溢油修复菌剂及其在污染环境中的应用
【专利摘要】本发明涉及溢油修复菌剂及在环境中应用。将铜绿假单胞菌TJU?J?05和铜绿假单胞菌TJU?J?12在活化斜面菌种的营养培养基中进行斜面菌种活化，培养至对数期OD600＝0.8，获得种子液，再将种子液接种于成分为麸皮、草炭、蒸馏水的固体培养基中，30℃培养箱中培养两天，分别制得TJU?J?05及TJU?J?12单一菌剂；最后用草炭将两种单一菌剂稀释到相同的数量级后等质量混合，得到混合修复菌剂。铜绿假单胞菌TJU?J?05和铜绿假单胞菌TJU?J?12均于于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.12142和CGMCC No.12141。CGMCC No.1214220160218 CGMCC No.1214120160218
【专利说明】
溢油修复菌剂及其在污染环境中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及石油污染技术领域，特别是溢油修复菌剂及在环境中应用。
【背景技术】
[0002] 石油作为最为重要的化石燃料及化工原料，关系到我们日常生活的方方面面。随 着石油大量的开采利用，由于受到工艺和技术水平的限制以及突发事故的影响，不可避免 的导致大量的石油以及含油的废渣废水进入到环境中，严重的影响了生态环境的平衡且因 石油中的部分多环芳烃类化合物属强致癌物质，若通过食物链进入人体，也会对人体健康 具有很大的潜在危害。
[0003] 石油污染的修复技术有很多，如化学修复、物理修复、生物修复等。其中生物修复 是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自 发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术。由于生物修复具有投资小，操 作简单，不易产生二次污染等优点，已成为一种经济效益和环境效益倶佳的解决石油污染 土壤或水体的有效手段。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术的不足，本发明提出了新的溢油修复菌剂及在在环境中应用。 本发明的纯化出两株铜绿假单胞菌，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，分别为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TJU-J-05编号 CGMCC No. 12142和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)TJU-J-12,编号CGMCC Νο·12141〇
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一株铜绿假单胞菌TJU-J-05，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，编号CGMCC No. 12142,保藏单位的地址为:北京市朝阳区北辰西路 1号院3号。
[0007] 一株铜绿假单胞菌TJU-J-12，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，编号CGMCC No. 12141，保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。
[0008] 本发明的两种铜绿假单胞菌作为溢油混合修复菌剂应用。
[0009] 将铜绿假单胞菌TJU-J-05和铜绿假单胞菌TJU-J-12在活化斜面菌种的营养培养 基中进行斜面菌种活化，培养至对数期〇D600 = 0.8,获得种子液，再将种子液接种于成分为 麸皮、草炭、蒸馏水的固体培养基中，30 °C培养箱中培养两天，分别制得TJU-J-05及TJU-J-12 单一菌剂; 最后用草炭将两种单一菌剂稀释到相同的数量级后等质量混合，得到混合修 复菌剂。
[0010] 相同的数量级为l〇7CFU/g。
[0011] 本发明的混合修复菌剂的制备方法如下：
[0012]( - )配制活化斜面菌种的牛肉膏-蛋白胨营养培养基，分别取lOOmL的培养基分装 于4个250mL的锥形瓶中，在121°C的高压灭菌锅中灭菌20分钟；
[0013](二)待培养基冷却至室温后，超净条件下将菌种分别接种于两个锥形瓶中。将三 角瓶放在温度为30°C，培养转速是200rpm的摇床中培养24小时，达到对数期0D600 = 0.8;
[0014] (三)取活化后的种子液浓缩至40ml加入160ml无菌水混匀，然后倒入200mL/瓶固 态培养基中混匀，30°C培养两天，得到单一菌种菌剂；
[0015] (四）将2种单一菌剂用草炭稀释到细菌数量相同的数量级，等质量混匀制得混合 菌剂。
[0016] 所述营养培养基配方为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，运用精密电子调 节pH电极进行测量，使用2mol/L的盐酸和lmol/L的氢氧化钠溶液调节培养基pH为7.0~ 7.2。
[0017] 所述固态培养基配方为麸皮、草炭红外蒸馏水;质量比为1:1:1，121°C高压蒸汽灭 菌锅灭菌20min。
[0018] 利用菌剂进行环境溢油修复研究：
[0019] 选取3个土质较为疏松的海岸边砂质场地(尺寸4.5 X 2.5m)，编号1、2、3，先在各实 验场地添加6kg原油，加入5L柴油，快速搅拌至原油均勾分散后，均勾喷洒于基质表面，每天 定时抽取海水，依照潮汐表模拟涨落潮冲刷基质20天，待原油和柴油中轻质成分完全挥发 后(取土壤样测得每克土壤总石油烃含量为0.8% )，进行添加营养盐和菌剂的生物修复实 验。其中，1号修复池为对照组，需向其中添加水溶性肥料(NH4N03，2.0kg; KH2P〇4，0.4kg)及 0.5%原油，混匀后均匀铺撒在修复池中；其余2个修复池为实验组，编号依次为2、3,与对 照组相比需额外添加1.0kg的混合菌剂，混匀后铺撒;此外，3号需均匀铺撒2.0kg的有机肥 (主要为鸡粪:分解的中间产物和无机酸根可作为微生物降解石油烃的电子受体）。60天后 取样测试各场地土壤中总石油烃含量的变化，如图1所示，试验1未添加外源菌剂，但由于土 著石油烃降解菌的生长利用原油，导致石油烃含量缓慢降低，60天后土壤中总石油烃降解 率为25.85%;而试验2,3由于添加了高效石油烃降解菌剂，石油烃含量下降趋势明显快于 试验1，其中试验2总石油烃降解率达到63.9%，试验3由于额外添加了有机肥(鸡粪)能够为 菌种的生长持续提供营养且其分解的中间产物和无机酸根可作为微生物降解石油烃的电 子受体，故其最终石油烃降解率最高，达到85.2%。
[0020] 本发明中2种石油经降解菌复配铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TJU-J-05、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TJU-J-12具有高效降解石油的能力，摇瓶实 验发现，3天原油降解率(初始0.5 % )达到91.3 %。
[0021] 本发明中制备的菌剂应用于环境中，对石油污染的场地(初始含油量0.8% )60天 后土壤中原油的降解率最高达到85.28% (如图1)，比不添加菌剂的污染场地修复效果提高 了 59.4%〇
【附图说明】
[0022] 图1环境条件下菌剂对三块污染场地的修复能力实验石油烃降解率图。
【具体实施方式】
[0023]通过下面结合具体实例将有助于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限 制于此：
[0024] 实施案例1
[0025] 所述的石油经降解菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TJU-J_05及铜绿 假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TJU-J_12的筛选方法，步骤如下：
[0026](一)采集矿井周围有明显溢油的石油污染土壤，采样点6处，采集土样约100g，用 封口袋封装留存。
[0027](二）以石油为单一碳源，加入含有100mL BH培养基的250mL摇瓶，30°C、220r/min 摇床驯化培养约一周后，可见摇瓶内石油有明显降解。弃上清液补加经高温灭菌加1%原 油的BH培养基100mL，继续在30°C、220r/min下250mL摇瓶培养。重复2次。
[0028](三)先吸取步骤二最终的培养液lml用无菌水稀释10倍，再取稀释后的培养液lml 稀释10倍，以此类推逐级稀释直至稀释倍数为105为止，取此浓度下菌液lml均匀涂布于 0.5 %原油的BH固体平板上(2 %琼脂)30 °C恒温培养箱，培养2周。
[0029] (四）用接种环挑取步骤三中出现的形态各异2个单菌落，在固体营养培养基（2% 琼脂)划线，30°C恒温培养箱培养两天。恒温培养后挑取单菌落，4°C保藏。
[0030] 本发明以石油烃为唯一碳源，保证只有能利用此种碳源生长代谢的菌种富集，起 到了定向筛选的作用。
[0031] 所述的BH培养基配方是:硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸 铵2g/L，氯化钠5g/L，硫酸镁0.5g/L。
[0032] 实施案例2
[0033] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)TJU-J_05编号CGMCC No· 12142和铜绿 假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TJU-J_12,编号CGMCC No. 12141，混菌降解原油 [0034]在利用混菌降解原油的实验中，BH培养基成分是硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾1.5g/L， 磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵2g/L，NaCL 5g/L，硫酸镁0.5g/L。微量元素10mL，调节pH到7.0，在 100mL的三角瓶中添加石油0.5g的原油，接种达到对数生长期（细胞浓度为6.32 X l(T2mg/ ml)的两株菌各31111，30°(：，220印111，培养3天后，用正己烷萃取残留的原油，采用比重法比较 降解前后石油重量的变化，发现原油降解率达到91.3%。
[0035] 实施案例3
[0036]摇瓶中残余原油萃取
[0037]向摇瓶中加入分析纯的正己烷，左右摇晃使正己烷与原油充分接触，然后静置，待 正己烷与培养液分层后，将萃取液转移至干净的事先已知重量的烧杯中，再重新在摇瓶中 加入正己烷，摇晃、静置、转移，如此反复3次，最后将烧杯放置通风橱放置一段时间，待正己 烷挥发后，称量此时烧杯的重量。前后的重量之差即为残余原油的重量。
[0038] 实施案例4
[0039]混合修复菌剂的制备
[0040] ( - )配制活化斜面菌种的牛肉膏-蛋白胨营养培养基，分别取100mL的培养基分装 于4个250mL的锥形瓶中，在121°C的高压灭菌锅中灭菌20分钟；
[0041] (二)待培养基冷却至室温后，超净条件下将菌种分别接种于两个锥形瓶中。将三 角瓶放在温度为30°C，培养转速是200rpm的摇床中培养24小时，达到对数期(0D600 = 0.8)。
[0042] (三)取活化后的种子液浓缩至40ml加入160ml无菌水混匀，然后倒入200mL/瓶固 态培养基中混匀，30 °C培养两天，得到单一菌种菌剂。
[0043] (四）将2种单一菌剂用草炭稀释到细菌数量相同的数量级（细菌试剂瓶法测得单 一菌剂的石油烃降解菌数），等质量混匀制得混合菌剂。
[0044]步骤(一）中营养培养基配方为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，运用精密 电子调节pH电极进行测量，使用2mo 1 /L的盐酸和lmo 1 /L的氢氧化钠溶液调节培养基pH为 7.0~7.2〇
[0045]步骤(三）中固态培养基配方为麸皮、草炭、蒸馏水(质量比为1:1:1)，pH为自然状 态，121°C高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。
[0046] 实施案例5
[0047]利用菌剂降解环境中的污染物
[0048] 构建人工溢油修复场地，设置不同的实验条件，考察菌剂在外界环境条件影响下 对溢油土壤修复效果，并且记录实验过程中的环境因子。具体操作如下:选取3个土质较为 疏松的海岸边砂质场地(尺寸4.5 X 2.5m)，编号1、2、3，先在各实验场地添加6kg原油，加入 5L柴油，快速搅拌至原油均匀分散后，均匀喷洒于基质表面，每天定时抽取海水，依照潮汐 表模拟涨落潮冲刷基质20天，待原油和柴油中轻质成分完全挥发后(取土壤样测得每克土 壤总石油烃含量为0.8%)，进行添加营养盐和菌剂的生物修复实验。其中，1号修复池为对 照组，需向其中添加水溶性肥料(NH4N03，2.0kg; KH2P〇4，0.4kg)及0.5 %原油，混勾后均匀铺 撒在修复池中；其余2个修复池为实验组，编号依次为2、3,与对照组相比需额外添加1.0kg 的混合菌剂，混匀后铺撒;此外，3号需均匀铺撒2.0kg的有机肥(主要为鸡粪:分解的中间产 物和无机酸根可作为微生物降解石油烃的电子受体）。60天后取样测试各场地土壤中总石 油烃含量的变化。
[0049] 实施案例6 [0050] 土壤中原油萃取
[0051]取l〇g 40°C烘干的土样置于小烧杯中，加入分析纯的正己烷进行多次萃取，萃取 液转移至干净的烧杯中，然后在通风橱放置一段时间，待正己烷挥发后，烧杯中残留的即 为土样中所含的石油烃。
[0052] 表1两株菌的基本特性
[0054]表2环境溢油修复实验中各场地的投料情况
[0056]本发明公开和提出的一种溢油修复菌剂及其在污染环境中的应用，本领域技术人 员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已 通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内 对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指 出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包 括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1. 一株铜绿假单胞菌TJU-J-05，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，编号CGMCC No. 12142。2. -株铜绿假单胞菌TJU-J-12,于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，编号CGMCC No. 12141。3. 权利要求1或2的铜绿假单胞菌作为溢油混合修复菌剂应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征是:将铜绿假单胞菌TJU-J-05和铜绿假单胞菌TJU-J-12在活化斜面菌种的营养培养基中进行斜面菌种活化，培养至对数期0D600 = 0.8,获得 种子液，再将种子液接种于成分为麸皮、草炭、蒸馏水的固体培养基中，30 °C培养箱中培养 两天，分别制得TJU-J-05及TJU-J-12单一菌剂;最后用草炭将两种单一菌剂稀释到相同的 数量级后等质量混合，得到混合修复菌剂。5. 如权利要求4所述的应用，其特征是相同的数量级为IO7CFlVg。6. 如权利要求4所述的应用，其特征是混合修复菌剂的制备方法如下： (一) 配制活化斜面菌种的牛肉膏-蛋白胨营养培养基，分别取IOOmL的培养基分装于4 个250mL的锥形瓶中，在121°C的高压灭菌锅中灭菌20分钟； (二) 待培养基冷却至室温后，超净条件下将菌种分别接种于两个锥形瓶中。将三角瓶 放在温度为30°C，培养转速是200rpm的摇床中培养24小时，达到对数期0D600 = 0.8; (三) 取活化后的种子液浓缩至40ml加入160ml无菌水混匀，然后倒入200mL/瓶固态培 养基中混匀，30°C培养两天，得到单一菌种菌剂； (四） 将2种单一菌剂用草炭稀释到细菌数量相同的数量级，等质量混匀制得混合菌剂。7. 如权利要求6所述的应用，其特征是营养培养基配方为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯 化钠5g/L，运用精密电子调节pH电极进行测量，使用2mol/L的盐酸和lmol/L的氢氧化钠溶 液调节培养基pH为7.0~7.2。8. 如权利要求6所述的应用，其特征是固态培养基配方为麸皮、草炭红外蒸馏水；质量 比为I: I: I，121°C高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。
【文档编号】B09C1/10GK105886426SQ201610157097
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月18日
【发明人】贾晓强, 黄磊
【申请人】天津大学