一类大黄酸类化合物及其用图
【专利摘要】本发明涉及一类大黄酸类化合物及其用途。具体地，本发明涉及一类具有下述结构通式的大黄酸类化合物。本发明的大黄酸类化合物可用于制备预防和/或治疗破骨细胞活性异常导致的疾病的药物。
【专利说明】
一类大黄酸类化合物及其用途
技术领域
[0001 ]本发明涉及一类大黄酸类化合物及其用途。
【背景技术】
[0002] 大黄酸(Rhein):化学名为1，8_二羟基-3-羧基蒽醌，来源于大黄、何首乌等多种植 物的根茎等部位，近年来，大黄酸及其衍生物因其具有抗菌抗肿瘤抗炎作用及对消化系统、 肾脏、心血管系统、骨等方面的药理作用而受到广泛关注(李晓红等，大黄酸及其衍生物药 理作用研究新进展，现代药物与临床，2010,25(6)，417-452)。
[0003] 大黄酸具有多羟基蒽醌的核心结构，目前已知多种天然产物含有该核心结构，如 大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素等系列化合物。具有这种特征结构的化合物往往 具有多种生物活性，如芦荟大黄素通过阻断诱导型氮氧化物合酶（iNOS)和环加氧酶-2 (C0X-2)的mRNA表达而抑制炎症反应（Park MY等，Biosci.Biotechnol.Biochem. ,2009,73
[4] ，828-832);大黄素可以在一定浓度下抑制破骨细胞的生成以及促进成骨细胞形成，通 过该双重作用，大黄素在体内实验中展示了良好的抗骨质疏松性能（Kim JY等， J.Bone.Miner.Res.,2014,29(7),1541-1553)〇
[0004] 破骨细胞来源于骨髓造血干细胞中的单核前体细胞，在细胞因子如巨噬细胞集落 刺激因子和核因子κΒ受体活化因子配体的调节下分化形成活化的破骨细胞，行使骨吸收的 功能，骨质疏松患者骨组织的破骨细胞形成远远多于常人，从而导致骨吸收作用过度活跃， 这是骨质疏松的重要病理机制之一。尽管临床上有多种抑制破骨细胞形成的骨质疏松治疗 药物，但多数药物对骨质疏松的作用依然有限，而且部分药物毒副作用较大，不良反应较 多。如双膦酸盐类生物利用度低，易发生胃肠道反应，长期使用易导致食道癌、下颂骨坏死 等;雌激素及选择性雌激素受体调节剂主要针对绝经初期的女性，且具有增加深静脉血栓 形成的风险等;降钙素类似物可能导致过敏反应。鉴于多羟基蒽醌类化合物如大黄酸、大黄 素等对破骨细胞形成的抑制作用，设计新型的大黄酸衍生物具有重要的意义，可以为新型 的抗骨质疏松药物奠定基础。
[0005] 本申请保留了大黄酸多羟基蒽醌类的母体结构，在酚羟基位置引入乙酰基，并在 羧酸位引入酰胺活性基团，形成一类新型的，具有独特生理活性的大黄酸类化合物。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是公开一类大黄酸类化合物。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述大黄酸类化合物的用途。
[0008] 根据本发明的第一个目的，本发明提供了一类具有如下结构通式的大黄酸类化合 物：
[0010]其中，
[0011] Ri选自氢或乙酰基；
[0012] R2，R3相同或不同，并且各自独立地为氢、Cl-C6直链或支链烃基、C3-C8饱和杂环基 C1-C4烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代5-7元杂芳基;优选为氢、哌啶基C1-C2烷 基、吗啉基C1-C2烷基、吡咯基C1-C2烷基、取代或未取代苯基、取代或未取代的吡啶基;或者 R2、R3和它们连接的氮原子一起形成被羟基取代或无取代的C1-C6直链或支链烃基取代的 C3-C8饱和杂环基、C5-C6饱和杂环基取代的C3-C8饱和杂环基、取代或未取代芳基取代的 C3-C8饱和杂环基、C1-C6烷基取代的氨基取代的C3-C8饱和杂环基;所述"取代或未取代"的 定义是指被选自如下的一种或多种取代基所取代:羟基、卤素、三氟甲基、C1-C6烷基。
[0013] 优选的，R#PR3其中一个为氢，另一个选自2-氯-4-三氟甲基苯基、1-啦咯乙基、4-吗啉乙基、苯基、4-甲基苯基、4-氟苯基、3-三氟甲基吡啶-2-基;或者R 2、R3和它们连接的氮 原子一起形成4-甲基-1-哌嗪基、4-乙基-1-哌嗪基、4-苯基-1-哌嗪基、4-(吗啉-1-基)-1-哌啶基、4-羟甲基-1-哌啶基、4-(2-异丙醇基)-1-哌啶基。
[0014] 在本发明中，术语"芳基"是指不含杂原子的芳香族环基，优选是碳原子数为6~14 个的芳基，更优选为碳原子数为6~10个的芳基，如苯基、萘基、联苯基;所述取代的芳基的 实例包括但不限于4-甲基苯基、4-氟苯基、2-氯-4-三氟甲基苯基。
[0015]在本发明中，术语"Q-C6烷基"是指主链上具有1至6个碳原子的直链或支链烷基， 非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和已基等;优 选甲基、乙基、丙基、异丁基。术语"Cl -C4烷基"具有类似的含义。
[0016] 在本发明中，术语"C3-C8饱和杂环"是指具有至少一个选自N、0和S中的杂原子的 3-8元饱和环烷，非限制性地包括吡咯烷基、四氢咪唑基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基等;优选吡 咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基。
[0017] 在本发明中，"C5-C6饱和杂环"是指具有至少一个选自N、0和S中的杂原子的5-6元 饱和环烧。
[0018] 在本发明中，术语"5-7元杂芳基"是指在环上具有至少一个选自N、0和S中的杂原 子的5-7元芳香族环基，非限制性地包括呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、吡唑基和 吡啶基;优选吡啶基。
[0019] 所述大黄酸类化合物进一步优选为以下具体化合物：
[0021]本发明的大黄酸类化合物通过如下步骤制备:化合物a在二氯甲烷、草酰氯、N，N-二甲基甲酰胺存在下，室温搅拌1小时，将溶剂旋干后，用二氯甲烷溶解，再加入NHR 2R3和三 乙胺进行反应，室温搅拌4小时，得到本发明所述大黄酸类化合物（即式I所示化合物），反应 式如下：
[0023]办、1?2、1?3的定义同上。
[0024] 也可以参考专利公开号为CN101508645的专利进行制备。
[0025]当心为氢时，化合物a即为大黄酸，当为乙酰基时，化合物a可以由大黄酸在130°C 下与醋酸酐反应2h制备得到，催化剂为三氟甲磺酸锌，反应式如下：
[0027] 本发明还公开了所述大黄酸类化合物用于制备预防和/或治疗破骨细胞活性异常 导致的疾病的药物的用途。
[0028] 所述破骨细胞活性异常导致的疾病包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙 齿脱落、Paget's骨病、佝偻病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏等。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明的大黄酸类化合物对破骨细胞形成的影响(TRAP染色）。
[0030] 图2为本发明的大黄酸类化合物b6对破骨细胞骨吸收功能的影响。**p〈0.01，两两 比较具有显著性差异。
[0031 ]图3为本发明的大黄酸类化合物b6对破骨细胞骨吸收功能相关基因 mRNA表达的影 响。###p〈〇. 〇〇1，*#p〈〇. 〇〇1，两两比较具有显著性差异。
【具体实施方式】
[0032]以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范 围。
[0033] 制备实施例
[0034] 实施例1
[0035] 氮-(2-氯-4-(三氟甲基)-苯基)-4，5-二氢-9，10-二氧代-9，10-二氢化蒽-2-甲酰 胺(bl)
[0037] 将大黄酸（284mg, lmmol)溶解到二氯甲烧（5mL)中，加入草酰氯（254mg，2mmol)，再 加入一滴N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌1小时，将溶剂旋干后，用二氯甲烷溶解，再加入2-氯-4-三氟甲基苯胺(200mg，1. lmmol)和三乙胺（lmL)，室温搅拌4小时，用饱和氯化钠溶液 猝灭反应，并用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，过滤旋干，柱层析分离得 产物380mg(产率82%)。
[0038] 4 NMR(500MHz，DMS〇-d6)δ11 · 98(s，1H)，11·91(s，1H)，10·77(s，1H)，8·26(d，1H)， 8.03(s,lH) ,7.92( s,lH) ,7.90 (d,J = 8.4Ηζ,1Η) ,7.86( t,J = 7.9Ηζ,1Η) ,7.82(d,J = 8.3Hz,lH),7.78(d ,J = 7.4Hz,lH),7.44(d ,J = 8.3Hz,lH).
[0039] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl91.40，181.06，163.53，161.39，161.03，140.59， 138.48,137.60,133.82,133.30,129.92,128.80,127.84(d,J=32.6Hz),126.80,126.77, 124.60,123.29((1, J = 272.5Hz), 123.00,119.47,118.28,117.88,116.21.
[0040] 实施例2
[0041] 1，8-二羟基-3-(4-甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9,10-二酮盐酸盐(b2)
[0043] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"N-甲基哌嗪"。
[0044] 4 NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl2.01(s，lH)，11.90(s，lH)，11.30(s，lH)，7.83(t，J= 7.9Hz,lH),7.73(d ,J = 7.5Hz,lH),7.71(d ,J=1.3Hz,lH),7.46(d ,J=1.4Hz,lH),7.42(d, J=8.3Hz,lH),3.80-3.46(m,4H),3.25-3.00(m,4H),2.76(s,3H).
[0045] 13C NMR(126MHz,DMSO-de)5191.26,181.03,166.60,161.35,161.16,142.99, 137.55,133.91,133.19,124.64,121.94,119.42,117.22,116.71,115.98,51.73,51.69, 42.07.
[0046] 实施例3
[0047] 3-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-1,8-二羟蒽-9,10-二酮(b3)
[0049] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"N-乙基哌嗪"。
[0050] 4 NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl2.01(s，lH)，11.90(s，lH)，11.17(s，lH)，7.83(t，J= 7.9Hz,lH),7.77-7.71(m,2H),7.47(d,J=1.4Hz,lH),7.44-7.38(m,lH),3.83-3.44(m, 6H),3.18-3.04(m,4H),1.26(t ,J = 7.3Hz,3H).
[0051] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl91.30，181.03，166.53，161.35，161.15，142.98， 137.55,133.91,133.20,124.64,121.95,119.42,117.26,116.72,116.00,50.72,49.62， 43.68,8.74.
[0052] 实施例4
[0053] 1,8-二羟基-3-(4-甲基哌啶-1-羰基)蒽-9,10-二酮(b4)
[0055] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-甲基哌啶"。
[0056] 4 匪R(500MHz，DMS0-d6)Sll.97(s，lH)，11.91(s，lH)，7.83(t，J = 7.8Hz，lH)， 7.73(d,J = 7.3Hz, 1H) ,7.59( s,lH) ,7.41 (d,J = 8.3Hz, 1H) ,7.35( s,lH) ,4.44(d,J = 11.3Hz,lH),3.48(d,J=12.2Hz,lH),3.09(s,lH),2.80(s,lH),1.82-1.48(m,3H),1.29- 0.99(m,2H),0.94(d ,J = 6.0Hz,3H).
[0057] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl91.87，181.54，166.67，161.83，161.74，145.20， 137.98,134.32,133.74,125.05,121.94,119.88,117.18,116.85,116.49,47.59,42.11， 34.44,33.69,30.83,21.98.
[0058] 实施例5
[0059] 4，5-二羟基-氮-(2-吗啉基乙基）-9，10-二氧代-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺盐酸盐 (b5)
[0061] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"2-吗啉基乙胺"。
[0062] 咕 Mffi(600MHz，DMS0-d6)Sll.86(s，3H)，8.85(t，J = 5.4Hz，lH) ,8.10(d，J = 1.4Hz，lH)，7.81(t，J = 7.9Hz，lH)，7.73(d，J = 7.7Hz，2H)，7.39(d，J = 8.3Hz，lH)，3.65-3.51(m，4H)，3.41(q，J = 6.5Hz，2H)，2.51(d，J = 6.7Hz，2H)，2.44(s，4H).
[0063] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl92 · 67，182·30，165·10，162·55，162·32，142·89， 138.72,134.78,134.50,125.70,123.55,120.61,118.74,118.69,117.28,67.34,58.25, 54.41,37.93.
[0064] 实施例6
[0065] 1,8-二羟基-3-(4-吗啉基哌啶-1-羰基)蒽-9,10-二酮(b6)
[0067] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-吗啉基哌啶"。
[0068] ΧΗ NMR(400MHz, Deuterium 0xide)5ll. 92(s , 2H), 7.82(dd ,J = 8.3,7.6Hz , 1H), 7.71(dd ,J = 7.5,l.lHz,lH),7.59(d ,J=1.5Hz,lH),7.40(dd ,J = 8.4,l.lHz,lH),7.37(d, J = 1.5Hz,lH) ,4.44(d,J= 13.6Hz, 1H) ,3.66-3.43(m,5H) ,3.09(t,J = 12.6Hz, 1H) ,2.85 (t,J= 12.0Hz, 1H),2.45(d,J= 13.7Hz,5H),1.88(d,J= 12.8Hz, 1H) ,1.73(d,J= 13.2Hz, lH),1.52-1.32(m,2H).
[0069] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl92·57，182·24，167·32，162·53，162·43，145·70， 138.68,135.02,134.43,125.75,122.72,120.58,117.97,117.58,117.19,67.65,62.01, 50.53,47.23,41.78,29.31,28.58.
[0070] 实施例7
[0071 ] 4，5-羟基-9，10-二氧代-N-(2-吡咯烷-乙基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺(b7)
[0072] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"2-吡咯烷基乙胺"。
[0073] MS = 381.2
[0074] 实施例8
[0075] 4，5-羟基-9，10-二氧代-N-苯基-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺(b8)
[0077] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"苯胺"。
[0078] 4 NMR(500MHz，DMS0-d6)Sll.92(s，2H)，10.61(s，lH)，8.22(s，lH)，7.90(s，lH)， 7.84(t ,J = 7.9Hz,lH) ,7.80(d ,J = 7.9Hz , 2H), 7.76(d ,J = 7.3Hz , 1H), 7.42(d ,J = 8.4Hz , lH),7.38(t ,J = 7.7Hz,2H),7.15(d ,J = 7.3Hz,lH).
[0079] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl92 · 65，182·28，164·38，162·58，162·26，143 · 23， 139.77,138.77,134.80,134.51,129.86,125.75,125.41,124.05,121.77,120.66,119.16， 118.98,117.35.
[0080] 实施例9
[0081 ] 4，5-二羟基-9，10-二氧代-氮-对甲苯基- 9，10-二羟蒽-2-甲酰胺(b9)
[0083] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"对甲苯胺"。
[0084] ΧΗ NMR(600MHz,DMS0-d6)5ll.95(s,lH),11.89(s,lH),10.52(s,lH),8.20(s,lH), 7.89(s,lH) ,7.83(t,J = 7.7Hz,lH) ,7.75(d,J = 7.1Hz,lH) ,7.67(d,J = 7.7Hz,2H) ,7.41 (d ,J = 8.2Hz,lH),7.17(d ,J = 7.7Hz,2H),2.29(s,3H).
[0085] 13C 匪R(151MHz，DMS0-d6)Sl91.92,181.52,163.34,161.87,161.56,142.54， 138.06,136.55,134.02,133.76,133.71,129.53,125.02,123.29,121.02,119.95,118.47， 118.14,116.57,21.01.
[0086] 实施例10
[0087] 4，5-二羟基-9，10-二氧代-氮-(4-三氟甲基苯基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺(b 10)
[0089] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"对三氟甲基苯胺"。
[0090] 4 Mffi(600MHz，DMS0-d6)Sll.95(s，2H) ,10.95(s，lH)，8.24(s，1H)，8.05((1, J = 8.4Hz,2H),7.94(s,lH),7.86(t ,J = 7.9Hz,lH),7.78(t ,J = 9.0Hz,3H),7.44(d ,J = 8.4Hz, 1H).
[0091] 13C 匪R(151MHz，DMS0-d6)Sl91.92，181.60，164.25，161.88，161.53，142.74， 141.95,138.10,134.20,133.82,126.49,126.47,125.10,124.80(d,J=271.4Hz),124.63 (d,J = 32.0Hz), 123.54,120.93,119.97,118.57,118.45,116.70.
[0092] 实施例11
[0093] 4,5-二羟基-9，10-二氧代-氮-(5-(三氟甲基）吡啶- 2-基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰 胺(bll)
[0095] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"2-氨基-5-三氟甲基吡 啶"。
[0096] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5ll.95(s,lH),11.90(s,lH),11.73(s,lH),8.87-8.76 (m,lH),8.40(d ,J = 8.8Hz,lH),8.28(dd ,J = 8.8,2.2Hz,lH),8.23(d ,J=1.7Hz,lH),7.96 (d ,J = 1.7Hz,lH),7.90-7.81(m,lH),7.77(d ,J = 8.4Hz,lH),7.43(d ,J = 8.3Hz,lH).
[0097] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl92.63，182.20，165.93，162.58，162.13，156.13， 146.59(d，J = 3.8Hz) ,142.04,138.80，137.17(d，J = 3.3Hz) ,134.69,134.52,125.76， 124.98(d，J = 271.7Hz) ,124.72，122.26((1, J = 32.5Hz) ,120.65,119.64,119.34,117.43， 115.55.
[0098] 实施例12
[0099] 4,5-二羟基-9，10-二氧代-氮-(4-(三氟甲基）吡啶- 2-基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰 胺(bl2)
[0101] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"2-氨基-4-三氟甲基吡 啶"。
[0102] 4 Mffi(300MHz，DMS0-d6)Sll.92(s，lH)，11.86(s，lH)，11.74(s，lH),8.72-8.64 (m,lH),8.49(s,lH),8.25-8.17(m,lH),7.97-7.89(m,lH),7.87-7.79(m,lH),7.78-7.70 (m,1H),7.61-7.53(m，lH),7.46-7.33(m，lH).
[0103] 实施例13
[0104] 1，8-二羟基-3-(4-(羟甲基)哌啶-1-羰基)蒽-9,10-二酮(bl3)
[0106] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-轻甲基哌啶"。
[0107] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)Sll.95(s，lH)，11.89(s，lH)，7.81(t，J = 7.9Hz，lH)， 7.71(dJ = 7.2Hz,lH),7.61-7.53(m,lH),7.39(d,J = 8.3Hz,lH),7.36-7.30(m,lH),4.54-4.43(m,2H),3.51(d ,J=12.8Hz,lH),3.32-3.21(m,2H),3.08(t ,J = 12.3Hz,lH),2.79(t ,J =11.8Hz,lH),1.76(d,J=12.7Hz,1H),1.70-1.59(m,2H),1.23-1.02(m,2H).
[0108] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl92.56，182.22，167.38，162.53，162.45，145.90， 138.67,135.01,134.41,125.75,122.65,120.57,117.88,117.54,117.17,66.56,48.13, 42.61,39.53,30.17,29.31.
[0109] 实施例14
[0110] 1,8-二羟基-3-(4-哌啶基哌啶-1-羰基)蒽-9,10-二酮(bl4)
[0112] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-哌啶基哌啶"。
[0113] MS = 435.2
[0114] 实施例15
[0115] 1,8-二羟基-3-(4-(2-轻丙-2-基)哌啶-卜羰基)蒽-9,10-二酮(bl5)
[0117]合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-(2_轻丙-2-基)哌啶"。
[0118] 4 匪R(500MHz，DMS〇-d6)Sll .96(s，lH)，11.90(s，lH),7.86-7.79(m，lH),7.72 (dd，J = 7.5，1.0Hz，lH)，7.57(d，J=1.5Hz，lH)，7.40(dd，J = 8.4，1.0Hz，lH)，7.33(d，J = 1 ·5Ηζ，1Η)，4.55(d，J= 12.2Hz，1H)，4.16(s，lH)，3.54((1, J= 12.1Hz，1H)，3.02(t，J = 12.3Hz,lH), 2.68( t,J= 12.2Hz, lH),1.80(d,J= 12.3Hz, lH),1.65(d,J= 12.0Hz, 1H), 1.43(dt ,J = 12.1,3.0Hz, lH),1.18(ddd ,J = 30.0,12.2,3.0Hz, 2H),1.03(s,6H).
[0119] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl92.57，182.27，167.29，162.53，162.43，145.86， 138.68,135.03,134.45,125.76,122.68,120.58,117.92,117.58,117.22,71.25,48.66， 48.00,43.17,28.18,28.04,27.38.
[0120] 实施例16
[0121] 1，8-二羟基-3-(4-(N，N-二甲基)哌啶-卜羰基)蒽-9，10-:_(bl6)
[0123] 合成方法如实施例1，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-(N，N_二甲基)哌啶"。
[0124] ΧΗ NMR(400MHz,Methanol-d4)5ll.66(s,2H) ,7.84(t,J = 7.9Hz,lH) ,7.74(d,J = 7.4Hz,lH) ,7.65( s,lH) ,7.42( t,J = 4.0Hz,2H) ,4.60 (d,J= 12.5Hz, 1H) ,3.62(d,J = 13.0Hz,lH),3.45-3.27(m,lH),3.14(t,J=13.2Hz,1H),2.82(t,J=12.7Hz,1H),2.67(s, 6H),2.11(d ,J = 11.8Hz, lH),1.94(d,J = 11.4Hz, 1H), 1.75-1.58(m,2H).
[0125] 实施例17
[0126] 3-( (2-氯-4-(三氟甲基)苯基)氨基甲酰基)-9，10-二氧代- 9,10-二氢化蒽-u-二乙酸酯（cl)
[0128] 将大黄酸（284mg, lmmol)溶于醋酐（612mg，6mmol)中，再加入三氟甲磺酸锌（2mg, 0.005mmo 1)然后在130 °C下反应2h，反应结束后冷却至室温，过滤，粗产品在乙酸中重结晶 得到4，5-乙酰氧基-9，10-二氧代-9，10-二氢化蒽_2_駿酸。将4，5_乙酰氧基-9，10-二氧代-9，10-二氢化蒽-2-羧酸（368mg，lmmol)溶解到二氯甲烧（5mL)中，加入草酰氯（254mg， 2 mm〇l)，再加入一滴N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌1小时，将溶剂旋干后，用二氯甲烷溶解， 再加入2-氯-4-三氟甲基苯胺（200mg，1 · lmmol)和三乙胺（lmL)，室温搅拌4小时，用饱和氯 化钠溶液猝灭反应，并用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，过滤旋干，柱层 析分离得产物420mg(产率77% )。
[0129] ΧΗ NMR(600MHz,DMS0-d6)5l0.91(s,lH),8.72(d,J=1.8Hz,lH),8.19(dd,J = 7.7, Ι.ΙΗζ,ΙΗ) ,8.16(d ,J=1.8Hz,lH) ,8.06-8.03(m, 1H), 7.98(t ,J = 7.9Hz , 1H) ,7.90(d ,J = 8.3Hz,lH),7.84-7.81(m,lH),7.68(dd,J=8.0,l.lHz,lH),2.44(s,3H),2.42(s,3H).
[0130] 13C 匪R(151MHz，DMS0-d6)Sl81.41,180.77,169.56,169.51,163.56,150.15， 150.06,139.38,138.98,136.02,135.01,134.67,131.17,130.52,129.68,129.42,128.43 (d, J = 32.9Hz) ,127.94,127.33 (d,J = 4.1Hz) ,125.76,125.51,125.16(d,J = 3.9Hz), 124.36,123.80(d ,J = 272.4Hz),21.32,21.30
[0131] 实施例18
[0132] 3-(4-甲基哌啶)-1-羰基)-910-二氧代-9,10-二氢化蒽-1，8-二乙酸酯(c2)
[0134] 合成方法如实施例17，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-甲基哌啶"。
[0135] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)58.13(d,J = 7.7Hz,lH),8.01 (d,J= 1.5Hz, 1Η) ,7.94(t, J = 7.9Hz,lH) ,7.65(d,J=1.5Hz,lH) ,7.64(d,J = 8.0Hz,lH) ,4.44(d,J=12.6Hz,lH), 3.46(d ,J= 12.1Hz, 1H) ,3.08( t,J= 11.7Hz, 1H) ,2.80( t,J= 12.2Hz, 1H) ,2.39(s,6H), 1.72(d,J=12.4Hz,1H),1.67-1.59(m,lH),l.55(d,J=11.8Hz,1H),1.21-1.03(m,2H), 0.92(d ,J = 6.5Hz,3H).
[0136] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl80·93，180·18，168·99，168·93，165·73，149·62， 149.48，142.55，135.38，134.48，134.08，130.55，128.08，125.46，125.20，124.90，122.42， 47.20,41.76,33.87,33.19,30.31,21.47,20.81,20.79.
[0137] 实施例19
[0138] 9,10-二氧代-3-((4-三氟甲基)吡啶- 2-基)氨基甲酰基)-9，10-二氢化蒽-1>8-二 乙酸酯(c3)
[0140] 合成方法如实施例17,将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"2-氨基-4三氟甲基吡 啶"。
[0141] 咕 Mffi(500MHz，DMS0-d6)Sll.83(s，lH) ,8.71 (d，J = 5. ΙΗζ,ΙΗ)，8.69((1, J = 1.8Hz，lH)，8.52(s，lH)，8.20(d，J=1.8Hz，lH)，8.17(dd，J = 7.8，l.lHz，lH)，7.96(t，J = 7.9Hz，lH)，7.65(dd，J = 8.0，l.lHz，lH)，7.59(d，J = 5.0Hz，lH)，2.42(s，3H)，2.40(s，3H).
[0142] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl80.82，180.24，169.01，168.91，164.18，152.84， 150.04,149.53,149.44,139.13,138.34(q,J=33.3Hz),135.49,134.17,134.12,130.62, 129 ·46，127 · 34，125 · 26，124 · 97，124·46，122 · 86(q，J = 273.1Hz) ,115.61((1, J = 3.0Hz), 110.02(d ,J = 3.8Hz),20.80,20.75.
[0143] 实施例20
[0144] 9,10-二氧代-3-(4-(三氟甲基）苯基)氨基甲酰)-9,10-二氢化蒽-1，8-二乙酸酯 (c4)
[0146] 合成方法如实施例17，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-三氟甲基苯胺"。
[0147] ΧΗ NMR(300MHz,DMS0-d6)5l0.99(s,lH),8.66(s,lH),8.15(d,J = 8.1Hz,2H),8.01 (d,J = 8.3Hz,2H) ,7.94(t,J = 7.8Hz,lH),7.74(d,J = 8.6Hz,2H),7.63(d,J = 7.9Hz,lH), 2.42(s,3H),2.39(s,3H).
[0148] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl81.42，180.73，169.52，169.45，163.63，150.07， 150.05,142.67,140.21,135.98,134.87,134.63,131.15,129.63,127.70,126.48,126.46， 125.72,125.48,124.78(q,J = 271.4Hz) ,124.69(d,J = 31.8Hz) ,124.37,120.96,21.29, 21.27.
[0149] 实施例21
[0150] 9,10-二氧代-3-对甲苯氨基甲酰基-9,10-二氢化蒽-1，8-二乙酸酯(c5)
[0152] 合成方法如实施例17，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-甲基苯胺"。
[0153] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5l0.65(s,lH),8.66(d,J=1.8Hz,lH),8.17(dd,J = 7.8, 1.2Hz,lH) ,8.13(d ,J=1.8Hz,lH) ,7.96(t ,J = 7.9Hz,lH) ,7.68(d,J = 8.4Hz,2H) ,7.66 (dd ,J = 8.1,1.2Hz,lH),7.19(d ,J = 8.3Hz,2H),2.43(s,3H),2.40(s,3H),2.29(s,3H).
[0154] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl82.39，181.68，170.43，170.37，163.81，150.95， 150.94,141.73,137.39,136.88,135.72,135.57,134.74,132.02,130.49,130.35,128.33， 126.64,126.38,125.11,122.00,22.21,22.19,21.91.
[0155] 实施例22
[0156] 9,10-二氧代-3-(4-(三氟甲基）苯基)氨基甲酰)-9,10-二氢化蒽-1，8-二乙酸酯 (c6)
[0158] 合成方法如实施例17，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-三氟甲基苯胺"。
[0159] ΧΗ NMR(300MHz,DMS0-d6)5l0.99(s,lH),8.66(s,lH),8.15(d,J = 8.1Hz,2H),8.01 (d,J = 8.3Hz,2H) ,7.94(t,J = 7.8Hz,lH),7.74(d,J = 8.6Hz,2H),7.63(d,J = 7.9Hz,lH), 2.42(s,3H),2.39(s,3H).
[0160] 13C 匪R(126MHz，DMS0-d6)Sl81.42，180.73，169.52，169.45，163.63，150.07， 150.05,142.67,140.21,135.98,134.87,134.63,131.15,129.63,127.70,126.48,126.46， 125.72,125.48,124.78(q,J = 271.4Hz) ,124.69(d,J = 31.8Hz) ,124.37,120.96,21.29, 21.27.
[0161] 实施例23
[0162] 9,10-二氧代-3-(4-甲基-3-氯苯氨基甲酰基）-9,10-二氢化蒽-1，8-二乙酸酯 (c5)
[0163] 合成方法如实施例17，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"4-甲基-3氯苯胺"。
[0165] 实施例24
[0166] 9，10_二氧代-3-(( 5-三氟甲基）吡啶-2-基)氨基甲酰)-9，10_二氢化蒽-1>8二乙 酸酯(c8)
[0168] 合成方法如实施例17，将"2-氯-4-三氟甲基苯胺"替换为"2-氨基-5-三氟甲基吡 啶"。
[0169] ΧΗ NMR(600MHz,DMS0-d6)5ll.83(s,lH),8.83(s,lH),8.68(d,J=1.8Hz,lH),8.41 (d,J = 8.7Hz,lH) ,8.29(dd,J = 8.9,2.5Hz,lH),8.22(d,J=1.9Hz,lH) ,8.17(dd,J = 7.8, 1.2Hz,lH),7.97(t ,J = 7.9Hz,lH),7.66(dd ,J = 8.1,1.2Hz,lH),2.43(s,3H),2.41(s,3H).
[0170] 13C 匪R(151MHz，DMS0-d6)Sl81.32，180.74，169.54，169.43，164.64，155.43， 150.04,149.95,145.93(d, J = 4.1Hz) ,139.61,136.49(d,J = 3.7Hz) ,136.01,134.64, 134.61,131.14,130.06,127.86,125.75,125.48,125.04,124.28(d,J=271.3Hz),121.58 (d ,J = 32.7Hz),114.83,21.31,21.26.
[0171] 测试实施例 [0172]抗骨质疏松作用
[0173]本发明提供了大黄酸类化合物抑制破骨细胞形成方面的作用。
[0174] 1、主要实验材料与仪器
[0175] 材料:胎牛血清、α-ΜΕΜ培养基、0.25 %胰酶和青霉素/链霉素购自Gibco，抗酒石酸 酸性磷酸酶(TRAP)酶活性检测试剂盒与总蛋白测定试剂盒购自碧云天，17β-雌二醇（170_ estradiol，E2)、DMS0、甲苯胺蓝，MTT，TRAP染色试剂盒购自sigma，细胞因子如M-CSF和 mRANKL购自peprotech，细胞裂解液购自promega，PBS购自WI SENT公司，地塞米松、β-甘油磷 酸和抗坏血酸购自CAYMAN公司，RNAiso Reagent、反转录和PCR试剂盒购自TaKaRa公司，4周 龄C57BL/6小鼠购自斯莱克。
[0176] 细胞株:骨髓破骨前体细胞取自C57BL/6小鼠股骨与胫骨髓腔;骨髓间充质干细胞 mMSC购自赛业生物科技有限公司、成骨细胞细胞株MC3T3-E1购自上海中科院细胞库，细胞 正常传代培养时采用完全培养基，即α-ΜΕΜ+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素。
[0177] 仪器：Thermo scientific公司⑶2培养箱；LEICA SP 1600锯式切片机（德国）； Olympus倒置显微镜;上海新芝生物技术研究所超声波清洗机，Tecan公司酶标仪。
[0178] 2、实验方法：
[0179] 1)受试细胞株的制备：
[0180] C57BL/6小鼠断颈处死，75%酒精浸泡消毒，无菌条件下剥离四肢长骨（股骨、胫 骨），去除附着的软组织后用完全培养基反复冲洗骨髓腔，使髓腔的细胞彻底脱落，细胞悬 液用细胞筛过滤后，培养于l〇cm细胞培养皿。次日取上清细胞离心后，用添加有30ng/mL的 M-CSF的完全培养基将细胞悬起，重新再培养于新的10cm细胞培养皿中。两天后用细胞刮刀 将收集贴壁的破骨前体细胞，重悬并定量接种于细胞培养板内，于5%C0 2和饱和湿度条件 下培养过夜，次日换成含有M-CSF和mRANKL以及指定药物或药物溶剂DMS0的新鲜完全培养 液进行试验。
[0181 ] 2)MTT法检测大黄酸类化合物对骨髓破骨前体细胞存活率的影响：
[0182] 破骨细胞前体细胞以5000个/孔的浓度接种到96孔板，培养过夜。次日，实验组将 化合物用含有M-CSF(30ng/mL)的完全培养基稀释至药物终浓度为5mmol/L并加入细胞，每 孔加入l〇〇yL，对照组加入等量培养基和对应比例的DMS0，空白对照组不加细胞，但加入等 量培养基和对应比例的DMS0。培养48h后，每孔加入10yL MTT(5g/L)，置于培养箱中继续培 养2h。2h后，去除细胞培养液，每孔加入100yL DMS0，震荡10分钟使细胞内紫色结晶充分溶 解。利用TECAN酶标仪，于490nm波长处检测其吸光度值，并计算细胞存活率，存活率(PR% ) =(A纖且一Asm齟)/(A*fM-Asm齟）X 100% 〇
[0183] 3)MTT法检测大黄酸类化合物对成骨细胞存活率的影响：
[0184] 将MC3T3-E1成骨细胞以5000个/孔的浓度接种到96孔板，培养过夜。次日，实验组 将化合物用完全培养基稀释至药物终浓度为5ymol/L并加入细胞，每孔加入100yL，对照组 加入等量培养基和对应比例的DMS0，空白对照组不加细胞，但加入等量培养基和对应比例 的DMS0。培养48h后，每孔加入10yL MTT(5g/L)，置于培养箱中继续培养后，去除细胞 培养液，每孔加入IOOpLDMSO，震荡10分钟使细胞内紫色结晶充分溶解。利用TECAN酶标仪， 于490nm波长处检测其吸光度值，并计算细胞存活率，存活率(PR% ) = (A_"A空自棚龃)/ (Assia-Asm齟）X 100% 〇
[0185] 4)大黄酸类化合物对破骨细胞TRAP活性影响的测试：
[0186] 骨髓破骨细胞前体细胞以5000个/孔的浓度接种到96孔板，培养过夜。次日，实验 组将化合物用含有M-CSF和mRANKL的完全培养基稀释至药物终浓度为5mmol/L并加入细胞， 每孔加入l〇〇yL，对照组加入等量培养基和对应比例的DMSO。细胞培养2天后去除培养液， PBS清洗细胞后，按照TRAP酶活性检测试剂盒说明书进行操作，反应30min后终止反应。在 405nm波长处测定其吸光度值，并换算出酶活力。
[0187] 5)大黄酸类化合物对破骨细胞形成影响的测试(TRAP染色法）：
[0188]将骨髓破骨前体细胞以每孔5000个/孔的浓度接种到96孔板，每孔100yL，培养过 夜。次日，将化合物用含有M-CSF和mRANKL的完全培养基稀释大黄酸类化合物药物并加入细 胞，使其终浓度均为5ymol/L，每孔加入100yL，对照孔加入等量培养基和对应比例的DMS0。 细胞培养2天后，更换一次含有药物的新鲜培养液。4天后破骨细胞融合并形泡状结构，用 PBS清洗细胞后，4%的多聚甲醛固定细胞10分钟，再用PBS清洗。按照TRAP染色试剂盒配制 TRAP染色液，将染色液加入已固定好的细胞内，置于37°C反应lh左右，倒置显微镜观察并拍 照，并以多3个细胞核的破骨细胞样细胞计数。
[0189] 6)大黄酸类化合物对破骨细胞分化过程相关基因影响的分析(实时荧光定量PCR (RT-PCR))：
[0190] 将骨髓破骨前体细胞接种至6孔板，培养过夜。次日，将化合物用含有M-CSF和 mRANKL的完全培养基稀释大黄酸类化合物药物并加入细胞，使其终浓度均为5μΜ，对照孔加 入等量培养基和对应比例的DMS0。于药物培养3天后提取总RNA，RT-PCR法检测TRAP、 NFATC1、c-f os、mmp-9和CTSK的表达水平。引物由TaKaRa公司合成。总RNA的提取采用Trizo 1 一步法进行，紫外分光光度计检测纯度和浓度，反转录体系、PCR扩增体系及反应条件均参 照试剂盒说明书设定，经内参校正，求得目的基因的相对表达量。
[0191] 7)大黄酸类化合物对破骨细胞骨吸收功能的影响(骨吸收陷窝分析）：
[0192] 取新鲜牛股骨，剥离附着的软组织，用锯式切片机将皮质部切成100μπι厚的骨片， 修剪成合适大小，超声波清洗后，浸泡于75 %酒精。使用前取出浸泡于100 %酒精内10min， 晾干后紫外灯照射，置于96孔板中，并加入完全培养基培养SOminJOmin后去除培养基，并 加入骨髓破骨前体细胞。待细胞贴壁后，将培养液换成含有指定浓度的大黄酸类化合物的 含有M-CSF和RAN KL的完全培养基，对照孔加入等量培养基和对应比例的DMS0。培养7天后 弃培养液(其中每两天换液一次），2.5%戊二醛固定骨片7min，在0.25mol/L氢氧化氨中超 声清洗5分钟，超声3次后，1 %甲苯胺蓝染液染色3分钟，蒸馏水清洗，镜下观察并拍照。用 Image Pro Plus 6.0软件(USA Media Cybernetics公司）分析骨片上骨吸收陷窝的面积。
[0193] 3、结果：
[0194] (1)本发明的大黄酸类化合物对骨髓破骨前体细胞的毒性作用研究。
[0195] 选择5μΜ的大黄酸类化合物与骨髓破骨前体细胞进行共孵育，并通过MTT对存活细 胞进行检测，结果如表1所示。试验结果表明：本发明的大黄酸类化合物b4、b6、bl3、bl5、c2 对骨髓破骨前体细胞无明显毒性。
[0196]表1.大黄酸类化合物对骨髓破骨前体细胞的存活的影响
[0199] (2)本发明的大黄酸类化合物对破骨细胞分化的TRAP活性的抑制作用研究
[0200] 通过上述毒性试验结果，我们选取上述对骨髓破骨前体细胞无明显毒性的大黄酸 类化合物进行试验，并通过M-CSF和mRANKL对骨骨髓破骨前体细胞进行破骨分化的诱导，检 测大黄酸类化合物对分化过程中TRAP活性的影响。如表2所示，结果表明：本发明的大黄酸 类化合物b6、bl3、bl5对骨髓破骨细胞分化过程中的TRAP活性有着非常好的抑制作用，其中 b6对TRAP活性的抑制率达到98.22%。
[0201 ]表2.大黄酸类化合物对骨髓破骨前体细胞分化TRAP活性的抑制作用
[0203] (3)本发明的大黄酸类化合物对破骨细胞形成的影响
[0204] 选取对TRAP活性抑制作用最优的大黄酸类化合物b6,干预骨髓破骨前体细胞破骨 分化，分化结束后通过TRAP对破骨细胞进行染色，并以2 3个细胞核为破骨细胞样细胞计 数，如图1和表3所示，试验结果表明：本发明的大黄酸类化合物b6在5μΜ浓度下能有效抑制 破骨细胞的形成。
[0205]表3.大黄酸类化合物对破骨细胞形成数量的影响
[0207] (4)本发明的大黄酸类化合物对成骨细胞的毒性作用研究
[0208]为了研究大黄酸类化合物b6是否对成骨细胞的存活有影响，我们选取5μΜ的大黄 酸类化合物与MC3T3-E1成骨细胞进行共孵育，并通过ΜΤΤ对存活细胞进行检测，结果如表4 所示。试验结果表明：本发明的大黄酸类化合物b6在5μΜ浓度下对成骨细胞无明显毒性。 [0209]表4大黄酸类化合物b6对成骨细胞存活的影响
[0211] (5)本发明的大黄酸类化合物对骨髓间充质干细胞的毒性作用研究。
[0212]为了研究大黄酸类化合物b6是否对骨髓间充质干细胞的存活有影响，我们选取5μ Μ的大黄酸类化合物与骨髓间充质干细胞MSC进行共孵育，并通过ΜΤΤ对存活细胞进行检测， 结果如表5所不。试验结果表明：本发明的大黄酸类化合物b6在5μΜ浓度下对MSC无明显毒 性。
[0213]表5大黄酸类化合物b6对骨髓间充质干细胞存活的影响
[0215] (6)本发明的大黄酸类化合物对破骨细胞骨吸收功能的影响结果
[0216] 选取对TRAP活性抑制作用最优的大黄酸类化合物b6,干预骨髓破骨前体细胞破骨 分化时对牛骨骨片的骨吸收作用。分化结束后通过甲苯胺蓝对骨片进行染色，并统计骨吸 收的面积。如图2所示，试验结果表明：本发明的大黄酸类化合物b6在5μΜ浓度下能有效抑制 破骨细胞骨吸收的功能。
[0217] ⑴本发明的大黄酸类化合物对破骨细胞特异性mRNA表达的影响结果。
[0218] 选取对TRAP活性抑制作用最优的大黄酸类化合物b6,干预骨髓破骨前体细胞破骨 分化，研究大黄酸类化合物b6对破骨分化及破骨行使功能时关键基因 mRNA的影响。如图3所 示，试验结果表明：本发明的大黄酸类化合物b6在5μΜ浓度下能有效抑制破骨细胞分化及骨 吸收关键基因如即六1^1，^〇8，了1^?，11?-9,〇3让印8丨111(的表达。
【主权项】
1. 一类具有如下结构通式的大黄酸类化合物： 其中，Ri选自氢或乙酰基； 尺2，1?3相同或不同，并且各自独立地为氢、(：1-06直链或支链烃基工3-08饱和杂环基(：1-C4烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代5-7元杂芳基;优选为氢、哌啶基C1-C2烷基、吗 啉基C1-C2烷基、吡咯基C1-C2烷基、取代或未取代苯基、取代或未取代的吡啶基;或者R2、R3 和它们连接的氮原子一起形成被羟基取代或无取代的C1-C6直链或支链烃基取代的C3-C8 饱和杂环基、C5-C6饱和杂环基取代的C3-C8饱和杂环基、取代或未取代芳基取代的C3-C8饱 和杂环基、C1-C6烷基取代的氨基取代的C3-C8饱和杂环基;所述"取代或未取代"的定义是 指被选自如下的一种或多种取代基所取代:羟基、卤素、三氟甲基、C1-C6烷基。2. 如权利要求1所述的大黄酸类化合物， 其中， Ri选自氢或乙酰基； R2和R3其中一个为氢，另一个选自2-氯-4-三氟甲基苯基、1-吡咯乙基、4-吗啉乙基、苯 基、4-甲基苯基、4-氟苯基、3-三氟甲基吡啶-2-基;或者R2、R3和它们连接的氮原子一起形成 4-甲基-1-哌嗪基、4-乙基-1-哌嗪基、4-苯基-1-哌嗪基、4-(吗啉-1-基)-1-哌啶基、4-羟甲 基-1-哌啶基、4-(2-异丙醇基)-1-哌啶基。3. 如权利要求1所述的大黄酸类化合物，所述大黄酸类化合物选自如下具体化合物：4.权利要求1-3中任一项所述的大黄酸类化合物在制备预防和/或治疗破骨细胞活性 异常导致的疾病的药物中的用途。
【文档编号】C07D295/192GK105884645SQ201610297815
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】江敏, 徐醒, 漆学宇, 杨春皓, 邓廉夫
【申请人】上海市伤骨科研究所, 中国科学院上海药物研究所