耐辐射丝状真菌f35及其在吸附铅生物处理中的应用
【专利摘要】本发明公开一种耐辐射丝状真菌F35及其在吸附铅生物处理中的应用，通过在新疆和硕县周边干旱荒漠地区采集的土壤样品中分离、筛选、选育、驯化，获得一株对铅离子具有高吸附特性的耐辐射单格孢属真菌（Ulocladium sp.）F35 CGMCC No.11006，与常见真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，筛选出的菌株F35能在Pb2+浓度为100mg/L、菌体添加量为0.01g/ml、pH=5、温度为60℃、吸附时间为10min的情况下，对Pb2+具有最佳吸附效果，作为处理低浓度铅污染废水的生物菌，既可以利用菌体的生长吸附铅离子，也可以直接使用菌体吸附，具有去除率高、反应速度快、无二次污染、操作简便等优点。CGMCC No. 1100620150709
【专利说明】
耐辐射丝状真菌F35及其在吸附铅生物处理中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及环境生物治理技术领域，具体涉及一种耐辐射丝状真菌在重金属生物吸附中应用的技术领域。
【背景技术】
[0002]随着人类活动的加剧，工业化、城市化、农业集约化的快速发展，越来越多的重金属污染物通过工业“三废”、大气沉降、未经处理的固体废弃物、污水灌溉向农田转移，累积到一定程度就会对生态系统产生危害。目前，在我国土壤重金属污染中铅污染分布最广，其具有强蓄积性和非移动性的环境污染物，已成为目前水体和土壤污染的主要元素之一。农田土壤被铅污染后，会对农作物和地下水产生次级污染，直接危害土壤微生物多样性，并通过食物链影响人类健康。因此对重金属铅污染水体和土壤修复再利用的研究越来越受到人们的重视。
[0003]当前对于重金属水污染的治理主要包括物理、化学和生物的修复技术，各有优缺点，但总体上目前的修复技术存在效果缓慢，修复需要时间长，成本高等缺点。如何提高现有技术的修复能力是人们关心的问题之一。随着技术的快速发展，生物修复技术由于其特殊的优越性受到重视，而其中微生物修复是利用细菌、真菌等微生物表面生物大分子吸收转运、细胞代谢、生物吸附以及氧化还原反应等途径对重金属离子进行吸收、沉淀、氧化还原等作用从而降低重金属离子毒性的方法。相对于物理和化学方法对铅的修复作用，微生物修复具有修复时间短、菌株繁殖快、相对处理费用低、对环境影响小、效率高、可就地进行处理等优点，但也存在微生物易受环境影响，不稳定等缺点。
[0004]微生物对含铅废水的修复作用，主要是通过吸附法、载体结合法、膜包法、共价结合法等。微生物对铅的吸附作用主要取决于细胞壁的特殊结构，可以与重金属离子发生定量的结合作用。目前吸附重金属的微生物菌株主要集中在含有大量负电荷官能团(如羧基、磷酰基、羟基等)，有很高络合特性的丝状真菌等;分泌一些如多糖、蛋白质和核酸类物质，能通过离子交换或络合作用与重金属结合形成无毒或低毒金属-有机化合物的细菌；以及通过菌丝体吸附作用来减少环境中存在的重金属的内生菌根和外生菌根。而耐辐射微生物是一类能够在高辐射剂量下生存的极端微生物资源，对重金属具有较强的耐受性和吸附性，在重金属污染治理方面有着极大的应用潜力。
[0005]尽管目前有许多利用微生物修复治理坏境的报道，但是有关能够筛选出性能稳定且对铅污染水体具有较高耐受性和较强的吸附性能的优良菌种鲜见报道，因此需要进一步探究微生物对重金属铅的吸附能力，为微生物修复重金属铅污染提供具有相对高吸附能力且性能稳定的抗性菌株，对于治理铅污染环境具有现实意义。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中未见有关耐辐射丝状真菌及其在吸附重金属铅中应用的相关报道，且分离筛选的菌种对重金属具有较强的耐受性和吸附性的技术现状，本发明旨在为微生物修复铅污染提供具有相对高吸附能力且性能稳定的抗性菌株。本发明通过在土壤样品中分离筛选出一株对铅离子有较高吸附特性的耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35CGMCC N0.11006，利用分离出的菌种对铅污染水体进行生物处理，并提供一种利用该菌进行铅污染水体生物处理中应用技术方案。
[0007]本发明采用的主要技术方案:
本发明土壤样品由新疆农业科学院微生物应用研究所采自新疆和硕县周边干旱荒漠地区，将采集的土壤样品放置6qCo经5000 KGy辐照后，以加链霉素的PDA培养基为分离培养基，大量筛选优选出一批生长良好的耐辐射真菌菌株，从中筛选出一株对铅离子具有高吸附特性的真菌菌株F35。利用本发明分离筛选出的编号为F35的真菌菌株对铅污染水体进行生物处理，该菌株在Pb2+浓度为100 mg/L、菌体添加量为0.01 g/ml、pH=5、温度为60°C、吸附时间为10 min的情况下，对Pb2+具有最佳吸附效果。
[0008]本发明具体提供一种耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006，通过提供确定的的筛选方法，在采集的土壤样品中分离筛选和培养，获得一批真菌类微生物菌株，从中筛选出一株对铅离子具有高吸附特性的真菌菌株F35，经微生物学分类与鉴定，属于单格孢属真菌(Ulocladium sp.)菌株，暂命名为Ulocladium sp.35。
[0009]具体的，本发明通过对采集土壤样品放置6QCo5000KGy辐照后，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为F35的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于单格孢属真菌(Ulocladium sp.)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。保藏日期2015年7月9日，菌种保藏号为CGMCC N0.11006。经微生物学鉴定为单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35。该菌株最适生长条件为:温度30°C，培养基采用PDA培养基(马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、蒸馏水lL，pH自然)，培养时间48h;经48h培养后，在PDA培养基表面，菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起绒状，边缘整齐清晰。将菌种F35通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌丝白色，分生孢子梗短小，菌丝状，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于产孢梗顶端，椭圆形，砖格状分隔，黑褐色。根据以上形态特征，参照《真菌鉴定手册》对F35菌株进行形态学，生理生化鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为子囊菌门座囊菌纲格孢腔目格孢腔菌科单格孢属的一个种，暂命名为耐福射单格孢属真菌Ulocladium sp.F35。
[0010]提取菌株F35总DNA，采用真菌ITS区通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，进行生工测序。将实验菌株的所得ITS区序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定实验菌株亲缘关系最近的种属。从GenBank数据库，并结合真菌生物多样性研究中心数据库获得相关种属的序列，利用MEGA 5.0软件包采用邻接法(Neighbor- Joiningmethod)进行聚类分析和系统进化树构建。
[0011 ] 通过序列比对发现，菌株F35归属于单格孢属(Ulocladium)，系统进化树构建显示菌株F35单独分枝，与目前已知菌株UlocIadium atrum UAMH 7840、Uloc ladiumcucurbitae HSAUP_XF030282、Ulocladium chartarum UAMH 7842、Ulocladium botrytisUB32、Ulocladium consortiale BMP 3151001、Ulocladium botrytis ATCC 18043具有最大同源性，相似性99.17%，与其余种相似性都在98.33%以下，尚不能确定其确切分类，暂命名为Ulocladium sp.F350
[0012]分子测序结果表明，耐辐射真菌F35 CGMCC N0.11006的ITSl基因序列为547bp。本发明提供的耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35与常见的真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为F35的菌种尽管与常见的单格孢属真菌菌种相比，具有共性的一些属性，但是依据与常见的单格孢属真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明F35菌株是一种典型的新菌种，其对重金属铅离子的耐受能力、吸附能力更强，从分类学将F35菌株鉴定为耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)。
[0013]通过上述各试验对编号为F35的菌种与常见的单格孢属真菌菌种相比，具有共性的一些属性，但是依据与常见的单格孢属真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明F35菌株是一种典型的新菌种，初步鉴定该菌株为子囊菌门座囊菌纲格孢腔目格孢腔菌科单格孢属的一个种，从菌种分类角度将菌种编号为F35的菌株综合鉴定为耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35。
[0014]本发明进而提供耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的分尚和培养方法。
[0015]1.分离培养基采用:PDA培养基，每10ml培养基加1%链霉素溶液0.3ml，同时加入铅离子溶液，使其浓度达2000mg/L。
[0016]2.分离和筛选条件:采取梯度稀释法，称取1g辐照后的采集土壤样品于90ml无菌生理盐水中，30°C活化30min后进行梯度稀释，选取原液、10—\ 10—2、10—3稀释液分别涂布于分离培养基平板上，每个处理3个重复，置30°C培养，待长出真菌菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。
[0017]经培养筛选确定的耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006在TOA培养基上菌株菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起绒状，边缘整齐清晰;PDA培养基选用马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、蒸馏水IL，pH自然。
[0018]进一步，本发明提供一种耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006在铅污染水体生物处理中应用。通过研究在不同铅离子浓度、温度、pH值、接种量和吸附时间条件下对菌体吸附的影响，得到F35对Pb2+的最佳吸附条件是Pb2+浓度100mg/L、菌体添加量0.0I g/ml、pH=5、温度60 °C、吸附时间I Omin。
[0019]通过实施本发明具体技术指标，实现本
【发明内容】
，可以达到以下有益效果:
(I)本发明提供的耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006，具有培养条件简单，繁殖快的优点。
[0020](2)本发明分离筛选的编号为F35的耐辐射单格孢属真菌菌株能够在能在Pb2+浓度为100mg/L、菌体添加量为0.01g/ml、pH=5、温度为60°C、吸附时间为1min的情况下，对Pb2+具有最佳吸附效果，是一种典型的耐辐射真菌。
[0021](3)本发明在处理低浓度铅污染废水过程中，既可以利用菌体的生长吸附铅离子，也可以直接使用菌体吸附，具有去除率高、反应速度快、无二次污染、操作简便等优点。
【附图说明】
[0022]图1所不为耐福射单格抱属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的菌落和菌体照片，其中，A-菌落照片，B-菌体照片。
[0023]图2所示为所示为耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006系统发育树状图。
[0024]图3所示为耐福射单格孢属真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006铅离子浓度对吸附效果的影响图。
[0025]图4所示为耐福射单格孢属真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006铅离子初始pH对吸附效果的影响图。
[0026]图5所不为耐福射单格抱属真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006菌体用量对吸附效果的影响图。
[0027]图6所示为耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附温度对吸附效果的影响图。
[0028]图7所示为耐福射单格孢属真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006的吸附时间对吸附效果的影响图。
[0029]图8所不为耐福射单格抱属真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006吸附铅离子前红外光谱图。
[0030]图9所不为耐福射单格抱属真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006吸附铅离子后红外光谱图。
【具体实施方式】
[0031]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的%都为重量百分比，除非特别指出除外。
[0032]实施例一:耐福射单格抱属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的分离、筛选及鉴定
1、菌种的分离和筛选
本发明所使用的单格孢属真菌(Ulocladium sp.F35)由新疆农业科学院微生物应用研究所从新疆和硕县周边干旱荒漠地区大量采集土壤中取样，经5000 KGy钴源进行辐照后分离，利用传统的平板培养法分离出土层中的真菌，平板划线法纯化菌株，以不同的培养温度、PH值、培养基为富集条件，经过优化筛选出一批生长良好的真菌菌株，从中优选出一株编号为F35的菌株。
[0033]分离步骤:
(I)分离培养基采用:PDA培养基，按照每10ml的PDA培养基加1%链霉素溶液0.3ml，同时加入铅离子溶液，使其浓度达2000mg/L。
[0034](2)分离和筛选条件:采取梯度稀释法，称取1g辐照后的土壤样品于90ml无菌生理盐水中，30°C活化30min后进行梯度稀释，选取原液、10—\10—2、10—3稀释液分别涂布于分离培养基平板上，每个处理3个重复，置30°C培养。待长出真菌菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。
[0035]2、菌株的培养条件
(I)编号为F35的菌株的生长培养基为PDA培养基:马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、蒸馏水IL，pH自然，经30 °C、48 h培养。
[0036](2)编号为F35的菌株在28-30°C条件下均能生长，最适生长温度为30°C，培养时间为 48h。
[0037](3)编号为F35的菌株的生长pH自然。
[0038](4)编号为F35菌株的重金属耐受能力实验。
[0039]将该菌种分别接种于含8种重金属离子，Pb2+浓度范围在1500-3500mg/L、Cd2+的浓度范围在50-250mg/L、Hg2+的浓度范围在400-1200mg/L、Cu2+的浓度范围在700-1500mg/L、Cr2+的浓度范围在700-1500mg/L、Co2+的浓度范围在400-1200mg/L、Zn2+的浓度范围在800-2000mg/L、Ni2+的浓度范围在700-1500mg/L的平板上，于30°C进行培养，7d后观察其生长状况。耐福射单格孢属真菌Ulocladium sp.F35对不同重金属离子的耐受性检测结果为:本发明所用的菌种对8种重金属离子Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Cr2+、Co2+、Zn2+、Ni2+均具有较高的耐受特性，分别能耐受 3500mg/L、250mg/L、400mg/L、700mg/L、1500mg/L、1200mg/L、2000mg/L、1300mg/L浓度的重金属离子溶液，结果表明，该菌种对于重金属离子Pb2+的耐受性最高，在重金属生物处理中具有良好的应用前景。
[0040]具体的，本发明通过对采集土壤样品以5000KGy钴源进行辐照，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为F35的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于单格孢属真菌(Ulocladium sp.)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。保藏日期2015年7月9日，菌种保藏号为CGMCC N0.11006。经微生物学鉴定为耐辐射单格孢属真菌Ulocladium sp.F35。该菌株最适生长条件为:温度30°C，培养基采用I3DA培养基，马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、蒸馏水IL，pH自然，培养时间48h;经48h培养后，在I3DA培养基表面，菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起绒状，边缘整齐清晰。将菌种F35通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌丝白色，分生孢子梗短小，菌丝状，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于产孢梗顶端，椭圆形，砖格状分隔，黑褐色。根据以上形态特征，参照《真菌鉴定手册》对F35菌株进行形态学，生理生化鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为子囊菌门座囊菌纲格孢腔目格孢腔菌科单格孢属的一个种，暂命名为耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35。
[0041 ] 分子测序结果表明，耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的ITSl基因序列为547bp，本发明提供的耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006与常见真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为F35的菌种尽管在生理生化特性和分子水平方面与常见的单格孢属真菌菌种具有明显的差异，与常见的真菌菌种相比，其对重金属铅离子的耐受能力、吸附能力更强，但是依据分类学鉴定为单格孢属真菌(Ulocladium sp.)。
[0042]3、菌株F35的生理生化鉴定
形态特征:该菌种F35经TOA培养基分离培养，在I3DA培养基上菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起绒状，边缘整齐清晰，挑取疑似单格孢属真菌菌落进行插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌丝白色，分生孢子梗短小，菌丝状，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于产孢梗顶端，椭圆形，砖格状分隔，黑褐色，耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35菌落和菌体形态参见附图1。
[0043]生理生化特征:对该菌进行了糖发酵、碳源同化、氮源同化鉴定，该菌株F35在PDA培养基上生长良好，经B1log FF鉴定板试验，结果表明菌株F35可以利用N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺、杏苷、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、熊果苷、D-纤维二糖、糊精、赤藻糖醇、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、a-D-葡萄糖、a-D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-葡萄醛酸、丙三醇、肝糖、2_酮-D-葡萄糖酸、a-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、a-甲基-D-半乳糖苷、甲基-D-葡萄糖苷、6-0-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-蜜三糖、D-核糖、水杨苷、D-山梨醇、水苏糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、D-木糖、y-氨基丁酸、反丁烯二酸、a-酮戊二酸、L-苹果酸、奎尼酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、L-丙胺酸、L-丙胺酰氨基乙酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、鸟氨酸、L-苯基丙氨酸、脯氨酸、L-丝氨酸、2-氨基乙醇。
[0044]通过上述菌种耐福射单格抱属真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定、耐性试验等试验，与常见的菌种相比，对8种重金属离子Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Cr2+、Co2+、Zn2+、Ni2+均具有较高的耐受特性，参照《真菌鉴定手册》的方法进行，编号为F35的菌种尽管与常见的单格孢属真菌菌种相比，具有共性的一些属性，但是依据与常见的单格孢属真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明F35菌株是一种典型的新菌种，初步鉴定该菌株为子囊菌门座囊菌纲格孢腔目格孢腔菌科单格孢属的一个种，从菌种分类角度将菌种编号为F35的菌株综合鉴定为耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 ο
[0045]实施例二:耐福射单格抱属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006分子水平鉴定
1.DNA提取:真菌提取方法如下:
(l)200mg菌体，液氮研磨，加入3ml 3% CTAB提取缓冲液，65°C水浴45min，4°C4000r/min 离心 20mino
[0046](2)取上清转到离心管中，加入4μ1 10mg/ml蛋白酶，37°C，水浴lh。
[0047](3)加入800μ1 Tris饱和酚，摇匀13000r/min离心1min;取上清。
[0048](4)加入等体积的氯仿/异戊醇，摇匀，13000r/min离心lOmin，取上清。
[0049 ] (5 )加10mg/ml的RNA酶，37 °C水浴过夜处理。
[0050](6)加入800μ1氯仿/异戊醇，摇匀，13000r/min离心lOmin，取上清。
[0051 ] (7)加600μ1异戊醇，-20 V沉淀30min，收集沉淀，75%酒精，冲洗，超净台真空干燥。
[0052](8) 100μ1 TE 溶解DNA，_20 °(:保存备用。加入Ιμ?的RNA酶，37°C水浴lh，加入400μ?氯仿/异戊醇(24:1)，12000r/min离心lOmin，重复2次。
[0053]2.1TS基因基因扩增及测序，用真菌ITS基因基因通用引物进行扩增:
引物 ITS11:5 ’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ’
ITS14: 5 ’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR 扩增反应体系为5(^1^，反应条件为:95°(:，5111丨11;95°(:，458，57°(:，30s，72°C，90s，30cycles，72° C，7min。扩增产物(约547bp)，PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物进行测序，将菌株F35的ITSl基因序列进行测定，经测定，耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006基因序列为547bp，参见附后提供的基因序列表SEQUENCE LISTING。
[0054]3.1TSl序列比对及系统发育分析
本发明通过总DNA的提取、ITSI基因基因的PCR扩增产物进行测序，获得547bp序列，经GenBank \ Blast同源序列比对分析，其与现有技术所报道的单格孢属(Ulocladium sp.)同源性较高。从GenBank中获取标准菌株ITSl基因序列，进行同源进化分析、CLUSTAL X进行多序列比对，并采用MEGA 5.0软件中的Saitou和Nei的邻接法(Neighbor Joining)进行系统进化树的构建，结果参见附图2。从树状图中可以看出，本发明提供的耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006与常见真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为F35的菌种尽管在生理生化特性和分子水平方面与常见的单格孢属真菌菌种具有明显的差异，与常见的真菌菌种相比，其对重金属铅离子的耐受能力、吸附能力更强，但是依据分类学鉴定为单格孢属真菌(Ulocladium sp.)。
[0055]
实施例三:耐福射单格孢属真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006菌体的制备将经活化的本发明菌株耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006接种于装有100ml PDA液体培养基的500ml三角瓶中，于30°C培养，200rpm振荡培养72h。利用真空栗抽滤的方式收集菌体，用无菌水洗涤三次后待用。
[0056]实施例四:一种耐辐射单格孢属真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006在吸附铅生物处理中的应用
将该菌株接种于不含铅离子的液体PDA培养基中，培养3-5天后，收集菌丝体，进行菌体吸附试验，研究在不同铅离子浓度、温度、PH值、接种量和吸附时间条件下对菌体吸附的影响。
[0057](I)不同铅离子浓度对耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附的影响
称取菌体各0.lg，分别置于1ml铅离子浓度为50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L、1000mg/L的Pb2+溶液中，静置吸附3 h后，测定不同铅溶液浓度对菌体吸附的影响。结果见附图3，随着Pb2+浓度的降低吸附率逐渐升高，在Pb2+达到100mg/L时吸附率最高，达66.19%，随后下降，因此在铅溶液浓度为100 mg/L时，体现了该菌体对铅离子的吸附能力最强。
[0058](2)不同铅离子初始pH值对耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附的影响
称取菌体各0.lg，分别置于1ml铅离子浓度为100mg/L，pH值为3、4、5、6、7、8、9的Pb2+溶液中，静置吸附3h后，测定不同pH值对菌体吸附的影响。结果见附图4，pH值在5时菌株对Pb2+溶液吸附率最高，达70.66%。当pH值升高和降低时吸附率均降低，因此，溶液pH值为5时，体现了该菌体对铅离子的吸附能力最强。
[0059](3)不同菌体用量对耐福射单格抱属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影响
分别称取不同质量的菌体(0.18，0.38，0.58，0.78，1.(^)分别置于101111铅离子浓度为lOOmg/L的溶液中，静置吸附3 h后，测定不同质量菌体对吸附的影响。结果见附图5，菌体用量在0.5 g-1.0 g时吸附率差异不大，1.0g时吸附率最高，达92.19%。但考虑菌体用量过大，成本较高，实际操作困难，因此选取吸附率也较高的0.1g菌体做后续试验。
[0060] (4)不同吸附温度对耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影响
称取菌体各0.lg，震荡悬浮于1ml铅离子浓度为100mg/L的Pb2+溶液中，分别置于20-80°C水浴中静置吸附3h后，测定不同温度对菌体吸附的影响。结果见附图6，温度在60°C时菌株对Pb2+溶液吸附率最高，达81.91%，说明该菌株在较高温度条件下也具有很高的吸附能力。
[0061 ] (5)不同吸附时间对耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影响
称取菌体各0.lg，分别震荡悬浮于1ml铅离子浓度为100 mg/L的Pb2+溶液中，每间隔5min取样，测定不同时间对菌体吸附的影响。结果见附图7，该菌在1min内即完成吸附，1min后吸附率变化不大，趋于饱和，说明该菌株在1min时对铅离子的吸附率最高。
[0062]综合以上步骤，可知F35对Pb2+的最佳吸附条件是Pb2+浓度为100mg/L、菌体添加量为0.0I g/ml、pH=5、温度为60 °C、吸附时间为I Omin。
[0063]实施例五:红外光谱分析
将F35在含0mg/L和100mg/L的Pb2+的TOA液体培养基培养后，分别用去离子水洗涤3次，后抽滤收集菌体，烘干，与KBr研磨混勾，在10t/cm2下压成薄片并维持Imin，用红外光谱仪测定并记录其光谱。参见附图8可知，耐福射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附Pb2+前后的红外光谱变化明显。
[0064]由附图8，附图9显示，耐辐射单格孢属真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附前后红外图谱呈现出明显的差异，说明吸附前后菌体的结构和功能基团发生了改变。3229cm—1的N-H酰胺或O-H伸缩振动偏移至3402cm—1处，且吸收峰变宽，但吸收强度变化不大;2924cm—1和2855cm—1的C-H饱和振动没有发生明显的偏移，但吸收强度增幅变大；1742cm—1的C=O酯基振动也没有发生明显的偏移，但吸收强度明显增大；1646cm—1的C=O酰胺振动略有偏移，且吸收强度增幅变大；1554cm—1的N-H振动偏移至1545cm—1处，且吸收强度增幅变大；1456cm—1和1385cm—1的伯酰胺振动偏移不大，但吸收强度增幅变大。吸收前1160cm—1至1031cm—1为伯醇C-O和OH振动;吸收后1315cm—1和1239cm—1为伯醇O-H振动，发生了较大的偏移，1077cm—1和1038cm—1为伯醇C-O振动，偏移较小；同时这几个吸收峰的吸收强度增幅变大。由此表明，细胞表面的这些官能团在吸附铅离子的过程中起到了配位络合作用。
[0065]上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1.一种耐福射单格孢真菌(Ulocladiumsp.)F35，其特征在于，所述的耐福射单格孢真菌(Ulocladium sp.)F35 的CGMCC保藏号为N0.11006。2.如权利要求1所述耐福射单格孢真菌(Ulocladiumsp.)F35在吸附铅生物处理中的应用。
【文档编号】C12N1/14GK105886407SQ201610061361
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年1月28日
【发明人】顾美英, 谭慧林, 张志东, 宋素琴, 王玮, 朱静, 唐琦勇, 谢玉清, 张丽娟, 王博
【申请人】新疆农业科学院微生物应用研究所