一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用。所述嗜热纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一个新的纤维素酶，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。
【专利说明】
一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。纤维素是一种重要的 多糖，它是植物细胞支撑物质的材料，是自然界最丰富的生物质资源，纤维素的结构确定为 β-D-葡萄糖单元经β -（ 1-4)糖苷键连接而成的直链多聚体，结构中没有分支，其能够被纤 维素酶降解为葡萄糖。
[0003]纤维素酶是指能够水解葡萄糖苷键，将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶 的总称。其对纤维素的水解过程主要包括三步:第一步是内切型纤维素酶作用于纤维素内 部的无定形区，随即水解β -（1-4)糖苷键将纤维素分子截短，随后外切型纤维素酶，作用 于纤维素线状分子末端，水解β -（1-4)糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，最后，葡萄糖 苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。
[0004] 纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工 及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。纤维素酶广泛存 在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。不同的微生物产生的纤维素酶，其结构和功 能差异较大。嗜热纤维素酶与常温纤维素酶相比具有诸多优势，如催化效率高，底物专一性 强，热处理木质纤维素时酶稳定性好，因而对反应体系具有良好的兼容性等。到目前为止， 嗜热纤维素酶多来源于细菌，主要来源海栖热孢菌属、热子囊菌T h e rm 〇 a s c u s aurantiacus)等。然而，高温细菌来源的嗜热纤维素酶表达量低，难以进行工业生产。
[0005] 目前商业化的纤维素酶主要由真菌产生，如木霉、青霉、曲霉等。真菌来源的纤维 素酶最适温度多在4 5到65 °C之间，在高温时容易丧失活性。本发明从嗜热蓝状菌 Talaromyces leycettanus JCM 12802菌株中得到了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤 维素酶具有以下几个优点：嗜热、酸性、广泛的底物特异性、容易发酵生产。所有这些优点都 意味着新发明的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比以前报道的纤维素酶更有应 用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种嗜热、酸性、底物特异性比较广泛的纤维素酶。
[0007] 本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。
[0008] 本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。
[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。
[0010] 本发明的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。
[0011] 本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。
[0012] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的纤维素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1:
[0014] 其中，该酶全长409个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列"MKFSNVILAA SASSLVLA" 。
[0015] 因此，成熟的嗜热纤维素酶的理论分子量为42.5kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：
[0018] 该纤维素酶的最适pH为3.5，在pH2.5-pH5.0范围内，该酶能够维持其60%以上的 酶活力；最适温度80°C，在85°C时依然具有30%的酶活力，在70°C下处理60min，酶活基本不 损失，在75°C下处理5min，能够保持70%以上的酶活力，在80°C下处理2min，能够保持60% 以上的酶活力，具有良好的热稳定性。
[0019] 本发明还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所 示：
[0021]本发明通过PCR的方法分离克隆了这个纤维素酶基因，DNA全序列分析结果表明， 纤维素酶结构基因全长1464bp，含有4个内含子，+96~162，+374~429，+495~551，+650~ 7.3为其内含子序列，cDNA长1230bp，其cDNA序列如SEQIDN0.4所示 ：
[0023]其中，信号肽的碱基序列为：
[0025] 因此，成熟基因的编码序列为
[0026] SEQIDN0.5K*:
[0029] 该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶基因 cDNA序列及推导出的氨基酸序列 在GenBank中进行BLAST比对确定该纤维素酶是一种新的纤维素酶。
[0030] 本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组载体，优选为毕赤酵母表达载体。 将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可 操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将纤维素酶 基因 cDNA插入到质粒pPIC9上的SnaBI和Notl限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于 Α0Π 启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。
[0031] 本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌株。
[0032] 本发明还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：
[0033] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0034] 2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及
[0035] 3)回收并纯化所表达的纤维素酶。
[0036] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将 重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115,得到重组菌株。
[0037] 本发明还提供了上述纤维素酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产纤维素 酶。本发明提供了一个新的纤维素酶，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技 术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。
【附图说明】
[0038]图1纤维素酶在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE分析。
[0039]图2本发明重组纤维素酶的最适pH值。
[0040]图3本发明纤维素酶的pH稳定性。
[0041 ]图4本发明纤维素酶最适反应温度。
[0042]图5本发明纤维素酶热稳定性。
【具体实施方式】
[0043] 试验材料和试剂
[0044] 1、菌株及载体:毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存;毕赤酵母表 达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
[0045] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其 它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0046] 3、培养基：
[0047] (I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆柏，5g//L大麦葡聚糖，5g/L (NH4)S〇4，lg/L KH2P〇4,0.5g/LMgS〇4 · 7H20,0.01g/L FeS〇4 · 7H20,0.2g/L CaCl2于 1L去离 子水中，121°C，15镑条件下灭菌处理20min
[0048] (2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5%酵母提取物、126NaCI，pH7.0)。
[0049] (3 )BMGY 培养基；1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1 · 34 % YNB，0 · 000049〈Biot in，1 % 甘 油(v/v) 〇
[0050] (4)BMMY培养基:除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
[0051] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0052] 实施例1纤维素酶编码基因的克隆
[0053] 提取Talaromyces 1 eycettanus JCM 12802基因组DNA，设计克隆引物F : atgaagttttccaacgtgattcttgcggc和R:ctacaggcactggtagtaataggggttcag，以Talaromyces leycettanus JCM 12802总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95°C5min;94°C30sec， 60°〇3086(：，72 1€6086(3,30个循环，72°(：101^11。得到一约1.51^6?片段，测序正确后获得全长 基因。
[0054] 提取Talaromyces leycettanus JCM 12802总RNA，利用01igo(dT)2〇和反转录酶得 到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的引物F和R，扩增该单链cDNA，获得纤维素酶的 cDNA序列，扩增得到产物回收后送测序。
[0055]通过对纤维素酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该纤维素酶结构基因全长 1464bp，含有4个内含子，cDNA长1230bp，编码409个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基 酸为其信号肽序列，经比对证明从Talaromyces leycettanus JCM12802中分离克隆得到的 编码纤维素酶的基因为新基因。
[0056]实施例2纤维素酶工程菌株的构建 [0057] (1)表达载体的构建及在酵母的表达
[0058]以测序正确的纤维素酶的cDNA为模板，设计合成了带有SnaB I和Not I限制性酶 切位点的弓丨物cdna-sF : acttacgtagctcccaagagcaagaccaagcgcacatc和cdnaR : atagcggccgcctacaggcactggtagtaataggggttcag，对纤维素酶的成熟蛋白的编码区进行扩 增。并利用SnaB I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen，San Diego)，纤维素酶成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形 成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞Transl。阳性转化子进 行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进 行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30 °C培养2-3天，挑取在MD平 板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
[0059]以同样的方式构建含纤维素酶信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。
[0060] (2)高纤维素酶活性转化子的筛选
[0061]用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上， 将MD平板置于30°C培养箱中培养1~2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种 于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30°C、220rpm摇床培养48h;将摇床培养48h的菌液3， 000 X g离心15min，去上清，离心管中再加入lmL含有0 · 5 %甲醇的BMMY培养基，在30 °C、 220rpm诱导培养;诱导培养48h后，3，000 X g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出 高纤维素酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
[0062] 实施例3重组纤维素酶的制备
[0063] (1)纤维素酶基因在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
[0064]筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30°C， 220rpm摇床振荡培养48h; 5，OOOrpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5 % 甲醇的BMMY液体培养基，30°C，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇 溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在〇. 5 %左右；（3) 12，000 X g离心1 Omin，收集上清 发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析(图1)。
[0065] (2)重组纤维素酶的纯化
[0066]收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲 液置换其中的培养基，然后用l〇kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组纤 维素酶，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取重组纤维素酶浓缩液2. OmL经预先用20mM Tris_HCl(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用〇-lmol/L的NaCl进 行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。
[0067]实施例4重组纤维素酶部分性质分析
[0068]采用DNS法对本发明的纤维素酶进行活性分析。具体方法如下:在pH 3.5,80°C条 件下，lmL的反应体系包括100yL适当的稀释酶液，900yL底物，反应lOrnin，加入1.5mL DNS 终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定0D值。纤维素酶活性单位定义:在一定条件下，每 分钟分解羧甲基纤维素生成Uimol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。
[0069] (1)纤维素酶的最适pH及pH稳定性
[0070]经纯化的实施例4表达的纤维素酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。 所用缓冲液为pH 1.0~3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.2~8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓 冲液，pH 8.0~9. OTris-HC缓冲液，1ρΗ9.0~12甘氨酸-NaoH系列缓冲液。纯化的纤维素酶 在不同pH的缓冲体系。80°C下测定的pH适性结果（图2)表明：。该纤维素酶的最适pH为3.5， 在pH2.5-pH5.0范围内，该酶能够维持其60%以上的酶活力。
[0071] 将酶液在不同pH值的缓冲液中于37 °C下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH 稳定性。结果表明（图3)，分析结果表明该酶在pH2.0-pHl 1.0之间稳定，具有优良的pH稳定 性。
[0072] (2)纤维素酶反应最适温度及热稳定性
[0073]纯化的纤维素酶在pH 3.5条件下，测定不同温度(40-90°C )下的酶活性，分析实验 结果表明显示，最适温度80 °C，在85 °C时依然具有30 %的酶活力（图4)，在70 °C下处理 6〇111；[11，酶活基本不损失，在75<€下处理51]1；[11，能够保持70%以上的酶活力，在80 <€下处理 2min，能够保持60%以上的酶活力，具有良好的热稳定性(图5)。
【主权项】
1. 一种嗜热纤维素酶，其特征在于，所述嗜热纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或 SEQ ID NO .2所示。2. -种嗜热纤维素酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的嗜热纤维素酶。3. 根据权利要求2所述的嗜热纤维素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。4. 包含权利要求2所述纤嗜热纤维素酶基因的重组表达载体。5. 包含权利要求2所述纤嗜热纤维素酶基因的重组菌株。6. -种权利要求1所述的嗜热纤维素酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步 骤： 1) 构建包含权利要求2所述纤嗜热纤维素酶基因的重组表达载体； 2) 以获得的重组表达载体转化宿主菌株； 3) 表达并分离权利要求1所述的嗜热纤维素酶。7. 权利要求1所述的嗜热纤维素酶的应用。
【文档编号】C12N9/42GK105886484SQ201610262105
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】姚斌, 罗会颖, 郑菲, 王苑, 苏小运, 柏映国, 黄火清, 王亚茹, 马锐
【申请人】中国农业科学院饲料研究所