器得分计算为标签中基因表达的加权和。
[0219]
[0220] 其中Wi是每一个基因的权重，bi是基因特异性的偏差，它是每个基因相对于训练数 据的平均中屯、所必需的（表4)，a町鎌是阵列上所有探针集的中位数表达强度，gei是预处理 之后观察到的基因表达水平，W及k = 0.3738是恒定偏移。
[0221] 对每一个样品计算分类器得分，然后使用该分类器得分将患者从更可能响应至更 不可能响应进行分层。
[0222] 结果
[0223] 表5无复发生存的多变量分析(43个样品，20个无复发事件和23个复发事件）
[0224]
[0225] 使用Cox比例风险回归，在无复发生存上DDRD测定有统计学显著效果。当模型中包 括其它重要风险因素时，效果是统计学显著的（风险比0.07，95%CI (0.007,0.643) ,P = 0.019)。模型中包括的协变量由临床专家指导。
[0226] 表6总生存的多变量分析(43个样品，17个无复发事件和26个复发事件）
[0227]
[0228」使用Cox比例风检凹归，在总生存上孤畑测定有统计学显署效果。当模型中包括其 它重要风险因素时，效果是统计学显著的（风险比0.11，95%CI(0.014,0.885)，p = 0.038)。 模型中包括的协变量由临床专家指导。
[0229] 结论
[0230] 提供证据证明，在食道癌中，在调整了其它重要的协变量之后，DDRD测定是无复发 生存(P = O.019)和总生存(P = O.038)的显著预测因素。
[0Z31] 实施例2 [02创背景
[0233] 食道癌是全世界第八常见的癌症，每年有480，000个病例被诊断。在英国，在过去 45年中男性中该疾病的发病率上升了 68%，最常见的病理亚型是腺癌。食道腺癌(OAC)的运 种上升的原因还不清楚，但运种肿瘤的进展与癌前化生病况，己雷特食道症密切相关。运是 由于胃食管返流疾病引起的，并且吸烟、酒精摄入与肥胖是OAC的最强的危险因素之一。尽 管尽量对己雷特食道症进行筛选，并且通过预手术选择有可能从治愈性手术获益的OAC患 者，生存率仍然很低。5年生存率是13%，即使是在早期局限性疾病中，运个数字也很少超过 40%。肿瘤辅助疗法或围手术期疗法已证明显著提高总生存率，但是对于个体患者来说，最 佳的方法仍然不清楚。存在迫切的需要鉴别能预测响应的生物标志物，使得临床医生能够 将患者分层至最有益处的肿瘤辅助疗法。
[0234] 食道腺癌患者群体
[02对考虑到OAC中最有活性的药物之一是DNA损伤剂顺销，我们决定研究DDRD标签在 OAC中的效力。我们分析了 63例福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE)预处理内窥镜组织活检 样本，运些样本来自北爱尔兰癌症中屯、2004年到2010年间的早期OAC患者，它们先用基于顺 销的肿瘤辅助化疗进行治疗，然后进行手术切除(表7和8)。
[0236] 本实施例中使用的63个样品包括45个来自实施例1的样品。我们对另一个小的样 品集进行了谱分析，并将两个样品集合并起来进行该分析。相应地，实施例1中所述的方法 被应用于该实施例。
[0237] 在标记进行宏观解剖之前复查活检组织的病理亚型，对含有至少70%腺癌组织的 样品进行下一步操作。根据Mandard Score(<3 =病理响应)对匹配的切除样本评分，从63个 FF阳组织活检样本中的62个(98.4%)中提取足量的1?^4，并与乂。61了》阵列杂交，所述乂。61? 阵列是被优化用于保存的FFPE组织的基于CDNA微阵列的技术(Almac/Affymetrix)。所有样 品都进行DDRD测定的评分。
[023引
[0239] 通过Kap 1 an-Me i er分析和Cox比例风险回归评价DDRD得分和预后之间的相关性。 总共13个样品（21 % )被定性为孤畑阳性，其余49个样品（79 % )为孤RD阴性。孤畑测定阳性 证明与无复发生存（RFS)具有统计学显著的相关性化R 0.33;95%CI 0.13-0.87;p = 0.024)，相对于孤畑-ve患者的33.9个月，孤畑+ve患者的中位数RFS为65.2个月（图I)。当在 模型中排除了其它风险因素时，在进行了多变量分析之后，DDRD测定对于WS的效果仍然是 统计学显著的化R 0.31，95%(：1(0.110,0.877)，口 = 0.027)(表9)。孤畑+￥6患者中的中位数 总生存率（05)显著较高（94.3个月相对于32.2个月；册0.32;95%(：10.12-0.82;口 = 0.017)(图2)。当在模型中排除了其它风险因素时，在进行了多变量分析之后，DDRD测定对 于OS的效果仍然是统计学显著的化R 0.36,95%CI(0.132,0.953)，p = 0.040)。运些结果表 明DDRD测定在早期食道腺癌的肿瘤辅助化疗中是强预测标志物。
[02401
[i
[i
[0243] 表10:对于总生存，孤畑测定的预测值的多变量分析
[0244] OAC-化疗初始中的孤畑
[0245] 为了确定DDRD测定的预测是否独立于治疗，将其应用于75个新鲜冷冻的组织样 品，所述组织样品来源于食道和胃食道交界肿瘤的可能的治愈性切除。运些切除是在1992 年到200年之间进行的，没有患者接受肿瘤辅助化疗。使用定制的Agilent 44K 60-mer寡-微阵列对所有样品进行分析。如图3所示，在DDRD阳性和阴性人群中没有生存率的差异，皿 0.64(95%CI 0.17-2.43)。正在寻找进一步的基于Affymetrix的验证集，W在数据集之间 提供一致性分析平台。
[0246] 结论
[0247] .DDRD测定可W个性化选择治疗方案，并改善早期EAC患者的结果。
[0248] ?在EAC中由FF阳组织开发出首个基于阵列的生物标志物。
[0249] ?对98%的预处理FF阳内窥镜活检组织成功进行了转录谱分析。
[0250] ?孤畑测定证明与预后具有强的相关性。 惦引]?与测定阴性人群相比，阳性DDRD测定结果预测提高的RFS(HR 0.31，95%CI (0.11-0.88)，p = 0.027WP0S(HR 0.36,95%CI(0.13-0.95)，p = 0.04)。
[0巧2].与孤畑阴性患者的17%相比，孤畑阳性患者的五年生存率为59%。
[0253] .正在进行该验证集的扩展，W增加该分析的统计学功效。
[0254] ?将在未来的临床试验中评估DDRD测定在早期EAC中的作用。
[0255] 本发明的各个实施方案的范围不受到本文所述的特定实施方案的限制。事实上， 除了本文所述的那些之外，根据前述的描述和所附的附图，各个实施方案的不同修改对于 本领域技术人员来说将会变得显而易见。运种修改落在所附的权利要求的范围内。而且，在 适当的情况下，本文所述的所有实施方案被认为广泛地应用于并结合任何和所有其它相容 的实施方案。
[0256]本文所应用的各个出版物，通过引用其全文将其公开内容合并入本文。
【主权项】
1. 预测患有食道腺癌(OAC)的个体对用DNA损伤治疗剂进行的治疗的响应性的方法，包 括： a. 测量由所述个体获得的测试样品中的一个或多个生物标志物的表达水平，其中所述 一个或多个生物标志物选自表28、14、18、24、3和/或4 ; b. 得到记录表达水平的测试得分； c. 提供阈值得分，其包含将测试得分与响应性相关联的信息； d. 以及将测试得分与阈值得分相比较;其中当测试得分超过阈值得分时预测为有响应 性，和/或当测试得分未超过阈值得分时，预测为无响应性。2. 权利要求1的方法，其中所述一个或多个生物标志物选自由CXCL10、MX1、ID01、 正14礼、〇)2、68?5、？1^1^、叮6厶1^、1^?4和厶？01^3组成的组，和/或由〇)1?1小￥8、了5?厶阶、1^〇2、 KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、0LFM4、PI15、F0SB、 FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、 01?211?』6卩1?、嫩1'1、1^^52、〇￥?286、？了？1?(：、？？？11?1厶和厶1^137218.1组成的组。3. 权利要求2的方法，包括测量全部生物标志物的表达水平。4. 权利要求1-3任一项的方法，其中使用引物和/或探针测量表达水平，所述引物和/或 探针与表lA(SEQIDN0:l-24)、表lB(SEQIDN0:25-50)和/或表3(SEQIDN0:51-230)所 示的靶序列的至少之一结合。5. 权利要求1-4任一项的方法，其中0AC是早期、晚期或转移性疾病。6. 权利要求1-5任一项的方法，其中DNA损伤治疗剂包含选自由DNA损伤剂、DNA修复靶 向疗法、DNA损伤信号传导抑制剂、DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂、组蛋白脱乙酰酶 抑制剂、热休克蛋白抑制剂和DNA合成抑制剂组成的组的一种或多种物质。7. 权利要求6的方法，其中DNA损伤治疗剂包括含铂的剂、核苷类似物例如吉西他滨或 5_氟脲嘧啶或其前药例如卡培他滨、蒽环霉素例如表阿霉素或阿霉素、烷化剂例如环磷酰 胺、电离辐射或辐射和化疗的组合(放化疗)的一种或多种。8. 权利要求1 _7任一项的方法，其中DNA损伤治疗剂包括含铂的剂。9. 权利要求8的方法，其中基于铂的剂选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。10. 权利要求1-9任一项的方法，其预测对于用DNA损伤治疗剂和其它疗法一起进行的 治疗的响应性。11. 权利要求10的方法，其中其它疗法是有丝分裂剂。12. 权利要求11的方法，其中有丝分裂抑制剂是长春花生物碱或紫杉烷。13. 权利要求12的方法，其中长春花生物碱是长春瑞滨。14. 权利要求12的方法，其中紫杉烷是紫杉醇或多西紫杉醇。15. 权利要求1-9任一项的方法，其预测对包含DNA损伤治疗剂的组合疗法的响应性，其 中所述组合疗法选自： a. 顺铂/卡铂和5-氟脲嘧啶 b. 顺钼/卡钼和卡培他滨 c. 表阿霉素/阿霉素、顺铂/卡铂和氟脲嘧啶 d. 表阿霉素/阿霉素、奥沙利铂和卡培他滨 e. 顺铂/卡铂和紫杉醇 f. 顺铂/卡铂和伊立替康 g. 顺钼/卡钼和长春瑞滨。16. 权利要求15的方法，其中组合疗法进一步包含一种或多种紫杉烷例如紫杉醇、拓扑 异构酶抑制剂例如伊立替康、长春花生物碱例如长春瑞滨或放化疗。17. 权利要求1-16任一项的方法，其中所述治疗是肿瘤辅助治疗和/或辅助治疗。18. 权利要求1-17任一项的方法，其中如果预测为有响应性，则用DNA损伤治疗剂治疗 所述个体。19. 权利要求1-17任一项的方法，其中如果预测为无响应性，则不用DNA损伤治疗剂治 疗所述个体。20. 权利要求1-19任一项的方法，其中所述治疗是基于铂的疗法的肿瘤辅助治疗。21. 权利要求19的方法，其中如果预测为无响应性，则用有丝分裂抑制剂治疗所述个 体。22. 权利要求1-21任一项的方法，其中有响应性包含或是提高的总生存率、无进展生存 率和/或无疾病生存率。23. (a)治疗食道腺癌(OAC)的方法，包括给受试者施用DNA损伤治疗剂，其中所述受试 者基于测试得分被预测为对DNA损伤治疗剂有响应，所述测试得分衍生自从个体获得的测 试样品中的一个或多个生物标志物的表达水平，其中所述一个或多个生物标志物选自表 28、1六、18、2六、3和/或4中所列出的那些;或者 (b)DNA损伤治疗剂在治疗食道腺癌(OAC)的方法中的应用，其中所述受试者基于测试 得分被预测为对DNA损伤治疗剂有响应，所述测试得分衍生自从个体获得的测试样品中的 一个或多个生物标志物的表达水平，其中所述一个或多个生物标志物选自表2B、1A、1B、2A、 3和/或4中所列出的那些。24. (a)治疗食道腺癌(OAC)的方法，包括给受试者施用有丝分裂抑制剂，其中所述受试 者基于测试得分被预测为对DNA损伤治疗剂无响应，所述测试得分衍生自从个体获得的测 试样品中的一个或多个生物标志物的表达水平，其中所述一个或多个生物标志物选自表 28、1六、18、2六、3和/或4中所列出的那些;或者 (b)DNA损伤治疗剂在治疗食道腺癌(OAC)的方法中的应用，其中所述受试者基于测试 得分被预测为对DNA损伤治疗剂无响应，所述测试得分衍生自从个体获得的测试样品中的 一个或多个生物标志物的表达水平，其中所述一个或多个生物标志物选自表2B、1A、1B、2A、 3和/或4中所列出的那些。25. 权利要求23或24的方法或应用，其中已经根据权利要求1-22任一项请求保护的方 法获得测试得分。26. 用于预测患有食道腺癌(OAC)的个体对用DNA损伤治疗剂进行的治疗的响应性的试 剂盒，包含引物或探针，所述引物或探针与表3所示的靶序列（SEQ ID N0:51-230)的至少一 个杂交。27. 权利要求26的试剂盒，其中所述引物或探针与表3所示的靶序列的至少10个杂交。28. 权利要求26或27的试剂盒，进一步包含DNA损伤治疗剂。29. 权利要求28的试剂盒，其中所述DNA损伤治疗剂以特别用于治疗OAC的剂型提供。30. 权利要求29的试剂盒，其中所述治疗是肿瘤辅助治疗或辅助治疗。
【文档编号】C12Q1/68GK105874080SQ201480059197
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年9月9日
【发明人】K·基廷, L·希尔, S·德哈罗, E·奥布莱恩, T·达维森, P·哈金, R·肯尼迪, J·奥唐奈
【申请人】阿尔玛克诊断有限公司