一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法，所述5种黄酮类化合物为7?羟基二氢黄酮、5,7?二羟基?4’?甲氧黄酮醇、5,7?二羟基双氢黄酮、2’,4’?二羟基?查尔酮和2’,4’?二羟基二氢查尔酮，该方法是高速逆流色谱法。本发明以镰形棘豆为原料，所得产品纯度均大于99％，制备量大，产品纯度高，适合于工业应用。
【专利说明】
一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及天然药物领域，具体涉及从镰形棘豆中分离制备7-羟基二氢黄酮、5， 7-二羟基-4'-甲氧黄酮醇、5,7-二羟基双氢黄酮、2'，4'_二羟基-查尔酮和2'，4'_二羟基二 氢查尔酮的方法。
【背景技术】
[0002] 黄酮类化合物是两个苯环通过中央三碳相互联接而成的一系列化合物。母体结构 包括包括黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类以及查尔酮类等。
[0003] 藏药镰形棘豆（Oxytropis falcate Bunge)(藏药名为莪达夏）是豆科 (Leguminosae)棘豆属(Oxytropis D.C.)多年生草本植物。生长在2700~4300m的河滩、沙 地、山坡、草甸，主要产于青藏高原。据《晶珠本草》记载，镰形棘豆具有愈合疮口、利便、防止 骨刺产生、治病痛、除毒、止血之功效，并能清毒、治疗炭疽病、麻风病及流感、扁桃体炎。
[0004] 临床研究证明，镰形棘豆对于预防、治疗流行性感冒及慢性气管炎有独特疗效。并 且，药理实验证明镰形棘豆总黄酮苷元是治疗慢性气管炎的有效部分，并能增加肾上腺皮 质功能，说明黄酮类化合物是镰形棘豆的重要活性成分。
[0005] 众所周知，由于植物中化合物种类众多且含量不一，从植物中直接大量获得有实 用价值的高纯度化合物是极为困难的，尤其当需要从中同时提取出多个目标化合物时，则 更为艰难。因此目前，尽管已知镰形棘豆中包含多种黄酮类化合物，却并没有以其为原料， 同时得到多种高纯度活性化合物的报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的 方法，其特征在于:所述5种黄酮类化合物为7-羟基二氢黄酮、5，7-二羟基-4 ' -甲氧黄酮醇、 5,7_二羟基双氢黄酮、2'，4'_二羟基-查尔酮和2'，4'_二羟基二氢查尔酮，包括以下步骤：
[0007] 利用高速逆流色谱法分离制备5种黄酮类化合物：
[0008] (a)取镰形棘豆提取物，溶于进样溶剂中，制备得到进样溶液；
[0009] (b)将进样溶液注入高速逆流色谱仪，检测收集所述5种黄酮类化合物的流分，除 去溶剂，即得7-羟基二氢黄酮、5,7_二羟基-4'-甲氧黄酮醇、5,7_二羟基双氢黄酮、2'，4'_ 二羟基-查尔酮和2'，4'-二羟基二氢查尔酮。
[0010] 所述高速逆流色谱法的固定相为两相溶剂体系的上相，流动相为两相溶剂体系的 下相;所述两相溶剂体系由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水= 10:4:10:10(v/v)组成。
[0011] 进一步地，所述进样溶剂是由所述上相和下相按照1:1的体积比组成的溶剂;所述 进样溶剂与提取物的体积质量比为1:1~1:30mL/mg。
[0012] 进一步地，所述高速逆流色谱仪中分离管的转速为700-900rpm。
[0013] 进一步地，所述流动相的流速为1.5-4mL/min，
[0014] 进一步地，所述检测的波长为210-400nm。
[0015] 进一步地，所述检测的波长为280nm。
[0016] 进一步地，所述步骤(a)的镰形棘豆提取物中，其含有不低于8%w/w的7-羟基二氢 黄酮，不低于7.5 % w/w的5,7-二羟基-4'-甲氧黄酮醇，不低于11 % w/w的5,7-二羟基双氢黄 酮，不低于19%w/w的2'，4'_二羟基-查尔酮和不低于13%w/w的2'，4'_二羟基二氢查尔酮。
[0017] 进一步地，所述提取物由下述方法制备得到：
[0018] (1)取镰形棘豆，5-95%的乙醇提取，合并提取液，回收乙醇得到镰形棘豆乙醇粗 提物；
[0019] (2)将步骤（1)中的乙醇粗提物加水溶解，依次用石油醚和乙酸乙酯洗涤水相，将 洗涤后的水相上大孔吸附树脂，依次用水、20~80%的乙醇作为洗脱液梯度洗脱，收集80% 的乙醇洗脱液，回收乙醇即得。
[0020] 进一步地，所述步骤(1)中采用75%的乙醇提取。
[0021] 进一步地，所述步骤(2)中的梯度洗脱是依次用水、20 %的乙醇、40 %的乙醇、60 % 的乙醇、80 %的乙醇作为洗脱液梯度洗脱，洗脱体积为2~50倍柱床体积。
[0022]本发明以镰形棘豆为原料，分离制备得到了 7-羟基二氢黄酮、5,7_二羟基_4'_甲 氧黄酮醇、5,7_二羟基双氢黄酮、2'，4'_二羟基-查尔酮和2'，4'_二羟基二氢查尔酮，产品 纯度均大于99%。该方法制备量大，产品纯度高，适合于工业应用。
[0023] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0024] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明镰形棘豆提取物的高效液相色谱图。
[0026] 图2为本发明镰形棘豆提取物的高速逆流色谱图。
[0027] 图3-7依次为化合物A~E的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0028] 仪器:TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司）；AlCmprime栗及 紫外检测系统（美国GE公司）；HX-1050恒温循环器(北京博医康实验仪器有限公司）；N2000 色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司）；Agilent 1200 HPLC仪，Eclipse XDB-C18 (5"111，4.6*150111111)，613158紫外-可见检测器(美国安捷伦科技有限公司）。01^100(^智能超 声波清洗器(昆山仪器有限公司）;AM600核磁共振仪(瑞士Broker公司）。
[0029]试剂：乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙酸乙酯和正己烷均为分析纯，HPLC分析用甲醇为色 谱纯（山东禹王公司）；实验用水为超纯水;D101大孔树脂(南开大学化工厂）。
[0030] 实施例1本发明方法
[0031] 1.本发明镰形棘豆提取物的制备
[0032] 取干燥的镰形棘豆全草500g，切碎至0.5~1.0cm碎段，加10倍体积的75 %乙醇，于 80°C回流提取3次，每次2h，合并提取液并减压浓缩至无醇味，得浸膏180g。将浸膏加水悬浮 后，置于分液漏斗中，用石油醚(沸点60~90°C)进行萃取，直至石油醚萃取溶液无色。取水 相，再用乙酸乙酯萃取，反复多次，直至乙酸乙酯萃取部无颜色。萃取后剩余水溶性部位上 D101大孔树脂柱，依次用纯水、20 %的乙醇、40 %的乙醇、60 %的乙醇、80 %的乙醇洗脱，洗 脱体积为柱床体积的20倍，每三个柱体积洗脱液相合并，将80 %的乙醇洗脱部分浓缩至干， 得浸膏20g，即得镰形棘豆提取物。
[0033] 2.高速逆流色谱分离纯化镰形棘豆提取物中的5种黄酮类化合物 [0034] 按照正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=10:4:10:10的体积比配制溶剂洗脱于分液漏斗 中，充分摇动后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，以上相为固定相，下相为流动相。 取200mg步骤1中制得的镰形棘豆提取物，溶于10mL上下相混合液(上下相的体积比为1:1) 中，制备得到进样溶液。
[0035] HPLC分析条件如下：
[0036] 色谱柱：C18 (5μπι，4 · 6*250mm);流动相A:甲醇，B:水；梯度程序：0~5min，60 %~ 65 %甲醇；5~35min，65 %~75 %甲醇；流速lml/min;柱温20摄氏度；检测波长280nm;进样 量为10ul。此条件样品的HPLC色谱图如图1所示。
[0037]用最大流速(30ml/min)将溶剂系统上相栗入主机并充满分离螺线管，开启循环水 浴并将温度设定为25°C。开启主机电源以900r/min正向旋转，待转速稳定后，栗入流动相， 待流动相从管柱出口流出且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处流出液在 360nm波长下连续检测。
[0038]高速逆流色谱图如图2所示，根据该色谱图手动收集流分A~E。
[0039]结果显示，本发明方法可以从200mg待分离的镰形棘豆提取物中一次性分离制备 得到18mg化合物A、17mg化合物B、24mg化合物C、40mg化合物D和28mg化合物E，化合物的结构 表征数据如下：
[0040] 化合物A为7-羟基二氢黄酮（7-hydroxyf lavonone)。核磁数据为：4 NMR spectrum(DMS0,600MHz)SH:7.68(lH，d，J=8.5Hz，H-5)，7.30~7.45(5H，m，H-2'~6'）， 6.46(lH,dd, J = 8.5,2.5Hz,H-6) ,6.33( lH,d,J = 2.5Hz,H-8) ,5.43( lH,dd,J = 13.0, 3.0Hz,H-2),2.97(lH,dd,J=17.0,13.0Hz,H-3a),2.71(lH,dd,J=17.0,3.0Ηζ,Η-3β)； 13C-NMR(DMS0，125MHz)S :192.9(C-4)，166.8(C-7)，165.3(C-8a)，140.6(C-l'），129.8(C-3'，5'），129.6(C-4'），129.5(C-5)，127.3(C-2'，6'），115.0(C-4a)，111.8(C-6)，103.8(C- 8),81.0(C-2),45.1(C-3).
[0041 ]化合物B为5,7-二羟基-4' -甲氧黄酮醇（5,7_dihydroxy-4' -methoxy f lavonol)。 核磁数据为1H NMR spectrum(DMS0,600MHz)SH:8.09(2H，d，J = 8.0Hz H-2'，6'），6.90(2H, d，J = 8.0Hz H-3'，5'），6.55(lH，d，J = 1.5Hz H-6'），6.27(lH，d，J = 1.5Hz H-8)，3.83(3H， s，C4'-0CH3);13C-NMR(DMS0,125MHz)，δ: 148.6(02)，137.4(03)，177.5(04)，158.2(C-5)，98.6(C-6)，167.1(C-7)，94.6(C-8)，160.7(C-9)，105.5(C-10)，123.7(C-1'），130.7(C-2'），116.4(C-3'），162.3(C-4'），116.4(C-5'），130.7(C-6'），56.5(C4'-0CH3).
[0042] 化合物(：为5,7-二羟基双氢黄酮（5,7_(1让7扣(《7釘3￥311〇116)。核磁数据为 1!1匪1? spectrum(DMS0,600MHz)SH: 12. l(lH，s，5-OH)，10.8(lH，s，7-OH),7.37~7.53(5H，m，Ph H),5.95(lH,d,J = 2.0Hz,H-6),5.93(lH,d,J = 2.0Hz,H-8) ,5.56(lH,dd,J= 12.5,3.0Hz, H-2),3.22(lH，dd，J=12.6,15.0Hz，H-3a)，2.78(lH，dd，J=15.0,3.0Hz,H-3b).13C-匪R (DMS0，125MHz)j:79.2(C-2)，43.4(C-3)，195.8(C-4)，164.1(C-5)，95.1(C-6)，168.0(C- 7)，94.2(C-8)，162.7(C-9)，103.1(C-10)，138.3(C-1'），126.1(C-2'），128.8(C-3'），128.8 (C-4'），128.8(05'），126.5(C-6'）·
[0043] 化合物D为2'，4'_二羟基-查尔酮（2'，4' -dihydroxychalcone)。核磁数据为1H 匪R spectrum(DMS0，600MHz)δΗ:6·359(1H，d，J = 2·3Hz，H-3 '），6·47(1H，dd，J = 8·5， 2.3Hz，H-5'），7.48(3H，m，H-2,4,6)，7.77(lH，d，J=15.4Hz，H-a)，7.84(2H，m，H-3,5),7.85 (lH,dJ=15.4Hz,H-e),8.07(lH,d,J = 8.5Hz,H-6，)；13C-NMR(DMS0,125MHz),5：144.6(C-β),120.8(C-a),191.9(C=0),134.1(0-1),128.9(C-2,6),128.3(C-3,5),131.4(C-4), 113.8(C-r),166.1(C-2'），103.7(C-3'），166.4(C-4'），108.0(C-5)，131.9(C-6'）·
[0044] 化合物E为2'，4'_二羟基二氢查尔酮(4' -dihydroxy-dihydrochalcone)。核磁数 据为1H spectrum(DMS0,600MHz)SH:7.63(lH，d，J = 8.4Hz，H-6'），7.30(2H，m，H-3,5)， 7.25(2H，m，H-2,6)，7.21(lH，m，H-4)，6.37(lH，brs，H-3'），6.35(lH，dd，J=8.4,2.4Hz，H-5'），3.22(2H，t，H-a)，3.O4(2H，t，H-0).13C-NMR(DMS0，125MHz)，S :203.8(C0)，165.0(C-4'），162.7(C-2)，140.7(C-1)，132.2(C-6'），128.6(C-3,5)，128.3(C-2,6)，126.3(C-4)， 113.7(01'），107.9(05'），103.5(C-3'），39.6(C-a)，30.3(Οβ).
[0045] HPLC检测纯度均大于99%，结果分别如图3-7所示。
[0046] 实施例2分离制备5种黄酮类化合物工艺条件的筛选
[0047] 发明人主要对高速逆流色谱中的溶剂系统进行了筛选。
[0048] 在高速逆流色谱中，溶剂系统的选择至关重要，合适的溶剂系统是天然药物中活 性成分分离纯化的关键。合适的两相溶剂系统应满足下列要求:分层时间小于30s;目标化 合物在两相中具有合适的分配系数，一般分配系数K要满足:0.5〈K〈5.0。分离度一般大于 1.5。本发明采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，筛选结果如表1所示：
[0049] 表1溶剂系统的筛选
[0050]
[0051 ] 结果显示，本发明的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=10:4:10:10的溶剂系统效果最 佳，而其他比例不适合，具体分析如下：
[0052] (1)比例10:10:10:10:各个化合物分配系数较大。
[0053] (2)比例6:10:10:10:化合物5分配系数较小。
[0054] (3)10:10:8:10:化合物4分配系数小。
[0055] (4)10:2:10:10:化合物1分配系数较小。
[0056] (5)10:10:6:10:化合物2分配系数较小。
[0057] (6) 10:10:10:8:各化合物分配系数合适，但化合物2与4分离度不佳。
[0058] (7) 10:10:10:6:各化合物分配系数合适，但化合物2与4分离度不佳。
[0059] (8) 10:10:12:10:各化合物分配系数合适，但化合物2与4分离度不佳。
[0060] 综上所述，本发明以镰形棘豆为原料，从中同时分离制备得到了 7-羟基二氢黄酮、 5，7-二羟基-4'-甲氧黄酮醇、5,7-二羟基双氢黄酮、2'，4'_二羟基-查尔酮和2'，4'_二羟基 二氢查尔酮，产品纯度均大于99%。该方法制备量大，产品纯度高，适合于工业应用。
【主权项】
1. 一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法，其特征在于:所述5种黄酮类 化合物为7-羟基二氢黄酮、5，7-二羟基-4 甲氧黄酮醇、5，7 -二羟基双氢黄酮、2 '，4 二羟 基-查尔酮和2 '，4 二羟基二氢查尔酮，包括以下步骤： 利用高速逆流色谱法分离制备5种黄酮类化合物： (a) 取镰形棘豆提取物，溶于进样溶剂中，制备得到进样溶液； (b) 将进样溶液注入高速逆流色谱仪，检测收集所述5种黄酮类化合物的流分，除去溶 剂，即得7-羟基二氢黄酮、5，7-二羟基-4 ' -甲氧黄酮醇、5，7-二羟基双氢黄酮、2 '，4 二羟 基-查尔酮和2'，4'-二羟基二氢查尔酮 所述高速逆流色谱法的固定相为两相溶剂体系的上相，流动相为两相溶剂体系的下 相;所述两相溶剂体系由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水= 10:4:10:10(v/v)组成。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述进样溶剂是由所述上相和下相按照1: 1的体积比组成的溶剂;所述进样溶剂与提取物的体积质量比为1:1~1:30mL/mg。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述高速逆流色谱仪中分离管的转速 为700-900rpm。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述流动相的流速为1.5-4mL/min。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测的波长为210-400nm，优选 280nm〇6. 据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(a)的镰形棘豆提取物中，其含有不 低于8 % w/w的7-羟基二氢黄酮，不低于7.5 % w/w的5,7-二羟基-4'-甲氧黄酮醇，不低于 11 %w/w的5,7-二羟基双氢黄酮，不低于19%w/w的2'，4'_二羟基-查尔酮和不低于13%w/w 的2'，4'-二羟基二氢查尔酮。7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述提取物由下述方法制备得 到： (1) 取镰形棘豆，5-95%的乙醇提取，合并提取液，回收乙醇得到镰形棘豆乙醇粗提物； (2) 将步骤（1)中的乙醇粗提物加水溶解，依次用石油醚和乙酸乙酯洗涤水相，将洗涤 后的水相上大孔吸附树脂，依次用水、20~80%的乙醇作为洗脱液梯度洗脱，收集80%的乙 醇洗脱液，回收乙醇即得。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述步骤(1)中采用75 %的乙醇提取。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中的梯度洗脱是依次用水、 20 %的乙醇、40 %的乙醇、60 %的乙醇、80 %的乙醇作为洗脱液梯度洗脱，洗脱体积为2~50 倍柱床体积。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述洗脱体积为20倍柱床体积。
【文档编号】C07D311/32GK105884736SQ201610244243
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】陈晨, 李玉林, 陈涛, 刘永玲, 李红梅
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所