一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基及其制备方法，所述培养基为低氮天冬酰胺?琥珀酸培养基，所述培养基包括碳源浓度为5～30g/L，氮源浓度为5～30mmol/L，锰离子浓度是26.7～200μmol/L，吐温80浓度为0.25～0.75mL/L，MgSO4﹒7H2O浓度为0.1～0.4g/L，矿质元素溶液加入量为10～20mL/L，培养液pH值3.5～5.5。本发明利用白腐菌中的木质素降解酶锰过氧化物酶对木质素进行生物降解，最终能把木质素彻底降解为CO2和H2O，就从根本上解决了造纸工业的环境污染问题。锰过氧化物酶可以降解木质素及苯酚类物质，还可攻击各种有机污染物包括持久稳固的化学农药、染料脱色等。
【专利说明】
一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种锰过氧化酶培养基，尤其涉及的是一种白腐菌分泌锰过氧化物酶 培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 木质素是植物界中数量仅次于纤维素的天然高分子有机物，是最为丰富的、能从 可再生资源中取得的芳香族化合物。木质素的生物降解在地球碳循环中起着关键的作用。 自然界存在着许多降解木质素的微生物。它们能攻击降解木质素并引起木材白色腐朽病， 它可以在木质素细胞腔内产生一些的胞外氧化酶系，主要包括锰过氧化物酶(Manganese peroxidases/MnPs)、漆酶（Laccases/Lac)和木质素过氧化物酶（Lignin peroxidases/ LiPs)，它们是白腐菌木质素降解酶系的主要组成部分，其中ΜηΡ是一种依赖H202的亚铁血红 素糖蛋白酶，是一种最常见的降解木质素的过氧化物酶，在真菌降解木质素的非特异性胞 外氧化还原酶中，ΜηΡ起着至关重要的作用。
[0003] 锰过氧化物酶虽具有如此重要的用途，但其在生产实践中的应用仍十分有限，主 要原因是多数生产菌株合成锰过氧化物酶的活性低，造成锰过氧化物酶产量不高。因此，高 产锰过氧化物酶菌株的获得对再生资源、节省能源，还是从综合治理水污染、开发绿色环保 新材料都是一项有着深远的社会意义和紧迫的现实意义及具有潜在的经济价值的研究课 题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培 养基及其制备方法，可实现锰过氧化物酶的工业化生产。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所述培养基为低氮天冬酰胺-琥珀酸 培养基，所述培养基包括碳源浓度为5~30g/L，氮源浓度为5~30mmol/L，锰离子浓度是 26 · 7~200ymol/L，吐温 80 浓度为 0 · 25~0 · 75mL/L，MgS(k. 7H20 浓度为0 · 1 ~0 · 4g/L，矿质元 素溶液加入量为10~20mL/L，培养液pH值3.5~5.5。
[0006] 作为本发明的优选方式之一，所述碳源选自蔗渣、葡萄糖、稻草、玉米淀粉中的任 一种。
[0007] 作为本发明的优选方式之一，所述氮源选自酒石酸铵、蛋白胨、硫酸铵、豆柏中的 任一种。
[0008] 所述培养基包括葡萄糖浓度为5g/L，蛋白胨浓度为20mmol/L，锰离子浓度是200μ mol/L，吐温80浓度为0.25mL/L，MgS〇4.7Η20浓度为0.3g/L，矿质元素溶液加入量为15mL/L， 培养液pH值4.5。
[0009] 所述每100mL的矿质元素溶液包括柠檬酸铁水合物0.0087g，ZnS〇4 · 7H2〇 O.Olg， MnS〇4· H2O 0.045g，CoCl2· 6H2O 0.01g，CuS〇4· 5H2〇 O.OOlg。
[0010] 所述培养基中还包括多种维他命溶液，每l〇〇mL多种维他命溶液包括D生物素 0.002g，叶酸(h0002g，维生素 B1 0.005g，维生素 B2 (h0005g，维生素 B6 O.OOlg，维生素 B12 0.00001 g，烟酸0.0005g，泛酸盐0.0005g，对氨基苯甲酸0.0005g，DL-6，8-硫辛酸0.0005g。 [0011 ] 所述白腐菌为猴头菌Hericium erinaceum。
[0012] -种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基的配制方法，包括以下步骤：
[0013] (1)配制固体培养基roA，包括马铃薯180~220g，葡萄糖18~22g，琼脂粉18~22g， 蛋白胨3~8g，蒸馏水定容至1000mL，pH值自然；
[0014] (2)在PDA平皿上将活化好的白腐菌菌种制成边长8~10mm菌块，将得到的菌块接 入低氮天冬酰胺-琥珀酸液体培养基中；
[0015] (3)按照装液量为100mL装瓶，每瓶接种8个菌块，然后在转速100~300r/min，温度 20~36 °C摇床中恒温振荡培养7d，制成母液。
[0016] 作为本发明的优选方式之一，（1)配制固体培养基PDA，包括马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂粉20g，蛋白胨5g，蒸馏水定容至1000mL，pH值自然；
[0017] (2)在PDA平皿上将活化好的白腐菌菌种制成8~10mm菌块，将得到的菌块接入低 氮天冬酰胺-琥珀酸液体培养基中；
[0018] (3)按照装液量为100mL装瓶，每瓶接种8个菌块，然后在转速200r/min，温度28 °C 摇床中恒温振荡培养7d，制成母液。
[0019] 本发明相比现有技术具有以下优点:本发明利用白腐菌中的木质素降解酶锰过氧 化物酶对木质素进行生物降解，最终能把木质素彻底降解为〇) 2和出0，就从根本上解决了造 纸工业的环境污染问题。锰过氧化物酶可以降解木质素及苯酚类物质，还可攻击各种有机 污染物包括持久稳固的化学农药、染料脱色等，本发明的发酵生产锰过氧化物酶的方法，最 高锰过氧化物酶活力可达400.6U/L，约为优化前的10.4倍;采用5L发酵罐实验，最高锰过氧 化物酶活力可达531.8U/L，约产酶量为摇瓶条件下的1.37倍。
【附图说明】
[0020] 图1是猴头菌产锰过氧化物酶第一次正交试验碳源种类的趋势图；
[0021 ]图2是猴头菌产锰过氧化物酶第一次正交试验碳源浓度的趋势图；
[0022] 图3是猴头菌产锰过氧化物酶第一次正交试验氮源种类的趋势图；
[0023] 图4是猴头菌产锰过氧化物酶第一次正交试验氮源浓度的趋势图；
[0024] 图5是猴头菌产锰过氧化物酶第一次正交试验锰离子浓度的趋势图；
[0025] 图6是猴头菌产锰过氧化物酶第二次正交试验装液量趋势图；
[0026]图7是猴头菌产锰过氧化物酶第二次正交试验吐温80趋势图；
[0027]图8是猴头菌产锰过氧化物酶第二次正交试验PH值趋势图；
[0028]图9是猴头菌产锰过氧化物酶第二次正交试验MgS〇4.7H20趋势图；
[0029] 图10是优化培养猴头菌产锰过氧化物酶曲线图。
【具体实施方式】
[0030] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0031] 1、锰过氧化物酶活力的测定方法
[0032] 锰过氧化物酶活力测定方法采用2，6_二甲氧基苯酚法。lmL反应体系中含50yL (10mmol/L)的反应底物2,6-二甲氧基苯酚(2,6-〇1^)、丙二酸钠缓冲液(5〇111111〇1/1)84(^1^ MnS〇4(10mmol/L)50yL，H2〇2(10m mol/L)10yL启动反应和50yL稀释好的酶液，25°C启动反应 并测定反应前lmin内反应液在470nm处吸光度的增加值A0D470,以灭活的酶液作为空白。 定义该条件下，每min催化Ιμπιο? 2，6-二甲氧基苯酸氧化所需酶量为1个酶活力单位(U/ L)〇
[0033] 并按下式计算锰过氧化物酶活性值：
[0034] 锰过氧化物酶活力(U · L-1) = [106XVlXAAXN]/[V2XeXAt]，
[0035] 式中：VI -反应总体积;V2-酶液的体积;N-酶液稀释倍数；ε-摩尔消光系数；ε 470 = 49600mol · L-1 · cm-SAt-反应时间；ΛΑ反应时间内吸光度的增量值。
[0036]锰过氧化物酶氧化Μη2+为Μη3+Μη3+与丙二酸钠形成的复合物在470nm下的摩尔吸光 系数为49600mol/L/cm。
[0037] 2、产酶培养基的优化
[0038] 白腐菌分泌锰过氧化物酶的产酶培养基进行优化，第1次正交试验的因素水平为4 个等级。选用了 4种碳源、4种氮源和锰离子，采用5种试验因素包括:A碳源种类、B碳源浓度 (g/L)、C氮源种类、D氮源浓度(mmol/L)和Ε Mn2+的浓度(μπιο? · L)。白腐菌分泌猛过氧化物 酶的产酶培养基进行优化，第1次正交试验的因素水平为4个等级。采用5种试验因素包括:A 4种碳源种类包括蔗渣、葡萄糖、稻草、玉米淀粉;B碳源浓度分别为5~30g/L;C 4种氮源种 类包括酒石酸铵、蛋白胨、硫酸铵、豆柏；D氮源浓度分别为5~30mmol/L;E锰离子为浓度 26.7~20(^111〇1/1。根据生物统计学设计出第1次正交试验1^ 6(45)的正交表，在产酶基础培 养基的基础上，改变部分培养基的组成进行16组不同配方培养基的第一次正交试验，每组 试验做3个重复，每次需提取48份酶的试样并测定酶活。
[0039] 第一次正交试验对产ΜηΡ酶的影响
[0040] 第一次正交试验的因素水平为4个等级，选用4种碳源和4种氮源，采用5种试验因 素包括:Α碳源种类、Β碳源浓度(g/L)、C氮源种类、D氮源浓度(mmol/L)和Ε Μη2+的浓度(μ mol/L)，见表 1。
[0041] 表1猴头菌产ΜηΡ第一次正交试验因素水平设计
[0043]根据生物统计学设计出第1次正交试验L16(45)的正交表，在产酶基础培养基的基 础上，改变部分培养基的组成进行16组不同配方培养基的第一次正交试验，每组试验做3个 重复，每次需提取48份酶的试样并测定酶活，主要考察每种因素产ΜηΡ的状况，结果见表2。 比较各因素水平最大均值ki，最终得出培养基的最优配方为A2B1C2D3E4,即碳源为葡萄糖 浓度为5g/L，氮源为蛋白胨浓度为20mmol/L，猛离子浓度是200ymol/L。通过极差分析，排列 出各因素对指标影响大小为:RC>RA>RD>RE>RB，即说明氮源种类对猴头菌产ΜηΡ影响最大， 接着是碳源种类、氮源浓度，然后是锰离子浓度和碳源浓度。
[0044] 表2第一次正交试验对产ΜηΡ酶的影响结果
[0045]
[0046]
[0047] 图1~5为第一次正交试验的趋势图，表明了5种因素在不同水平下对产ΜηΡ酶的情 况。可知葡萄糖最有利于产酶，玉米淀粉最不利于产酶。不同的碳源种类对产ΜηΡ酶的影响 比较大，但是碳源的浓度对产ΜηΡ酶的影响不是很大。不同氮源种类对产ΜηΡ酶的影响最大， 氮源为硫酸铵和豆柏时情况不佳，此外氮源浓度对产ΜηΡ酶也有一定影响，所以氮源是影响 ΜηΡ酶分泌的一个重要因素。在试验范围内锰离子浓度越高越好。
[0048] 第二次正交试验对产ΜηΡ酶的影响
[0049] 在第一次正交试验的基础上，进行第二次正交试验，以F静止培养时装液量(mL)、G 吐温80的浓度(mL/L)、H pH值、I MgS04.7H20的浓度(g/L)为因素（见表3)，设计出L9 (34)正 交表进行第二次正交试验。
[0050] 第二次正交试验获得猴头菌产ΜηΡ的最佳条件为：吐温80浓度为0.25mL/L，培养液 pH值4 · 5，MgS〇4.7H2〇 浓度为 0 · 3g/L。
[0051 ]表3猴头菌产ΜηΡ第二次正交试验因素水平设计
[0053]在第二次正交试验中最获得最优方案为F1G1H2I1，见表4。即培养时装液量为 1 OOmL，吐温80浓度为0.25mL/L，pH为4.5，MgS04.7H20浓度为0.3g/L。通过极差分析，排列出 各因素对指标影响大小的主次顺序为:RF>RH>RG>RI，即装液量和pH值对产酶影响最大，其 次是吐温80浓度和MgS04.7H20浓度。
[0054] 表4第二次正交试验对产ΜηΡ酶的影响结果
[0056]图6~9为第二次正交试验的趋势图，表明了4种因素在不同水平下对产ΜηΡ酶的情 况。装液量的多少既反映营养物质，也反映了相对的溶氧量，可见猴头菌对溶氧量的要求很 大。越高浓度的吐温80不利于产ΜηΡ酶，pH值的浓度为4.5为宜，Mg 2+浓度不宜太高。
[0057] 表5不同转速对产ΜηΡ的影响
[0059] 应用最佳优化组合A 2B1C2D3E4F1G1H2I 1培养基条件，ΜηΡ的活 性在静止时3d后产生，而在振荡培养时24h后产生，随之转速逐渐升高至200r/min，ΜηΡ酶产 量最高;但当转速进一步增加至300r/min，MnP酶活力明显降低。因此确定转速为200r/min。
[0060] 表6不同温度对产ΜηΡ的影响
[0062] 应用最佳优化组合A 2B1C2D3E4F1G1H2I 1培养基条件，在5种温 度下振荡培养200r/min，第7d测定酶活，当温度低于32°C时，总体产酶效果较好，最适产酶 温度为28°C，在该温度下酶活力达到318.2U/L;但当温度超过32°C时，产酶量迅速下降，36 °(：时，酶活力下降到143.4U/L，猴头菌于温度的要求很高，强烈高温抑制产ΜηΡ酶，因此确定 最佳发酵温度为28 °C。
[0063] 表7不同矿质元素浓度产ΜηΡ的影响
[0065] 应用最佳优化组合A 2B1C2D3E4F1G1H2I 1培养基条件，在28Γ 下振荡培养200r/min，第7d的产酶结果是矿质元素溶液加入量为15mL/L，可见矿质元素的 浓度变化对产ΜηΡ酶效率影响并不大。
[0066] 3、优化试验
[0067] 采用优化后的培养基配方和发酵条件进行发酵产酶，最终获得猴头菌产ΜηΡ的最 佳条件为:培养液葡萄糖浓度为5g/L、蛋白胨浓度为20mmol/L、锰离子浓度是200ymol/L、吐 温80浓度为0.25mL/L，MgS〇4.7H2〇浓度为0.3g/L、矿质元素溶液加入量为15mL/L、培养液pH 值4.5;培养温度28°C ; 200rpm摇瓶培养条件下装液量为100mL。最终通过3组振荡优化培养 试验，在7d左右最高锰过氧化物酶活力可达400.6U/L，约为优化前的10.4倍。
[0068] 4、发酵罐实验
[0069]采用5L发酵罐，装液量3L，接种量10 %，发酵温度28°C，每天定时取发酵液3mL， 5000r/min、4°C离心5min，取上清液测定锰过氧化物酶活力。
[0070]表8猴头菌发酵过程锰过氧化物酶活力的变化
[0072] 随着发酵时间的延长，锰过氧化物酶活力也逐渐提高，当发酵进行到第7d的时候， 酶活力达到最大，图10为优化培养猴头菌产ΜηΡ酶曲线图，采用5L发酵罐实验，最高锰过氧 化物酶活力可达531.8U/L，最高酶活力约为实验室摇瓶条件下的1.37倍;随着发酵时间的 进一步增加，产酶活力则开始下降。
[0073] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基，其特征在于，所述培养基为低氮天冬酰胺-琥 珀酸培养基，所述培养基包括碳源浓度为5~30g/L，氮源浓度为5~30mmol/L，锰离子浓度 是26 · 7 ~200μπιο 1/L，吐温 80 浓度为 O · 25 ~O · 75mL/L，MgS〇4.7H20 浓度为O · 1 ~O · 4g/L，矿质 元素溶液加入量为10~20mL/L，培养液pH值3.5~5.5。2. 根据权利要求1所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基，其特征在于，所述碳源 选自蔗渣、葡萄糖、稻草、玉米淀粉中的任一种。3. 根据权利要求1所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基，其特征在于，所述氮源 选自酒石酸铵、蛋白胨、硫酸铵、豆柏中的任一种。4. 根据权利要求1所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基，其特征在于，所述培养 基包括葡萄糖浓度为5g/L，蛋白胨浓度为20mmol/L，锰离子浓度是200ymol/L，吐温80浓度 为0.25mL/L，MgS〇4.7H20浓度为0.3g/L，矿质元素溶液加入量为15mL/L，培养液pH值4.5。5. 根据权利要求1所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基，其特征在于，所述每 IOOmL的矿质元素溶液包括柠檬酸铁水合物0.0087g，ZnS〇4 · 7H20 0.01g，MnS〇4 · H2O 0.045g,CoCl2· 6H2O O.Olg,CuSO4· 5H20 0.001g〇6. 根据权利要求1所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基，其特征在于，所述培养 基中还包括多种维他命溶液，每IOOmL多种维他命溶液包括D生物素0.002g，叶酸0.0002g， 维生素 BI 0.005g，维生素 B2 0.0005g，维生素 B6 O.OOlg，维生素 B12 O.OOOOlg，烟酸 0.0005g，泛酸盐0.0005g，对氨基苯甲酸0.0005g，DL-6，8-硫辛酸0.0005g。7. 根据权利要求1所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基，其特征在于，所述白腐 菌为猴头菌Hericium erinaceum〇8. 如权利要求1~7任一项所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基的配制方法，其 特征在于，包括以下步骤： (1) 配制固体培养基PDA，包括马铃薯180~220g，葡萄糖18~22g，琼脂粉18~22g，蛋白 胨3~8g，蒸馏水定容至1000 mL，pH值自然； (2) 在PDA平皿上将活化好的白腐菌菌种制成边长8~IOmm菌块，将得到的菌块接入低 氮天冬酰胺-琥珀酸液体培养基中； (3) 按照装液量为IOOmL装瓶，每瓶接种8个菌块，然后在转速100~300r/min，温度20~ 36 °C摇床中恒温振荡培养7d，制成母液。9. 根据权利要求8所述的一种白腐菌分泌锰过氧化物酶培养基的配制方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 配制固体培养基HM，包括马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g g，蛋白胨5g，蒸馏水 定容至1000 mUpH值自然； (2) 在PDA平皿上将活化好的白腐菌菌种制成边长8~IOmm菌块，将得到的菌块接入低 氮天冬酰胺-琥珀酸液体培养基中； (3) 按照装液量为IOOmL装瓶，每瓶接种8个菌块，然后在转速200r/min，温度28 °C摇床 中恒温振荡培养7d，制成母液。
【文档编号】C12R1/645GK105886480SQ201610498128
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】尹立伟, 杨春成, 吴甘霖, 孙廷哲, 穆丹, 宋晓贺, 许远, 朱玉, 张玉龙, 池玉杰
【申请人】安庆师范学院