凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌zf15及在生防中应用
【专利摘要】本发明公开一种凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF15及在生防中应用，通过从凤凰单丛茶树根中取样，分离纯化、筛选和培养，获得一株有较好生防效果的芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15 GDMCC No：60016，菌种在生理生化特性和分子水平方面与常见的芽孢杆菌具有明显的差异，是一种典型的新菌种，本申请公开的芽孢杆菌ZF15对梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌有较好的抑制作用，菌丝生长抑制率分别为73.44%、78.90%、65.64%、76.90%，ZF15对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为22.85%，是一种典型性突出、专一性强的生防菌，在生防中具有广泛的应用价值。GDMCC No:6001620160310
【专利说明】
凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF15及在生防中应用
技术领域
[0001] 本发明涉及农业生物生防技术领域，具体涉及一种从凤凰单丛茶树内生拮抗菌及 其在生物防治中应用的技术领域。
【背景技术】
[0002] 植物内生菌(Endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物各种 组织内部或细胞间隙，而不使宿主产生明显病理症状的微生物。拮抗内生菌是指能够产生 拮抗作用的微生物。植物体是一个复杂的微生态系统，健康植物体内含有大量的内生细菌 (Endophytic Bacteria)，已从小麦、棉花、水稻、花生、马铃薯、番前、梓檬、柑桔等50多种植 物体内分离鉴定出内生细菌50多个属，几乎所有健康植物体内均含有内生细菌。
[0003] 在农业种植业中，梨、核桃、红枣、棉花等农作物遭受梨果黑斑病菌、核桃叶枯病 菌、梨腐烂病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核病菌等的侵害严重，化学杀菌剂是控制以上病害 常用的方法，但化学杀菌剂污染环境，诱导病菌产生抗药性，破坏生态平衡，它的残留问题 令人担忧，因此植物病害的生物防治研究越来越受到重视。
[0004] 目前植物病害的生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进 行有效防治的技术与方法。单丛茶是我国重要的茶树品种，从单丛茶树内生细菌中筛选出 对植物病原菌有抑菌作用的拮抗菌株，对开发生物防腐剂及抑菌剂，保障食品和环境安全 具有重要的意义。
[0005] 国外已有报道从不同的植物中分离出Acinotobacter、Agrobacterium、 Alcaligenes、Bacillus、Clavibacter、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、 Phyl lobacterium、Pseudomonas和Serratia等属的内生细菌。国内黄晓琴，张丽霞等从茶树 内生菌中进行了冰核细菌拮抗菌的筛选，得到菌株Y1，通过对其进行形态学观察、生理生 化指标测定及16SrDNA序列测定，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。 罗明对新疆棉花植株组织中的内生细菌进行分离，共得到102个菌株，初步鉴定分属于芽孢 杆菌属（Bacillus sp·)、黄单抱菌属(Xanthomonas sp·)、假单抱菌属（Pseudomonas sp·)、 欧文氏菌属(Erwinia sp.)及短小杆菌属(Curtobacterium sp·)，从中筛选出对棉花枯萎 病菌有体外拮抗活性的菌株22个，对立枯丝核菌有体外拮抗活性的菌株15株。
[0006] 生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性。芽孢杆菌营养简单，在自 然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，可研究其用于植物病害的生物防治，为研 究开发生物防控菌杀菌剂奠定基础。
[0007] 凤凰单丛茶产于潮州市凤凰山，素以滋味浓醇鲜爽，香气似天然花果香著称，种植 历史悠久，种质资源丰富，已达80多个品系。目前对凤凰单丛茶的研究主要集中在品种鉴 定、遗产多样性分析、品质化学特性、生理活性、质量安全和做青工艺的研究，对于凤凰单丛 茶树内生菌的研究不多。因此对凤凰单丛茶树内生菌进行分离，从中筛选出具有抑菌活性 的拮抗菌株都具有重要的意义。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中关于凤凰单丛茶树内生细菌对常见细菌腐败菌和梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌的研究未见报道，本 发明旨在于提供一种新的凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF15及在生防中应用，通过试验 证明获得新的菌种对梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉 菌等植物病原菌具有相对高防治能力且性能稳定，表明本发明提供一种新的抗性菌株，作 为植物病原菌的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很 好的应用前景。
[0009] 本发明采用的主要技术方案：
[0010] 本发明通过凤凰单丛茶树根中分离筛选出一株对梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌和 红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌有较高抑制效果的细菌菌株ZF15， 与常见的芽孢杆菌(Bacillus)不同的新菌种，通过利用分离出的新菌种对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌进行抑菌试验，并提 供一种利用芽孢杆菌(Bacillus sp. )ZF15GDMCC N〇:60016进行植物病原菌生物防治中应 用的技术方案，ZF15对梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌有较好的 抑制作用，菌丝生长抑制率分别为73.44%、78.90%、65.64%、76.90%，ZF15对瓜果腐霉菌 丝生长抑制率为22.85%，ZF15对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，其抑制圈直 径分别为11.20mm和10.56mm，对大肠杆菌和白色念珠球菌没有抑制作用，作为植物病原菌 的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。
[0011] 本发明通过从凤凰单丛茶树根中取样，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编 号为ZF15的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株从其分类学角度属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株。本发明采用菌株编号为ZF15的细菌菌株，通过对所获菌株进行形态特征、生理生 化特性及总DNA的提取、16SrDNA的PCR扩增和序列测定及系统发育分析，获得一种与常见的 芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株存在明显不同特性的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，从科学角 度证明了是一株新菌，并确定其分类地位。同时，利用筛选出的菌株ZF15对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉进行抑菌试验，ZF15对梨果黑斑病 菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌有较好的抑制作用，菌丝生长抑制率分别为 73.44%、78.90%、65.64%、76.90%，2?15对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为22.85%，是一种 典型性突出、专一性强的生防菌。
[0012] 本发明具体提供一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC No:60016,通过从凤凰 单丛茶树根中分离、筛选和培养，获得一批芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，从中筛选出一株对 防治梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌方面具有突出 功效的芽孢杆菌(Bacillus sp. )ZF15,经微生物学分类与鉴定，属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株。
[0013] 具体的，本发明通过从凤凰单丛茶树根中取样，样本是凤凰单丛茶树根，采集于广 东省潮州饶平县浮滨镇，树龄15、25和50年，种植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水 仙，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为ZF15的菌株，经微生物学分类与鉴定，该 菌株属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株。本发明采用菌株编号为ZF15的细菌菌株，该菌株 已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心 (GDMCC)。地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编:510075。 保藏日期为2016年3月10日，菌种保藏号为⑶MCC N〇:60016。该菌株最适生长条件为:温度 37°C，培养基采用常见的牛肉膏蛋白胨液体培养基、营养琼脂培养基。
[0014]本发明提供的ZF15菌株，经20h培养后，在营养琼脂培养基上菌落为白色，干燥，不 透明，中间褶皱凸起，周边放射状。将菌种ZF15通过镜检观察，该菌株属革兰氏染色阳性，在 显微镜下个体形态为短杆状，单个或成链状排列，产芽孢。根据以上形态特征，参照《伯杰氏 细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，并结合分子生物学测 序，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.)。经分子测序结果表明，芽孢杆菌 (Bacillus sp. )ZF15GDMCC No :60016的 16SrDNA基因序列为 147lbp，与NCBI数据库 Bacillus cereus ATCC 14579(NR_074540.1)同源性最高，最高相似性为94%，与该属其他 标准菌株序列比对同源性分别为94% (Bacillus toyonensis BCT-7112(NR_121761 · 1)、 94%(Bacillus thuringiensis ATCC 10792(NR_114581.1 )^94 % (Baci1lus pseudomycoides NBRC 101232(NR_113991.1)及94%(Bacillus mycoides ATCC 6462(NR_ 115993.1)。
[0015] 但本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016与常见的芽孢杆 菌存在明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子 水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为ZF15的菌种是一种典型的新菌种，有别于常见 的芽孢杆菌(Bacillus)，与常见的细菌菌种相比，其对盐的耐受能力更强，对梨果黑斑病 菌、核桃叶枯病菌和红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌有较好的抑制作用，但是依据 菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，将编号为ZF15的菌种大 致分类归属为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
[0016] 本发明进而提供芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016的分离和培养方 法。
[0017] (1)分离培养基采用：牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2，营养琼脂培养基为蛋白胨1(^、牛肉膏38、氯化钠58、琼脂 15区、蒸馈水100〇111匕
[0018] (2)分离和筛选条件：
[0019] 根中内生细菌的分离:采用组织块培养法，将表面消毒后的根剪成0.5X0.5cm的 组织块，根采用树龄15、25和50年，种植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水仙，每三个 组织块为一组置于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 °C下培养20h，取80yL涂布于营养琼 脂平板，37°C培养18h。待长出细菌菌落后，挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线涂 布于营养琼脂平板，37°C培养18h，反复在营养琼脂平板上划线分离纯化，直至得到单个纯 菌落。
[0020] 经培养筛选确定的芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016在营养琼脂培 养基上菌落为白色，干燥，不透明，中间褶皱凸起，周边放射状；营养琼脂培养基：蛋白胨 l〇g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH自然。
[0021] 进一步，本发明提供一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016在生防中 的应用，通过将芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016在防治梨果黑斑病菌、核桃 叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌中应用，ZF15对梨果黑斑 病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌有较好的抑制作用，菌丝生长抑制率分别 为73.44%、78.90%、65.64%、76.90%，2?15对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为22.85%，是一 种典型性突出、专一性强的生防菌。
[0022]通过实施本发明具体技术指标，实现本
【发明内容】
，可以达到以下有益效果：
[0023] (1)本发明提供了一种新的凤凰单丛茶树内生诘抗菌-芽孢杆菌(Bacillus sp.) ZF15GDMCC No:60016。
[0024] (2)本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016可高效抑制梨果 黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌，ZF15对 梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌菌丝生长抑制率分别为73.44%、 78.90%、65.64%、76.90%，ZF15对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为22.85 % ;经测定，ZF15对梨 果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌有较好的抑制效果， 作为植物病原菌的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有 很好的应用前景。
【附图说明】
[0025] 图1所示为芽孢杆菌(Bacillus sp. )ZF15GDMCC N〇:60016的菌体的菌落形态及个 体形态图。
[0026] 图2所示为芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016琼脂糖凝胶电泳图。
[0027] 图3所示为芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016系统发育树状图。
[0028] 图4所示为芽孢杆菌(Bacillus sp. )ZF15GDMCC N〇:60016对试验指示菌的抑制效 果图，图中，B为枯草芽孢杆菌，C为金黄色葡萄球菌。
[0029] 图5所示为芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC No.60016对植物致病菌的抑菌效 果图，图中：D为梨果黑斑病菌，E为核桃叶枯病菌，G为红枣黑斑病菌，X为瓜果腐霉，Y为立枯 丝核菌。
【具体实施方式】
[0030] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用 的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％ 都为重量百分比，除非特别指出除外。
[0031] 牛肉膏蛋白胨液体培养基：由溶剂和溶质组成，溶质为牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，溶 剂为蒸馏水;加入牛肉膏58、蛋白胨1(^、氯化钠58、蒸馏水10001^，？!17.0-7.2，在温度121 °C的条件下灭菌15min。
[0032] 营养琼脂培养基：由溶剂和溶质组成，溶质为牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂，溶剂 为蒸馏水;加入蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，12rC条件下灭菌 15min〇
[0033] 水琼脂培养基:加入琼脂25g、蒸馏水1000mL，121°C条件下灭菌15min;
[0034] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):由溶剂和溶质组成，溶质为马铃薯浸出粉、葡萄 糖、琼脂，溶剂为蒸馏水;加入马铃薯浸出粉6g、葡萄糖20g、琼脂12g、蒸馏水1000mL，12rC 条件下灭菌15min。
[0035] 采用主要设备仪器:LD2X-30KA型立式电热压力蒸汽灭菌锅、DHP-9162型电热恒温 培养箱武汉诺贝思机械制造有限公司；TGRADIENT型PCR仪、PowerPac型电泳仪、Fluorchem Xplor型荧光-可见光凝胶成像分析系统北京弘图科技有限公司。
[0036] 采用的试验指示细菌:A大肠杆菌(Escherichia coli)、B枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、C金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、P白色念珠球菌（Monilia albican)属于常见的对照菌。
[0037] 采用的D梨果黑斑病菌(Alternaria alternate)、E核桃叶枯病菌(Alternaria alternata)、F梨腐烂病菌（Valsa ambiens Pers)、G红率黑斑病菌（Alternaria sp.)、H前 腐镜刀病菌（Fusarium solani)、X瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum)、Y立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)为常见的植物病原菌，本领域普通技术人员可以通过病害作物梨、 核桃、红枣、棉花、茄科植物中分离;细菌基因组DNA快速提取试剂盒、引物27F、引物1492R、2 XTapPCRMaster mix，生物生工(上海)有限责任公司。
[0038] 本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用 的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
[0039] 实施例一:芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016的分离、筛选及鉴定
[0040] 1、菌种的分离和筛选
[0041] 本发明所使用的芽孢杆菌(Bacillus sp.)由韩山师范学院从广东省潮州饶平县 浮滨镇中凤凰单丛茶树根中取样，根样本采用凤凰单丛茶树根，采集于广东省潮州饶平县 浮滨镇，树龄15、25和50年，种植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水仙，有机种植。经 过采用组织块培养法分离出根中内生细菌，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件， 经过优化筛选出一批生长良好的细菌菌株，从中优选出一株编号为ZF15的菌株。
[0042] 分离步骤：
[0043] (1)分离培养基采用：牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠 58、蒸馏水10001111^!17.0-7.2，营养琼脂培养基为蛋白胨1(^、牛肉膏38、氯化钠58、琼脂 15区、蒸馈水100〇111匕
[0044] 表面消毒:先将根剪成约5cm长，用75 %乙醇浸泡根4min，无菌水冲洗7次，用3.0 % 的双氧水浸泡3min，再用无菌水冲洗10次。
[0045] (2)分离纯化：
[0046]根中内生细菌的分离:采用组织块培养法，将上述步骤表面消毒后的凤凰单丛茶 树根剪成0.5X0.5cm的组织块，每三个组织块为一组置于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基 中，37 °C下培养20h，取80yL涂布于营养琼脂平板，37 °C培养18h，待长出细菌菌落后，挑取形 状、大小、颜色等不同的菌落分别划线涂布于营养琼脂平板，37°C培养18h反复在营养琼脂 平板上划线分离纯化，直至得到单个纯菌落。
[0047] 2、菌株的培养条件
[0048] (1)编号为ZF15的菌株的生长培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基，牛肉膏5g、蛋白胨 1 〇g、氯化钠5g、蒸馏水 1 OOOrnL，pH 7 · 0-7 · 2，经37 °C、20h培养。
[0049] (2)编号为ZF15的菌株在37°C_45°C条件下均能生长，最适生长温度为37°C，培养 时间为20h。
[0050] (3)编号为ZF15的菌株的生长pH为7 · 0-7 · 2。
[0051]上述采用菌株编号为ZF15的细菌菌株，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约 微生物国际保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。地址:广州市先烈中路100号大 院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编:510075。保藏日期为2016年3月10日，菌种保藏编 号为GDMCC No: 60016。该菌株最适生长条件为:温度37°C，培养基采用牛肉膏蛋白胨液体培 养基(牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2)、营养琼脂培养基(蛋白 胨l〇g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL)。经20h培养后，在营养琼脂培养基上 菌落为白色，干燥，不透明，中间褶皱凸起，周边放射状。将菌种ZF15通过镜检观察，该菌株 属革兰氏染色阳性，在显微镜下个体形态为短杆状，单个或成链状排列，产芽孢。芽孢杆菌 (Baci 1 lus sp ·)ZF15菌落和个体形态参见附图1。
[0052]本发明采用的菌株ZF15可在常见的牛肉膏蛋白胨固体培养基或液体培养基中进 行增殖培养。利用常规固体斜面培养、低温保藏的方法，每次传代可保藏3个月以上；以干燥 冷冻法制做的长期保藏菌种，可保藏1年以上;或是以甘油管进行长期保藏。
[0053] 3、菌株ZF15的生理生化鉴定
[0054]生理生化特征：该菌株ZF15在牛肉膏蛋白胨液体培养基、营养琼脂培养基上生长 良好，经试验，选择v-ρ试验、甲基红试验、接触酶试验、4 °C生长试验、酪氨酸水解试验、淀粉 水解试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、9%NaCl生长试验、柠檬酸盐利用试验、糖类产 酸试验对拮抗细菌进行鉴定，结果表明菌株ZF04可以利用葡萄糖、柠檬酸盐、淀粉、明胶，耐 受9 % NaCl，菌株ZF04生理生化特性见表1。
[0055] 表1:菌株ZF15的生理生化特性
[0057] 通过上述对于菌种芽抱杆菌(Bacillus sp. )ZF15GDMCC N〇:60016的菌体形态、培 养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测 定、耐性试验等试验，ZF15参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌鉴定手册》的方 法进行，编号为ZF15的菌种尽管与常见的芽孢杆菌相比，具有共性的一些属性，但是与常见 的芽孢杆菌菌种存在明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明ZF15菌株是一种 典型的新菌种，从菌种分类角度将菌种编号为ZF15的菌株综合鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp. ) ο
[0058] 实施例二:芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016分子水平鉴定
[0059] 利用细菌DNA基因组快速提取试剂盒提取目标菌系DNA。
[0060]弓丨物选用细菌通用引物，细菌16SrDNA通用引物序列：
[0061 ] 27F：57-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-37
[0062] 1492R：57-GGTTACCTTGTTACGACTT-37
[0063] 本发明所用引物27F、引物1492R、2XTapPCRMaster mix均购自生物生工(上海)有 限责任公司。
[0064] 提取基因组DNA采用的20yLPCR扩增体系：引物27F和引物1492R各1.0yL、2X TapPCRMaster mix7. OyL、内生细菌的DNA混合液 1. OyL、双蒸水 10.0 yL。
[0065] PCR扩增程序:94°C预变性5min、94°C变性3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：延伸4〇8，从变性 到延伸30个循环，72°C延伸7min，保温^iruPCR产物经1.8%琼脂糖电泳48染色后由荧 光一可见光凝胶成像分析系统检测。
[0066]以提取的ZF15总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增产 物回收并进行测序，测得的序列是具有序列表的核苷酸序列。菌种ZF15的16SrDNA扩增产 物的琼脂凝胶电泳约在1500bp处出现荧光条带，参见附图2。
[0067] 经测定，芽孢杆菌（Bacillus sp. )ZF15GDMCC N〇:60016的 16SrDNA基因片段为 1471 bp，序列提交GenBank数据库，具体序列参见附后的SEQUENCE LI ST ING。
[0068] 将测序得到的16S rDNA序列输入NCBI，与NCBI数据库中已知序列进行比对，采用 MEGA5.0软件、Clustal W程序进行多重比对，然后以各菌株在NCBI上查询的相近各个种的 16S rDNA序列，采用Neighbour-joining方法构建系统发育树，并进行bootstrap分析，重复 次数为1000次，参见附图3。菌株ZF1516S rDNA序列与NCBI数据库Bacillus cereus ATCC 14579(NR_074540.1)同源性最高，最高相似性为94%，与该属其他标准菌株序列比对同源 性分别为94% (Bacillus toyonensis BCT-7112(NR_121761 · 1)、94% (Bacillus thuringiensis ATCC 10792(NR_114581.1)n94%(Baci1lus pseudomycoides NBRC 101232(NR_113991.1)及94%(Bacillus mycoides ATCC 6462(NR_115993.1)。初步断定为 该属潜在新种。结合ZF15的形态结构特征及生理生化特性，经序列比对表明，初步鉴定为芽 抱杆菌(Bacillus sp.)。
[0069] 实施例三：芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016的生长因子
[0070] 表2:温度、pH、NaCl对菌株ZF15生长的影响
[0072] 按照如上方式将芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016进行培养，菌种的 培养条件为:培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基和营养琼脂培养基，培养条件:PH7.0,温度 37°C条件下培养20h。
[0073] 由表2得出，菌株ZF15最适合生长因子通过以上结果得出将芽孢杆菌（Bacillus sp.)ZF15 GDMCC N〇:60016作为种子的最佳培养温度为37°C，最适生长pH为7.0,耐受9% NaCl〇
[0074] 实施例四：芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016对试验指示细菌的抑菌 作用
[0075] 采用双层平板法测定芽孢杆菌(Bacillus sp. )ZF15对以下试验指示细菌的抑制 作用:A大肠杆菌(Escherichia coli)、B枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、C金黄色葡萄 球菌（Staphylococcus aureus)、P 白色念珠球菌(Monilia albican):
[0076] (1)菌株的活化:挑取一环保存于营养琼脂平板上的ZF15和试验指示细菌划线于 营养琼脂平板上，37 °C下培养20h。
[0077] (2)挑取ZF15纯菌落三环接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37°C、150r/min 培养72h，将发酵后的菌液经5000r/min离心10min，取上清液，经0.22μπι滤膜过滤，去除菌 体，制成ZF15无菌发酵滤液。
[0078] (3)灭菌后的水琼脂15mL倒在直径为9cm的培养皿内，待其凝固，将灭菌的100mL营 养琼脂培养基冷却到50°C左右，加入1.25mL含有1 X 104-1 X 105cfu/mL试验指示细菌的菌 液，摇均，取5mL加到水琼脂平板上;凝固后用打孔器(外径8mm)打孔，孔中加入ZF15菌株无 菌发酵滤液240yL，同时在孔中加入240yL无菌水作对照，在4°C冰箱放置2h使无菌发酵滤液 扩散，37 °C培养18h，测量抑菌圈直径。
[0079]由测定结果可知，参见附图4, ZF15对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作 用，其抑制圈直径分别为11.20mm和10.56mm，对大肠杆菌和白色念珠球菌没有抑制作用，
[0080] 实施例四：芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF15GDMCC N〇:60016对植物病原菌的抑菌作 用
[0081 ]采用对峙培养法测定芽孢杆菌(Bacillus sp. )ZF15对以下植物病原菌的抑制作 用，D梨果黑斑病菌(Alternaria alternate)、E核桃叶枯病菌(Alternaria alternata)、F 梨腐烂病菌(Valsa ambiens Pers)、G红率黑斑病菌(Alternaria sp.)、H前腐镰刀病菌 (Fusarium solan)、X瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum)、Y立枯丝核菌（Rhizoctonia solani)：
[0082] (1)菌株的活化:挑取一环保存于营养琼脂平板上的ZF15划线于营养琼脂平板上， 37 °C下培养20h，挑取一环植物病原菌划线于PDA培养基上，28 °C下培养5d。
[0083] (2)挑取步骤（1)中得到的ZF15纯菌落三环接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基 中，37 °C、150r/min培养72h，将发酵后的菌液经5000r/min离心10min，取上清液，经0.22μηι 滤膜过滤，去除菌体，制成ZF15无菌发酵滤液。
[0084] (3)将内生细菌ZF15无菌发酵滤液200yL涂布于PDA平板上，对照为涂布200yL无菌 水，取直径为1 X 1 cm的植物病原菌菌块放于PDA平板正中央，28 °C培养5d，测量菌落直径，计 算菌丝生长抑制率。
[0085]菌丝生长抑制率的计算公式如下：
[0087]式中，B为对照植物病原菌菌落生长直径(mm) ;T为涂内生细菌发酵滤液后植物病 原菌菌落生长直径(mm)。
[0088]由测定结果可知，参见附图5，ZF15对梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病 菌、立枯丝核菌有较好的抑制作用，菌丝生长抑制率分别为73.44%、78.90%、65.64%、 76.90 %，ZF15对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为22.85 %。
[0089] 通过上述系列实施例，根据由韩山师范学院从广东省潮州饶平县浮滨镇中凤凰单 丛茶树根中取样，样品为茶树的根，采集于广东省潮州饶平县浮滨镇，树龄15、25和50年，种 植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水仙，有机种植，经过采用组织块培养法分离出根 中内生细菌，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的细菌菌 株，从中优选出一株编号为ZF15的菌株。根据以上形态特征，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及 《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为芽 孢杆菌（Bacillus sp·)。分子测序结果表明，芽孢杆菌（Bacillus sp.)ZF15GDMCC No: 60016的 16SrDNA基因序列为 1471bp，与NCBI数据库Bacillus cereus ATCC 14579(NR_ 074540.1)同源性最高，最高相似性为94%，但本发明提供的芽孢杆菌（Bacillus sp.) ZF15GDMCC No:60016与常见的细菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性， 依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为ZF15的菌种 在生理生化特性和分子水平方面与常见的芽孢杆菌具有明显的差异，是一种典型的新菌 种，有别于常见的芽孢杆菌(Bacillus)，与常见的细菌菌种相比，其对盐的耐受能力更强， 对梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌和红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌有较好的抑制 作用，但是依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为 ZF15的菌种为芽抱杆菌(Bacillus sp·)。
[0090] 上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变 化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变 化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种凤凰单丛茶树内生诘抗芽孢杆菌(ifeciDus SjO.) ZF15,其特征在于，所述的芽 孢杆菌(feciDus s/7.) ZF15菌种保藏编号为GDMCC N〇:60016。2. 如权利要求1所述凤凰单丛茶树内生诘抗芽孢杆菌(feciDus Sj〇.) ZF15在防治梨 果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK105886432SQ201610282207
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】廖康, 傅力, 蔡丽, 李云, 欧燕清
【申请人】新疆农业大学, 廖康