Cik细胞及其培养方法和应用

文档序号:10528685阅读:1082来源:国知局
Cik细胞及其培养方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种CIK细胞及其培养方法和应用。本发明CIK细胞培养方法包括如下步骤:采集患者的外周血单个核细胞的步骤和将所述单个核细胞与抗CD3抗体、抗CD28抗体和细胞因子加入无血清培养基中进行诱导培养的步骤。本发明CIK细胞培养方法采用在抗CD28抗体和抗CD3抗体协同作用以提高刺激诱导单个细胞的刺激活性;采用含有细胞因子IL?2和IL?21联合诱导CIK细胞,使得该细胞因子的联合应用对淋巴细胞的扩增产生协同作用,提高CIK细胞的杀伤活性,且减少了因大剂量单因子应用所产生的毒副作用。而且,本发明实施例培养方法缩短了培养时间,降低培养成本,保证了CIK细胞的纯度。
【专利说明】
CIK细胞及其培养方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域,具体的涉及一种CIK细胞及其培养方法和其应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一,在传染病得到控制的国家,心脑血管疾病和恶性肿瘤已分别成为死亡原因的第一和第二位。2005年统计,我国城市居民死亡第一位是恶性肿瘤,是农村居民的第二位死因。
[0003]肿瘤的传统疗法包括手术、化疗和放疗。但是这些疗法都具有局限性:手术常因癌细胞浸润到邻近或转移到远端组织而不能根除;化疗、放疗则受限于对体内其他正常组织的毒性及伤害。近年来流行的靶向疗法可在细胞分子水平上,针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物,药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用,使肿瘤细胞特异性死亡。但是,分子靶向药物只能对特定基因突变型肿瘤产生作用,假如靶点肿瘤基因突变就会产生药物耐受性,导致疗效下降,甚至发生严重的不良反应等问题。
[0004]随着人们对肿瘤发生发展机制的深入研究,及肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程技术的发展,肿瘤的生物治疗迅速发展,成为肿瘤治疗的第四种治疗模式。生物治疗具有较强的针对性、特异性、有效性,对正常造血及免疫系统、主要器官无负面影响和明显毒性,被认为是本世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前途的治疗手段。生物治疗可以单独使用,也可以与现代手术、化疗和放疗方法联合应用,具有很强的互补作用,不但具有清除体内不同部位的肿瘤细胞,防止肿瘤复发与转移的作用,而且对病人受损的免疫系统又能起到恢复与重建的独特作用。
[0005]CIK(Cytokine-1nduced Killer Cell,细胞因子诱导的杀伤细胞):是将人体外周血单个核细胞(PBMC)在体外用多种细胞因子培养增殖诱导后获得的一群异质细胞,CD3+、CD56+双阳性细胞是CIK细胞中主要的效应细胞,因CD3+是T细胞的标志,CD56+是NK细胞的标志,所以又被称为NK细胞样T淋巴细胞,该细胞兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性的广谱杀瘤、抗病毒活性。
[0006]虽然CIK细胞治疗方案具有许多优点,但是当前CIK细胞存在毒性不理想,其培养存在扩增倍数不足,成本较高等技术问题。

【发明内容】

[0007]本发明的目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种CIK细胞及其培养方法,以解决现有CIK细胞存在毒性不理想,其培养存在扩增倍数不足,成本较高等技术问题。
[0008]本发明另一目的在于提供一种细胞治疗肿瘤药物,以克服现有其他细胞治疗药物存在毒性不理想而导致治疗肿瘤效果不理想,费用高的技术问题。
[0009]为了实现上述发明目的,作为本发明的一个方面,提供了一种CIK细胞培养方法。所述CIK细胞培养方法包括如下步骤:
[0010]采集患者的外周血单个核细胞;
[0011]将所述单个核细胞与抗CD3抗体、抗CD28抗体和细胞因子加入无血清培养基中进行诱导培养。
[0012]作为本发明的另一方面,提供了一种CIK细胞。所述CIK细胞是采用本发明CIK细胞培养方法培养获得。
[0013]作为本发明的再一方面,提供了一种细胞治疗肿瘤药物。所述细胞治疗肿瘤药物包含有有效剂量的本发明CIK细胞。
[0014]与现有技术相比,本发明CIK细胞培养方法具有以下优点:
[0015]1.将抗⑶3/⑶28抗体联合用于T淋巴细胞的体外激活,抗⑶28单抗能提供有效的共刺激信号,激发T细胞增殖,在抗CD28抗体的协同作用下,抗CD3抗体的刺激活性明显提尚;
[0016]2.增加基因重组人细胞因子IL-2和IL-21联合诱导CIK细胞,细胞因子的联合应用对淋巴细胞的扩增产生协同作用,比使用单一细胞因子诱导细胞的大幅提高细胞增殖倍数,在抗CD3/CD28抗体联合作用下,提高CIK细胞的杀伤活性,且减少了因大剂量单因子应用所产生的毒副作用;
[0017]3.缩短了培养时间,极大的保持了效应细胞的活性和增殖能力,降低培养成本;
[0018]4.全程采用无血清培养基,有效避免了任何可能的外源性感染,纯度高。
[0019]本发明CIK细胞由于本发明培养方法培养获得,本发明细胞治疗肿瘤药物含有本发明CIK细胞,因此,本发明CIK细胞具有纯度高、对肿瘤杀伤活性强,且使用安全,本发明细胞治疗肿瘤药物具有明显的抗肿瘤作用,安全且成本低。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例1制备的CIK细胞流式细胞术分析图;其中,图1a为⑶3+⑶56+双阳性细胞流式细胞术分析图;图113为CD3+CD8+细胞流式细胞术分析图;
[0021]图2为本发明实施例2制备的CIK细胞流式细胞术分析图;其中,图2a为⑶3+⑶56+双阳性细胞流式细胞术分析图;图213为CD3+CD8+细胞流式细胞术分析图;
[0022]图3为本发明实施例3制备的CIK细胞流式细胞术分析图;其中,图3a为CD3+CD56+双阳性细胞流式细胞术分析图;图313为CD3+CD8+细胞流式细胞术分析图;
[0023 ]图4为本发明实施例1-3中CIK细胞增殖曲线图。
【具体实施方式】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明作进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0025]本发明实施例提供了一种CIK细胞培养方法。在一实施例中,所述CIK细胞培养方法包括如下步骤:
[0026]SO1:采集患者的外周血单个核细胞;
[0027]S02:将所述单个核细胞与抗⑶3抗体、抗⑶28抗体和细胞因子加入无血清培养基中进行诱导培养。
[0028]其中,上述步骤SOl中,作为本发明的一实施例,外周血单个核细胞的采集可以但不仅仅按照如下方法:
[0029]用含肝素钠的无菌采血管采集外周血50ml,用0.9%生理盐水等倍稀释抗凝外周血,混匀后再将稀释血液缓慢加在人淋巴分离液上,2000rpm,离心20min。吸取分离液界面乳白色单个核细胞层,并离心洗涤两次,计算得到单个核细胞总数。
[0030]当然,该CIK细胞还可以用本领域的其他方法进行采集,如可以先通过白细胞分离技术获得患者的白细胞,再采用密度法离心收集采集获得外周血单个核细胞。
[0031 ]在进一步实施例中,在将步骤SOl的采集的单个核细胞加入步骤S02所述无血清培养基中进行诱导培养之前,还可以包括对所述单个核细胞进行培养前质控检查的步骤,该培养前质控检查的内容和各内容检查的步骤可以是本领域常规的进行。通过增设前期质控检查的步骤,从而对活细胞数量和细胞类型,以保证单个核细胞的活力,从而进一步提高CIK细胞诱导率。
[0032]上述步骤S02中,采用抗⑶3抗体、抗⑶28抗体联合用于T淋巴细胞的体外激活,抗CD28单抗能提供有效的共刺激信号,激发T细胞增殖,在抗CD28抗体的协同作用下,抗CD3抗体的刺激活性明显提高,因此,抗CD3抗体、抗CD28复合抗体之间能够起到增效作用,从而提高对单个核细胞的诱导效果。
[0033]在一实施例中,在该步骤S02中的诱导培养的过程中,控制所述抗CD3抗体终浓度为 5_50yg/ml,具体如 5yg/ml、10yg/ml、20yg/ml、30yg/ml、40yg/ml、50yg/ml 等,抗⑶ 28 单抗终浓度为 5_50yg/ml,具体如 5yg/ml、10yg/ml、20yg/ml、30yg/ml、40yg/ml、50yg/ml 等。通过对抗CD3抗体和所述抗CD28抗体在诱导培养中的浓度,以提高抗CD3抗体、抗CD28复合抗体之间能够起到增效作用,从而进一步提高对单个核细胞的诱导效果。
[0034]在一实施例中,该步骤S02中的细胞因子包括IL-2和IL-21。
[0035]其中,该IL-2应用于促进T细胞与NK细胞活化和增殖,增加细胞毒作用并刺激T细胞分泌多种细胞因子。但是IL-2活化T细胞的一个缺点是可以激活⑶4 Foxp3 Treg调节细胞,Treg可以抑制T细胞的活化和肿瘤杀伤,另IL-2还可以诱导活化的T细胞凋亡,引起T细胞过度分化,形成能力较弱的老化T细胞。IL-21与IL-2—样通过一个特异性受体亚单位及IL-2受体γ c亚单位复合受体发挥其生物学功能。IL-21能促进⑶4+和⑶8+Τ细胞增殖,增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒性而不引起活化产生的细胞凋亡,而且IL-21优先扩增⑶27+CD28+的CD8+T细胞,这类细胞的细胞毒作用更强,同时不会引起Treg的扩增。
[0036]因此,在上述实施例中,在诱导培养过程中同时增加含有基因重组人细胞因子IL-2和IL-21实现联合诱导CIK细胞。该细胞因子的联合应用能够对淋巴细胞的扩增产生协同作用,比使用单一细胞因子诱导细胞的大幅提高细胞增殖倍数,在抗CD3/CD28抗体联合作用下,提高CIK细胞的杀伤活性,且减少了因大剂量单因子应用所产生的毒副作用。
[0037]在上述各实施例的基础上,作为一实施例,在该步骤S02中的诱导培养的过程中,控制所述IL-2的终浓度为200-1000U/ml,具体如200U/ml、300U/mK400U/ml、500U/ml、600U/ml、700U/ml、800U/ml、900U/ml、lOOOU/ml等,所述IL-21 的终浓度200_800U/ml,具体如 200U/ml、300U/ml、400U/ml、500U/ml、600U/ml、700U/ml、800U/ml 等。通过对 IL-2 和所述IL-21在诱导培养中的浓度,在上述抗⑶3抗体、抗⑶28复合抗体的基础上,以实现提高IL-2和所述IL-21之间的协效作用,以大幅提高CIK细胞增殖倍数,并进一步降低细胞因子的剂量。
[0038]同样,在上述各实施例的基础是,在一具体实施例中,该步骤S02中所述诱导培养方法如下:
[0039]步骤S021:第O天,在所述单个核细胞的悬液中添加重组人干扰素终浓度为100u/ml,再将所述悬液转入抗CD3抗体和抗CD28抗体包被的细胞培养瓶中,并进行培养,具体的如在37 °C,5 % CO2条件下培养;其中,所述重组人干扰素优选为重组人IFN- γ ;
[0040]步骤S022:第I天(也即是24小时后),所述细胞培养瓶中添加所述无血清培养基和终浓度 100u/ml IL-la、200-1000U/ml IL-2、200_800U/ml IL-21 细胞因子于37°C,5%C02进行诱导培养;
[0041 ]步骤S023:第2天,补充所述无血清培养基,并补充IL-2和IL-21,使其终浓度为200-1000U/ml IL-2和200-800U/ml IL-21;
[0042]步骤S024:第4天,细胞计数并将细胞转移至细胞培养袋中扩大培养,此后每2_3天根据细胞密度补加终200-1000U/ml IL-2、200_800U/ml IL-21的所述无血清培养基;直至培养第14天。
[0043]在上述实施例中,在所述悬液中,也即是上述步骤S021中,所述单个核细胞在所述悬液浓度为(2-3) X106/ml;
[0044]在第4天的培养中,也即是步骤S024中,控制所述单个核细胞的浓度为(0.5-1.0)X 10%1。第4天后,每2-3天的培养中,控制所述单个核细胞的浓度为(1-2) X 10%1。
[0045]在上述各实施例的基础上,作为一实施例,所述无血清培养基为但不仅仅KBM581。
[0046]因此,上述本发明实施例CIK细胞培养方法采用在抗⑶28抗体和抗⑶3抗体协同作用以提高刺激诱导单个细胞的刺激活性;采用含有细胞因子IL-2和IL-21联合诱导CIK细胞,使得该细胞因子的联合应用对淋巴细胞的扩增产生协同作用,提高CIK细胞的杀伤活性,且减少了因大剂量单因子应用所产生的毒副作用。而且,本发明实施例培养方法缩短了培养时间,极大的保持了效应细胞的活性和增殖能力,降低培养成本,保证了CIK细胞的纯度。
[0047]另一方面,在上述CIK细胞培养方法的基础上,本发明实施例还提供了一种CIK细胞。在一实施例中,该CIK细胞是有上文本发明实施例CIK细胞培养方法诱导培养获得。这样本发明实施例CIK细胞如上文所述的,具有纯度高、对肿瘤杀伤活性强,且使用安全。
[0048]再一方面,本发明实施例还提供了一种细胞治疗肿瘤药物。在一实施例中,本发明实施例细胞治疗肿瘤药物包含有有效剂量的上文本发明实施例CIK细胞。这样,由于本发明实施例细胞治疗肿瘤药物含有上文本发明实施例CIK细胞,因此,该细胞治疗肿瘤药物具有上文本发明实施例CIK细胞的特性,如具有纯度高、对肿瘤杀伤活性强,且使用安全。而且如上文所述,CIK细胞的培养时间短,因此,缩短了本发明实施例细胞治疗肿瘤药物获得时间,大大减小了患者采样后等待治疗的时间,从而使得患者能够及时得到治疗,避免了潜在的大量采集血细胞后患者肿瘤免疫失调、导致肿瘤扩散的可能。其中,CIK细胞的有效剂量是指足以对个体显示益处或临床意义的CIK细胞的量。本领域技术人员将会理解,给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性、被治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。
[0049]下面通过具体实施例对上述本发明实施例CIK细胞及其培养方法进一步说明。
[0050]实施例1
[0051]本实施例提供一种高细胞毒活性的CIK细胞体外制备方法以及由该方法培养的CIK细胞。该CIK细胞体培养方法包括以下步骤:
[0052]SI 1.抗体包被:
[0053]将10yg/ml抗CD3单克隆抗体和10yg/ml抗CD28单克隆抗体包被在T-75细胞培养瓶中,至于37 °C培养箱静置5-8小时,或4°C冰箱过夜;
[0054]SI 2.PMBC 制备:
[0055]用含肝素钠的无菌采血管采集外周血50ml,用0.9%生理盐水等倍稀释抗凝外周血,混匀后再将稀释血液缓慢加在人淋巴分离液上,2000rpm,离心20min。吸取分离液界面乳白色单个核细胞层,并离心洗涤两次,计算得到单个核细胞总数;最后用KBM581培养基将PBMC重悬,并调整细胞密度至(2-3) X 106/ml ;
[0056]SI 3.CIK细胞诱导、扩增:
[0057]在细胞悬液中加入重组人IFN-γ终浓度为1000u/ml。再将细胞悬液转入抗⑶3\CD28抗体包被的细胞培养瓶中(1ml/瓶),置于37°C,5%C02细胞培养箱中,计为第O天;
[0058]第I天添加KBM581培养基,并添加终浓度 100u/ml IL_la、500U/ml IL_2、300U/mlIL-21细胞因子;
[0059]第2天添加KBM581培养基,并添加终浓度为500u/ml IL-2和300u/ml IL-21;
[0060]第4天,细胞计数并将细胞转移至细胞培养袋中扩大培养,此后每2-3天根据细胞密度补加500u/ml IL-2、300u/ml IL-21 的KBM581 培养基;
[0061]第14天完成细胞制备。
[0062]实施例2
[0063]本实施例提供一种高细胞毒活性的CIK细胞体外制备方法以及由该方法培养的CIK细胞。该CIK细胞体培养方法包括以下步骤:
[0064]S21.抗体包被:
[0065]将10yg/ml的抗CD3单抗包被在T-75细胞培养瓶中,至于37°C培养箱静置5-8小时,或4 °C冰箱过夜;
[0066]S22.PBMC 制备:
[0067]用含肝素钠的无菌采血管采集外周血50ml,用0.9%生理盐水等倍稀释抗凝外周血,混匀后再将稀释血液缓慢加在人淋巴分离液上,2000rpm,离心20min。吸取分离液界面乳白色单个核细胞层,并离心洗涤两次,计算得到单个核细胞总数;最后用KBM581培养基将PBMC重悬,并调整细胞密度至(2-3) X 106/ml ;
[0068]S23.CIK细胞诱导、扩增:
[0069]在细胞悬液中加入重组人IFN- γ终浓度为1000u/ml。再将细胞悬液转入抗⑶3抗体包被的细胞培养瓶中(1ml/瓶),置于37°C,5%CO2细胞培养箱中,计为第O天;
[0070]第I天添加KBM581培养基,并添加终浓度100u/ml IL_la、500U/ml IL-2、细胞因子;
[0071]第2天添加KBM581培养基,并添加终浓度为500u/ml IL-2;
[0072]第4天,细胞计数并将细胞转移至细胞培养袋中扩大培养,此后每2-3天根据细胞密度补加500u/ml IL-2、的KBM581培养基;
[0073]第14天完成细胞制备。
[0074]实施例3
[0075]本实施例提供一种高细胞毒活性的CIK细胞体外制备方法以及由该方法培养的CIK细胞。该CIK细胞体培养方法包括以下步骤:
[0076]S31.抗体包被:
[0077]将5yg/ml的抗CD3单抗和5yg/ml的抗CD28单抗包被在T-75细胞培养瓶中,至于37°C培养箱静置5-8小时,或4°C冰箱过夜;
[0078]S32.PBMC 制备:
[0079]用含肝素钠的无菌采血管采集外周血50ml,用0.9%生理盐水等倍稀释抗凝外周血,混匀后再将稀释血液缓慢加在人淋巴分离液上,2000rpm,离心20min。吸取分离液界面乳白色单个核细胞层,并离心洗涤两次,计算得到单个核细胞总数;最后用KBM581培养基将PBMC重悬,并调整细胞密度至(2-3) X 106/ml ;
[0080]S33.CIK细胞诱导、扩增;
[0081]在细胞悬液中加入重组人IFN-γ终浓度为1000u/ml。再将细胞悬液转入抗⑶3/CD28抗体包被的细胞培养瓶中(1ml/瓶),置于37°C,5%C02细胞培养箱中,计为第O天;
[0082]第I天添加KBM581培养基,并添加终浓度100u/ml IL_la、1000U/ml IL-2、细胞因子;
[0083]第2天添加KBM581培养基,并添加终浓度为1000u/ml IL-2;
[0084]第4天,细胞计数并将细胞转移至细胞培养袋中扩大培养,此后每2-3天根据细胞密度补加1000u/ml IL-2的KBM581培养基;
[0085]第14天完成细胞制备。
[0086]相关实验结果:
[0087]将上述实施例1-3制备的CIK细胞进行流式细胞术分析。其中,实施例1中制备的CIK细胞流式细胞术分析结果如图1所示,由图1可知,CD3-CD56双阳性细胞在30-40%,但是CD3-CD8双阳性细胞在85%以上。实施例2和3制备的CIK细胞流式细胞术分析结果分别如图2和3所示,由图2、3可知,CD3-CD56+双阳性细胞在10%-20%之间,CD3-CD8双阳性细胞在80%以上。
[0088]另外,在实施例1-3培养CIK细胞过程中,同步检测CIK细胞增殖情况,根据检测的结果绘制的CIK细胞增殖曲线如图4所示。由图4曲线可知,本发明实施例方法培养CIK细胞时间短,效率高。
[0089]本发明实施例提供的CIK细胞包括针对多种抗原表位的多表位特异性,又包括针对每种抗原表位的多种效应手段,这种良好的特异性和具有优秀的抗肿瘤作用。
[0090]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种CIK细胞培养方法,其特征在于,包括如下步骤: 采集患者的外周血单个核细胞; 将所述单个核细胞与抗CD3抗体、抗CD28抗体和细胞因子加入无血清培养基中进行诱导培养。2.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于:在所述诱导培养的过程中,所述抗CD3单抗终浓度为5-50yg/ml,抗CD28单抗终浓度为5-50yg/ml。3.根据权利要求1或2所述的培养方法,其特征在于:所述细胞因子包括IL-2和IL-21。4.根据权利要求3所述的培养方法,其特征在于:所述IL-2的终浓度为200-1000U/ml,所述IL-21的终浓度为200-800U/ml的IL-21。5.根据权利要求3任一所述的培养方法,其特征在于:所述诱导培养方法如下: 在所述单个核细胞的悬液中添加重组人干扰素终浓度为1000u/ml,再将所述悬液转入抗CD3抗体和抗CD28抗体包被的细胞培养瓶中,并进行培养; 第I天(S卩24小时后)向所述细胞培养瓶中添加所述无血清培养基和终浓度lOOu/mlIL-la、200-1000U/ml IL-2、200_800U/ml IL-21 的细胞因子进行诱导培养; 第2天,补充所述无血清培养基,并补充终浓度为200-1000u/ml IL-2和200_800u/mlIL-21; 第4天,细胞计数并将细胞转移至细胞培养袋中扩大培养,此后每2-3天根据细胞密度补加终200-1000U/ml IL-2、200_800U/ml IL-21的所述无血清培养基;直至培养第14天。6.根据权利要求5所述的培养方法,其特征在于:所述重组人干扰素为重组人IFN-γ。7.根据权利要求5或6任一所述的培养方法,其特征在于:在所述悬液中,第O天所述单个核细胞在所述悬液浓度为(2-3) X 106/ml; 在第4天的培养中,控制所述单个核细胞的浓度为(0.5-1.0) X 106/ml; 第4天后,每2-3天的培养中,控制所述单个核细胞的浓度为(1-2) X 106/ml。8.根据权利要求1、2、4-6任一所述的培养方法,其特征在于:所述无血清培养基为KBM581。9.一种CIK细胞,其特征在于:所述CIK细胞是采用权利要求1-8任一所述的CIK细胞培养方法培养获得。10.—种细胞治疗肿瘤药物,其特征在于:包含有有效剂量的权利要求9所述的CIK细胞。
【文档编号】A61P35/00GK105886469SQ201610290919
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】张文, 张诺琳, 陈伟雄
【申请人】深圳瑞祥元科技有限公司
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