一种α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法
【专利摘要】一种α?鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，涉及分离材料领域看，包括以下步骤：S1将模板分子与功能单体、交联剂、溶剂混匀；S2将载体表面进行巯基化处理；S3将S2处理得到的载体加入S1制得的混合溶液中，与功能单体交联聚合；S4将模板分子从聚合后的载体表面洗脱；S5将S4处理得到分子印迹材料真空干燥。本发明实验操作简便，无须通氮、除氧，且用三乙胺调节反应体系pH值即可引发反应，反应条件温和，时间短，此方法较传统制备分子印迹方法表现出极大的优越性。
【专利说明】
_种01-鹤當毒肽分子印迹材料制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种分离材料，尤其涉及一种α-鹳膏毒肽分子印迹材料制备方法。
【背景技术】
[0002] 鹅膏毒肽又名鹅膏毒素，英文名为amanitin，是从剧毒磨菇中分离出来的一种多 肽物质，也是一类重要生化试剂，鹅膏毒素在分子生物学、发育生物学、遗传学、生物化学、 医学、生物防治等领域具有广泛的应用价值。鹅膏毒肽是一类双环八肽，已分离纯化的天然 ,T^jn^a-amanitin^-amanitin, γ -amanitin, ε-amanitin,amanin, amaninamide,amanu 11 in,amanu 11 inic acid，和proamanullin。其中α-amanitin的结构式 如下：
[0004] 分子印迹是集分析化学、高分子材料及仿生生物工程等多学科发展起来的新型 "人工受体"合成技术。目前分子印迹技术最成功的应用是识别有机小分子，用于识别多肽 及蛋白质的成功实例非常有限，其原因是生物大分子结构复杂及热力学因素等，另一主要 原因是多肽和蛋白质价格昂贵，通常难以获得足够量用于制备分子印迹聚合物。
[0005] MIP分子印迹材料，相对于NIP分子印迹材料，有更高的吸附容量和更好的选择性， 但传统的聚合方式实验操作复杂，条件苛刻，需无氧环境，并且后续处理过程相对冗长、费 时费力、颗粒均一性较差、原料利用率较低。因此，寻求一种简单高效制备鹅膏毒肽分子 印迹材料(α-amanitin-MIP)的制备方法至关重要。
【发明内容】
[0006] 针对上述技术问题，本发明提供一种α_鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，包括以 下步骤：
[0007] S1:将模板分子与功能单体、交联剂、溶剂混匀；
[0008] S2:将载体表面进行巯基化处理；
[0009] S3:将S2处理得到的载体加入S1制得的混合溶液中，通过功能单体与模板分子交 联聚合；
[0010] S4:用洗脱液将模板分子从聚合后的载体表面洗脱，得到分子印迹材料；
[0011] S5:将S4处理得到分子印迹材料真空干燥；
[0012] 其中，S3步骤中的聚合条件为：用碱将聚合反应液pH调至7~9，40 °C~50 °C下反应 6~12h;所述模板分子为N-乙酰色氨酸丙酰胺。
[0013]以α-鹳膏毒肽分子的一个作用位点，设计合成了α-鹳膏毒肽的特异性识别决定区 作为模板，利用表面印迹法，在二氧化硅载体上修饰制备了专一性吸附鹅膏毒肽的印迹材 料。
[0014]具体地，所述S1中功能单体为3-巯基丙酸;所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯； 所述溶剂为二甲基亚砜。
[0015]具体地，所述S1中模板分子与功能单体的摩尔比例为0.15:1~0.25:1，所述功能 单体与交联剂的摩尔比例为1:2。
[0016] 具体地，所述S1中模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例为0.2:1:2。
[0017] 具体地，所述S1中还包括辅助交联剂，所述辅助交联剂为季戊四醇四-3-巯基丙酸 酯，，所述辅助交联剂与交联剂的摩尔比例为9:4。
[0018] 具体地，所述S2中的巯基化处理方法包括如下步骤：
[0019] S2a:取载体，溶于水中，加甲醇超声使其分散；
[0020] S2b:向S2a得到的反应液中加入甘油，再超声，超声后通入氮气；
[0021] S2c:取（3-巯丙基)_三乙氧基硅烷与甲醇混合均匀，加入S2b得到的反应液中，搅 拌使其混合均匀；
[0022] S2d:向S2c得到的反应液中加入氨水，85°C氮气保护下反应lh后，停止氮气，再反 应5h;
[0023] S2e:反应结束后离心收集载体，用无水乙醇和去离子水分别洗涤，40°C下真空干 燥即得。
[0024]具体地，所述S3中的碱为三乙胺。
[0025]具体地，步骤S4中所述洗脱液分为第一洗脱液和第二洗脱液，第一洗脱液为甲醇 与乙酸的体积比为9:1的混合溶液，第二洗脱液为甲醇。
[0026] 具体地，所述S5中的真空干燥温度为40~50°C。
[0027]本发明采用藉配体识别决定区印迹策略，利用抗原决定基(短肽片段）印迹，制备 识别多肽和蛋白质的MIPs。利用硫醇-烯点击反应制备分子印迹聚合物，实验操作简便，无 须通氮、除氧，且用三乙胺调节反应体系pH值即可引发反应，反应条件温和，时间短，此方法 较传统制备分子印迹方法表现出极大的优越性。
[0028]本发明解决MIPs识别生物大分子过程中的传质速率慢和吸附容量较低等问题，拟 采用硅小球表面印迹法和沉淀聚合印迹法等，研制具有纳米结构的表面印迹微球和MIPs纳 米粒子，制备性能优异的新型分离材料。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明旨在选择鹅膏毒肽的一个识别位 点，设计合成鹅膏毒肽的特异性识别决定区作为模板，采用巯基化二氧化硅微球，并利用表 面印迹的方法，通过巯基与双键之间的点击反应在二氧化硅表面合成了 α-鹅膏毒肽-MIP分 子印迹材料。
[0030] 为了更好地理解和实施，下面详细说明本发明。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1:模板分子的制备
[0032] 本发明的模板分子为N-乙酰色氨酸丙酰胺，其制备方法包括以下步骤：
[0033] a、称取4.0g的N-乙酰色氨酸，量取100ml甲醇加入250ml的三颈烧瓶中在超声环境 下溶解充分；
[0034] b、在上述步骤的混合溶液中加入5.0ml的浓硫酸作为催化剂，于60 °C的水浴环境 下回流3个小时，使N-乙酰色氨酸和甲醇酯化充分；
[0035] c、待装置完全冷却至室温后，利用1. Omol/L的K2C03溶液调节混合液的pH为7，然后 加入饱和NaCl溶液使之静置分层；
[0036] d、30min后，用120ml的二氯甲烷分三次萃取该混合液；
[0037] e、再把得到的二氯甲烷有机层分别用50ml 1.Omol/L K2C03溶液和60ml的去离子 水各洗一次；
[0038] f、最后把分液后得到的有机溶液里的二氯甲烷在30°C旋转蒸干，得到白色固体；
[0039] g、接着，再把所得的白色固体溶于50ml的丙胺和50ml的甲醇组成的混合液中，常 温搅拌48h;
[0040] h、然后在55°C下把未反应的丙胺旋转蒸干，得到橙黄色粗品；
[0041] i、最后用三氯甲烷重结晶三次后，在40°C的烘箱中烘干，得到白色固体产物。
[0043] 实施例2:表面巯基化的二氧化硅的制备
[0044]本发明的载体为表面巯基化的二氧化硅，其制备方法包括以下步骤：
[0045] a、取4.0g二氧化娃微球，超声分散于5ml的去离子水中，加入120ml甲醇，超声分散 30min；
[0046] b、向本实施例步骤a处理得到反应液中加入120ml的甘油，再超声10min，将混合液 转入500ml的三口烧瓶中，通20min氮气，得到混合溶液一；
[0047] c、取4ml的（3-巯丙基）-三乙氧基硅烷与40ml甲醇混合均匀，并倒入混合溶液一 中，开始搅拌反应，得到混合溶液二；
[0048] d、在混合溶液二中加入10ml的氨水，于85°C、氮气保护下反应lh后，停止氮气保护 后再反应5h;
[0049] e、待反应完毕，离心收集巯基功能化的二氧化硅微球后，用无水乙醇和去离子水 分别洗涤3次;将清洗后的二氧化硅微球置于40°C、真空环境下进行干燥；即完成二氧化硅 微球表面巯基化。
[0050] 实施例3:α_鹳膏毒肽表面分子印迹材料(a-amanitin-MIP)的制备
[0051] 本发明的α-鹳膏毒肽表面分子印迹材料的制备方法如下：
[0052] S1:将实施例1制得的模板分子与3-巯基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇 四-3-巯基丙酸酯加入到二甲基亚砜的溶液中搅拌均匀;模板分子、3-巯基丙酸与乙二醇二 甲基丙烯酸酯的摩尔比为0.2:1:2;所述辅助交联剂季戊四醇四-3-巯基丙酸酯与交联剂乙 二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为9:4;
[0053] S2:将实施例2处理得到的巯基化二氧化硅微球加入本实施例S1步骤制得的混合 溶液中，用三乙胺调节反应液pH约为8,在40°C下聚合反应6小时；
[0054] S3:将S2处理得到的二氧化硅微球从混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/ v)混合溶液和甲醇作洗脱剂进行冲洗；
[0055] S4 :将冲洗后的二氧化硅微球置于40°C的真空环境下进行干燥处理，制得α-amanitin-MIP分子印迹材料。
[0056] 实施例4:α_鹳膏毒肽表面分子印迹材料(a-amanitin-MIP)的制备
[0057]本发明的α-鹳膏毒肽表面分子印迹材料的制备方法如下：
[0058] S1:将实施例1制得的模板分子与3-巯基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇 四-3-巯基丙酸酯加入到二甲基亚砜的溶液中搅拌均匀;模板分子、3-巯基丙酸与乙二醇二 甲基丙烯酸酯的摩尔比为0.15:1:2;所述辅助交联剂季戊四醇四-3-巯基丙酸酯与交联剂 乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为9:4;
[0059] S2:将实施例2处理得到的巯基化二氧化硅微球加入本实施例S1步骤制得的混合 溶液中，用三乙胺调节反应液pH约为8,在40°C下聚合反应9小时；
[0060] S3:将S2处理得到的二氧化硅微球从混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/ v)混合溶液和甲醇作洗脱剂进行冲洗；
[0061 ] S4 :将冲洗后的二氧化硅微球置于45°C的真空环境下进行干燥处理，制得α-amanitin-MIP分子印迹材料。
[0062] 实施例5:α_鹳膏毒肽表面分子印迹材料(α-amanitin-MIP)的制备
[0063] 本发明的α-鹳膏毒肽表面分子印迹材料的制备方法如下：
[0064] S1:将实施例1制得的模板分子与3-巯基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇 四-3-巯基丙酸酯加入到二甲基亚砜的溶液中搅拌均匀;模板分子、3-巯基丙酸与乙二醇二 甲基丙烯酸酯的摩尔比为0.25:1:2;所述辅助交联剂季戊四醇四-3-巯基丙酸酯与交联剂 乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为9:4;
[0065] S2:将实施例2处理得到的巯基化二氧化硅微球加入本实施例S1步骤制得的混合 溶液中，用三乙胺调节反应液pH约为8,在40°C下聚合反应12小时；
[0066] S3:将S2处理得到的二氧化硅微球从混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/ v)混合溶液和甲醇作洗脱剂进行冲洗；
[0067] S4 :将冲洗后的二氧化硅微球置于50°C的真空环境下进行干燥处理，制得α-amanitin-MIP分子印迹材料。
[0068]本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明 的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发 明也意图包含这些改动和变形。
【主权项】
1. 一种α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于包括以下步骤： Sl:将模板分子与功能单体、交联剂、溶剂混匀； S2:将载体表面进彳丁疏基化处理； S3:将S2处理得到的载体加入Sl制得的混合溶液中，通过功能单体与模板分子交联聚 合； S4:用洗脱液将模板分子从聚合后的载体表面洗脱，得到分子印迹材料； S5:将S4处理得到分子印迹材料真空干燥； 其中，S3步骤中的聚合条件为：用碱将聚合反应液pH调至7~9，40°C~50°C下反应6~ 12h； 所述模板分子为N-乙酰色氨酸丙酰胺。2. 根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:所述Sl中功 能单体为3-巯基丙酸;所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯;所述溶剂为二甲基亚砜。3. 根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:所述Sl中模 板分子与功能单体的摩尔比例为〇. 15:1~0.25:1，所述功能单体与交联剂的摩尔比例为1: 2〇4. 根据权利要求3所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:所述Sl中模 板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例为〇. 2:1:2。5. 根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:所述Sl中还 包括辅助交联剂，所述辅助交联剂为季戊四醇四-3-巯基丙酸酯，所述辅助交联剂与交联剂 的摩尔比例为9:4。6. 根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于所述S2中的 巯基化处理方法包括如下步骤： S2a:取载体，溶于水中，加甲醇超声使其分散； S2b:向S2a得到的反应液中加入甘油，再超声，超声后通入氮气； S2c:取(3-巯丙基)-三乙氧基硅烷与甲醇混合均匀，加入S2b得到的反应液中，搅拌使 其混合均匀； S2d:向S2c得到的反应液中加入氨水，85°C氮气保护下反应Ih后，停止氮气，再反应5h; S2e:反应结束后离心收集载体，用无水乙醇和去离子水分别洗涤，40°C下真空干燥即 得。7. 根据权利要求6所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:所述载体为 二氧化硅微球。8. 根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:所述S3中的 碱为二乙胺。9. 根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:步骤S4中所 述洗脱液分为第一洗脱液和第二洗脱液，第一洗脱液为甲醇与乙酸的体积比为9:1的混合 溶液，第二洗脱液为甲醇。10. 根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于:所述S5中 的真空干燥温度为40~50°C。
【文档编号】B01J20/30GK105885049SQ201610308678
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】滕伟迪, 梁勇, 汤又文, 袁嫣昊, 谭杰安
【申请人】华南师范大学