一种检测大豆疫霉菌的lamp试剂盒及其专用引物的制作方法

一种检测大豆疫霉菌的lamp试剂盒及其专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物。本发明所提供的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的专用引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。实验证明，本发明提供的一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物能特异性的检测大豆疫霉菌，与其他菌无交叉反应，对大豆疫霉菌的基因组DNA的最小检测限为1.44pg。
【专利说明】
一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用 引物。
【背景技术】
[0002]大豆疫霉菌（Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann)属于藻菌界，卵菌 门，霜霉目，腐霉科，疫霉属。大?疫霉囷吾欢生活在潮湿凉爽的环境中，多数大?疫霉囷株 的菌丝生长最适温度为25~28°C，最高为32~35°C，最低为5°C，其无性繁殖产生游动孢子 的最适温度为20°C，最低温度为5°C，在潮湿有水膜存在时，孢子囊产生大量的游动孢子，游 动孢子游动一段时间后休眠形成休止孢，遇到合适寄主组织，休止孢萌发产生芽管侵入寄 主表皮。
[0003] 大豆疫霉菌可以在大豆的各个生育期为害。在大豆出苗前可以引起种子腐烂、出 苗前腐烂，出苗后可以引起植株枯萎。一般苗期感病植株表现为出苗差、近地表茎部出现水 浸状病斑、叶片变黄萎蔫，严重时植株猝倒死亡。成株期植株受侵染后下部叶片变黄，随后 上部叶片逐渐变黄并很快萎蔫;近地表茎部病斑褐色，并可向上扩展，茎皮层及髓变褐;根 腐烂，根系发育不良；未死亡病株的荚数明显减少，空荚、瘪荚较多，籽粒皱缩。由于在潮湿 条件下，根部侵染的病菌可以产生大量游动孢子，孢子随雨水飞溅，为害茎部和叶片，甚至 出现病荚，其症状为绿色豆荚基部出现水浸状斑，病斑逐渐变褐并从荚柄蔓延至荚尖，最后 整个豆荚呈黄褐色干枯，种子失水干瘪。为此，开展大豆疫霉菌的实验室诊断研究具有重要 意义。目前用于大豆疫霉菌诊断的实验室方法很多，如大豆霉疫菌的分离鉴定和PCR技术的 检测方法，但是其非常耗时且依赖昂贵的检测设备，很难在农业上推广应用。为此，急需建 立一种敏感、准确、快速、简便的大豆疫霉菌实验室诊断方法。虽然基于也已建立，但PCR需 要昂贵的仪器，而且操作繁琐。
[0004] 近年来开发的环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification， LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上4个特异区域的引物和1 个具有链置换特性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等温条件下高效扩增祀基因，灵 敏度和特异性高，该方法已广泛应用于病毒、类病毒、细菌、真菌及转基因的检测，而迄今尚 未应用该技术检测大豆疫霉菌的报道。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决技术问题是如何检测大豆疫霉菌（Phytophthora so jae Kaufmann et Gerdemann)〇
[0006] 本发明首先提供了一种成套引物，由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3 组成，它们均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和 序列5。其中，序列表的序列1由44个核苷酸组成，序列表的序列2由44个核苷酸组成，序列表 的序列3由24个核苷酸组成，序列表的序列4由22个核苷酸组成，序列表的序列5由21个核苷 酸组成。所述成套引物可以对大豆疫霉菌的基因组DNA进行特异性的环介导等温扩增。
[0007] 所述成套引物中，所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF、所述引物F3和所述引 物B3的摩尔比可为8:8:4:1:1。
[0008] 所述成套引物中，各引物的量如下：1·6μπιο1所述引物FIP、1.6ymol所述引物BIP、 0·8μπιο1所述引物LF、0.2ymol所述引物F3、0.2ymol所述引物B3。
[0009] 所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是引物中各种单链DNA摩尔数之和。
[0010] 所述成套引物的用途为如下a)或b)或c)或d):a)制备用于检测或辅助检测大豆疫 霉菌的试剂盒;b)检测或辅助检测待测样品中是否含有大豆疫霉菌;c)制备用于鉴定或辅 助鉴定大豆疫霉菌的试剂盒;d)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。
[0011] 本发明还保护所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d):a)制备用于检测或 辅助检测大豆疫霉菌的试剂盒;b)检测或辅助检测待测样品中是否含有大豆疫霉菌;c)制 备用于鉴定或辅助鉴定大豆疫霉菌的试剂盒;d)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆 疫霉菌。
[0012] 本发明还保护含有所述成套引物的试剂盒。所述试剂盒的用途为如下e)或f):e) 检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌;f)鉴定或辅助鉴定待测菌是 否为候选的大豆疫霉菌。
[0013] 所述试剂盒还可包括Bst DNA聚合酶和/或甜菜碱。
[0014]所述试剂盒还可包括荧光显色剂。
[0015]所述荧光显色剂具体可为钙黄绿素荧光染料。
[0016]所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0017] 所述试剂盒的制备方法可为如下（Ι)、（Π )或（ΙΠ ):
[0018] (I)所述成套引物中各条引物分别单独包装；
[0019] (Π )所述成套引物中各条引物按照所述摩尔比混合在一起；
[0020] (ΙΠ )所述成套引物中各条引物按照所述量混合在一起。
[0021]本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下e)或f):e)检测或辅助检测待测样品中 是否含有或疑似含有大豆疫霉菌;f)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。
[0022] 本发明还提供了一种检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤：
[0023] 提取待测样品的总DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增，然后进行如下评 判:如果所述成套引物可以实现对所述总DNA的环介导等温扩增，则待测样品中含有或疑似 含有大豆疫霉菌;如果所述成套引物不能实现对所述总DNA的环介导等温扩增，则所述待测 样品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0024] 所述"检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法"具体可为方法一，包括如下步 骤:提取待测样品的总DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增，如果浊度曲线呈现为典 型的"S型"、则待测样品中含有或疑似含有大豆疫霉菌，如果浊度曲线呈现为水平直线、则 所述待测样品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0025] 所述"检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法"具体可为方法二，包括如下步 骤:提取待测样品的总DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增(反应体系中含有钙黄绿 素荧光染料），得到待测样品反应液，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应 液为绿色、则待测样品中含有或疑似含有大豆疫霉菌，如果待测样品反应液为橙色、则所述 待测样品中不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0026] 本发明还保护一种鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤：
[0027] 提取待测菌的基因组DNA，以所述成套引物进行转录环介导等温扩增，然后进行如 下评判:如果所述成套引物可以实现对所述基因组DNA的转录环介导等温扩增，则待测菌为 候选的大豆疫霉菌;如果所述成套引物不能实现对所述基因组DNA的转录环介导等温扩增， 则所述待测菌为候选的非大豆疫霉菌。
[0028] 所述"鉴定待测菌是否为大豆疫霉菌的方法"具体可为方法三，包括如下步骤:提 取待测样品的基因组DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增，如果浊度曲线呈现为典型 的"S型"、则待测菌为候选的大豆疫霉菌，如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测菌为 候选的非大豆疫霉菌。
[0029] 所述"鉴定待测菌是否为大豆疫霉菌的方法"具体可为方法四，包括如下步骤:提 取待测样品的基因组DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增(反应体系中含有钙黄绿素 荧光染料），得到待测样品反应液，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液 为绿色、则待测菌为候选的大豆疫霉菌，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测菌为候选 的非大豆疫霉菌。
[0030] 所述钙黄绿素荧光染料可为向31.12mg钙黄绿素（sigma公司产品，产品目录号为 B2346)和197.9mg氯化锰（sigma公司产品，产品目录号为G5468)中加入10mL超纯水得到的 染料。
[0031 ]所述环介导等温扩增可在60-67 °C条件下进行。
[0032]所述环介导等温扩增具体可在65°C条件下进行。
[0033]所述待测样品可为微生物样品。
[0034]所述待测囷可为大?疫霉囷或辣椒疫霉。
[0035]实验证明，本发明提供的一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物能特异 性的检测大豆疫霉菌，而且与其他菌无交叉反应，如辣椒疫霉。本发明提供一种检测大豆疫 霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物对大豆疫霉菌的基因组DNA的最小检测限为1.44pg，比普 通PCR检测方法的灵敏度高10倍。
【附图说明】
[0036] 图1为检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的最佳反应条件的筛选。
[0037] 图2为检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的灵敏度。
[0038] 图3为检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的灵敏度。
[0039] 图4为普通PCR检测大豆疫霉菌的灵敏度。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0041 ]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 下述实施例中大豆疫霉菌（Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann)记载 在如下文献中：宋志刚，郭成亮，赵曙郭等.大豆疫霉菌的分离与鉴定[J].菌物研究，2008.， 公众可从中华人民共和国东港出入境检验检疫局（即
【申请人】处)获得上述材料。
[0044]钙黄绿素荧光染料为向31.12mg钙黄绿素（sigma公司产品，产品目录号为B2346) 和197.9mg氯化锰(sigma公司产品，产品目录号为G5468)中加入10mL超纯水得到的染料。 [0045] Tris · HCl(pH8.8)为上海生科生物科技有限公司产品，产品目录号为ZC12458; Bst DNA聚合酶为NEB公司产品，产品目录号为D4579;甜菜碱为sigma公司产品，产品目录号 为B3813;MgS〇4为国药集团化学试剂有限公司产品，产品目录号为TV25671;dNTP为天根生 化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为SF357898; KC1为国药集团化学试剂有限公司产 品，产品目录号为TV24673 ; (NH4)2S04为国药集团化学试剂有限公司产品，产品目录号为 TV17360; 0 · 1 % Tween20为FLUKA公司产品，产品目录号为Y245C1。
[0046]实施例1、检测大豆疫霉菌的LAMP成套引物的制备
[0047] 本实施例的检测大豆疫霉菌的LAMP成套引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3 和引物B3组成，各条引物均为单链DNA分子，它们的核苷酸序列依次如序列表中的序列1、序 列2、序列3、序列4和序列5所示。
[0048]引物序列如下：
[0049] 弓丨物FIP:5 '-gtccgccaccgatgattcgacgattaatcaaccatcactcaccg-3 '；
[0050] 弓丨物BIP:5 '-ccaacgtgggttcggattggaccttcttgggtactgtgtaccag-3 '；
[0051 ]引物LF:5 ' -gatgtaggatgattggatgaacac-3 ' ；
[0052] 引物F3:5 ' -gcagcgtcctatcacctagtgc-3 ' ；
[0053] 引物B3:5 ' -acggcgtattgagggttgctg-3 '。
[0054] 制备引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3。
[0055] 实施例2、利用检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒检测待测样品
[0056] -、检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的制备
[0057]制备检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒，包括试剂盒C或试剂盒D:
[0058] 试剂盒C为将反应试剂C、空白对照和阳性对照组装在一起得到的产品；
[0059] 试剂盒D为将反应试剂D、空白对照和阳性对照组装在一起得到的产品。
[0060] 其中，所述反应试剂C，包括20mM Tris · HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4， 0.1%Tween20,0.8M甜菜碱，8mM MgS〇4，1.4mM dNTP(每种），8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和 引物BIP各1.6ymol、引物LF 0.8ymol、引物F3和引物B3各0.2ymol，用去离子水补至23yL。
[0061] 所述反应试剂D，包括20mM Tris · HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,0.1% Tween20,0.8M甜菜碱，8mM MgS〇4，1.4mM dNTP(每种），8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和引物 BIP各1.6μπιο1、引物LF 0.8μπιο1、引物F3和引物B3各0.2μπιο1、钙黄绿素荧光染料lyL，用去 离子水补至24yL。
[0062] 所述阳性对照为大豆疫霉菌的基因组DNA，使用时加入2yL。
[0063] 所述空白对照为灭菌超纯水，使用时加入2yL。
[0064]二、利用步骤一制备的试剂盒C确立LAMP扩增最佳反应条件 [0065] 1、提取大豆疫霉菌的基因组DNA，基因组DNA的浓度为7 2ng/yL。
[0066] 2、LAMP
[0067] 具体的检测方法如下：
[0068] 向试管中加入23yL反应试剂C和2yL步骤1提取的大豆疫霉菌的基因组DNA得到反 应液，然后将反应液于60°C反应60分钟。以反应时间为横坐标，浊度仪测量的浊度为纵坐 标，得到浊度曲线。
[0069] 按照上述方法，将60°C替换为61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C或67°C，其它步骤 均不变，得到相应的浊度曲线。
[0070] 结果表明（图1)，所有的浊度曲线均呈现典型的"S型"。可见，LAMP扩增反应条件可 为60°C~67°C、反应eOmiruLAMP扩增最佳反应条件具体可为65°C、反应60min。
[0071 ]三、利用步骤一制备的试剂盒D检测待测样品
[0072] 1、提取大豆疫霉菌的基因组DNA，大豆疫霉菌的基因组DNA的浓度为72ng/yL。
[0073] 2、LAMP
[0074] 具体的检测方法如下：
[0075] (1)向试管中加入24yL反应试剂D加入2yL大豆疫霉菌的基因组DNA得到反应液，然 后将反应液于65°C反应60min。反应结束后，观察反应液的颜色变化。
[0076]按照上述方法，将大豆疫霉菌的基因组DNA替换为灭菌超纯水，其它步骤均不变。 反应结束后，观察反应液的颜色变化。
[0077] (2)结果观察和判定:如果反应液的目测颜色为绿色、则含有或疑似含有大豆疫霉 菌;如果反应液的目测颜色为橙色、则不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0078] 实验结果表明：加入大豆疫霉菌的基因组DNA的试管进行LAMP后，反应液目测颜色 为绿色;而加入灭菌超纯水的试管进行LAMP后，反应液目测颜色为橙色。结果表明，本发明 提供的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒可准确的检测大豆疫霉菌。
[0079]实施例3、实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的特异性
[0080]以实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒C进行特异性实验，实验重复三 次，每次重复的步骤如下：
[0081 ] 1、分别提取大豆疫霉菌的基因组DNA和辣椒疫霉的基因组DNA，大豆疫霉菌的基因 组DNA和辣椒疫霉的基因组DNA的浓度均为50ng/yL。
[0082] 2、向试管中加入23yL反应试剂C和2yL步骤1提取的大豆疫霉菌的基因组DNA或辣 椒疫霉的基因组DNA得到反应液，然后将反应液于65°C反应60分钟。以反应时间为横坐标， 浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊度曲线。
[0083]实验结果表明，加入大豆疫霉菌基因组DNA的试管进行LAMP得到典型的"S型"扩增 曲线，加入辣椒疫霉基因组DNA的试管进行LAMP不能得到典型的"S型"扩增曲线。
[0084] 实施例4、实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的灵敏度
[0085] -、以实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒C进行灵敏度实验，实验重复 三次，每次重复的步骤如下：
[0086] 1、提取大豆疫霉菌的基因组DNA，命名为DNA1，DNA1中DNA浓度为72ng/yL。
[0087] 2、吸取lmL DNA1加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到DNA2;以此类 推制成0嫩3、0嫩4、0嫩5、0嫩6和0嫩7。使用86〇1^1111^-800紫外分光光度计测定稀释后各 个梯度的 DNA 浓度，分别为7 · 2ngAiL、720pg/yL、72pgAiL、7 · 2pg/yL、0 · 72pg/yL和 0 · 072pg/y L〇
[0088] 3、LAMP
[0089] (1)向试管中加入23yL反应试剂C和2yL步骤1制备的DNA1得到反应液，然后将反应 液于65 °C反应60min。以反应时间为横坐标，浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊度曲线。
[0090] 按照上述方法，将DNA1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7 和灭菌超纯水，其它步骤均不变，得到相应的浊度曲线。
[0091] (2)结果观察和判定：如果浊度曲线呈现典型的"S型"、则待测样品中含有或疑似 含有大豆疫霉菌;如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有或疑似不含有大 ?疫霉囷。
[0092] 实验结果见图2，向反应试剂C中加入DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5或DNA6进行LAMP 均得到典型的"S型"扩增曲线，而向反应试剂C中加入DNA7或灭菌超纯水进行LAMP得到的扩 增曲线均为水平的直线。
[0093] 二、以实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒D进行灵敏度实验，实验重复 三次，每次重复的步骤如下：
[0094] 1、同步骤一中1。
[0095] 2、同步骤一中2。
[0096] 3、LAMP
[0097] 具体的检测方法如下：
[0098] (1)向试管中加入24yL反应试剂D加入2yL DNA1得到反应液，然后将反应液于65°C 反应60min。反应结束后，观察反应液的颜色变化。
[0099] 按照上述方法，将DNA 1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7 和灭菌超纯水，其它步骤均不变。反应结束后，观察反应液的颜色变化。
[0100] (2)结果观察和判定:如果反应液的目测颜色为绿色、则含有或疑似含有大豆疫霉 菌;如果反应液的目测颜色为橙色、则不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0101] 实验结果见图 3 (1 为DNA1，2为DNA2，3为DNA3，4为DNA4，5为DNA5，6为DNA6，7为 DNA7,8为灭菌超纯水）。只有加入DNA7或灭菌超纯水的试管进行LAMP后，反应液为橙色。
[0102] 结果表明，本发明提供的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒C和试剂盒D对大豆疫霉菌 基因组DNA的最小检测限为1.44pg。
[0103] 三、普通PCR检测大豆疫霉菌基因组DNA的灵敏度实验
[0104] 实验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0105] 1、同步骤一中1。
[0106] 2、同步骤一中2。
[0107] 3、以 2yL DNA1 为模板，以F : 5 '-GCGTATTGAGGGTTGCTG-3 ' 和B : 5 '-GCGTCCTATCACCTAGTGC-3 '为引物，进行PCR，得到PCR扩增产物。
[0108] 按照上述方法，将DNA 1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7 和灭菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。
[0109] 4、结果观察和判定:如果PCR扩增产物含有203bp的DNA片段、则含有或疑似含有大 豆疫霉菌；如果PCR扩增产物不含有203bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。 所述203bp的DNA片段如序列表中序列6所示。
[0110] 实验结果见图4 (1 为DNA1，2为DNA2，3为DNA3，4为DNA4，5为DNA5，6为DNA6，7为 DNA7,8为灭菌超纯水）。以0嫩1、0嫩2、0嫩3、0嫩4或0嫩5为模板获得的？0財广增产物中含有 203bp的DNA片段，以DNA6、DNA7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有203bp的 DNA片段。可见，普通PCR对大豆疫霉菌基因组DNA的最小检测限为14.4pg。
【主权项】
1. 一种成套引物，由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3组成，各条引物均为单 链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。2. 如权利要求1所述成套引物，其特征在于:所述成套引物中，所述引物FIP、所述引物 BIP、所述引物LF、所述引物F3和所述引物B3的摩尔比为8:8:4:1:1。3. 如权利要求2所述成套引物，其特征在于:所述成套引物中，各引物的量如下：1.6μ mol所述引物FIP、1.6ymol所述引物ΒΙΡ、0.8μπιο1所述引物LF、0.2ymol所述引物F3、0.2ymol 所述引物B3。4. 权利要求1至3中任一所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d): a) 制备用于检测或辅助检测大豆疫霉菌的试剂盒； b) 检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌； c) 制备用于鉴定或辅助鉴定大豆疫霉菌的试剂盒； d) 鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。5. 含有权利要求1至3中任一所述成套引物的试剂盒。6. 权利要求5所述试剂盒的制备方法，为如下（I)、（Π )或(ΙΠ ): (I)所述成套引物中各条引物分别单独包装； (Π )所述成套引物中各条引物按照权利要求2所述比例混合在一起； (ΙΠ )所述成套引物中各条引物按照权利要求3所述量混合在一起。7. 权利要求5所述试剂盒的应用，为如下e)或f): e) 检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌； f) 鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。8. -种检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤： 提取待测样品的总DNA，以权利要求1至3中任一所述成套引物进行环介导等温扩增，然 后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总DNA的环介导等温扩增，则待测样品 中含有或疑似含有大豆疫霉菌;如果所述成套引物不能实现对所述总DNA的环介导等温扩 增，则所述待测样品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。9. 如权利要求4或7所述的应用，或，权利要求8所述的方法，其特征在于:所述待测样品 为微生物样品。10. -种鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤： 提取待测菌的基因组DNA，以权利要求1至3中任一所述成套引物进行环介导等温扩增， 然后进行如下评判:如果所述成套引物可以实现对所述基因组DNA的环介导等温扩增，则待 测菌为候选的大豆疫霉菌；如果所述成套引物不能实现对所述基因组DNA的环介导等温扩 增，则所述待测菌为候选的非大豆疫霉菌。
【文档编号】C12Q1/68GK105886499SQ201610064023
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年1月29日
【发明人】于杰, 李辉, 李献刚, 邢颖新, 李雪梅, 薛春生, 李奉京
【申请人】中华人民共和国东港出入境检验检疫局, 北京蓝谱生物技术开发有限公司