基因、表达载体、宿主细胞及其应用，高产玉米黄质的重组菌株的构建方法
【专利摘要】本发明涉及为微生物发酵领域，特别涉及基因、表达载体、宿主细胞及其应用，高产玉米黄质的重组菌株的构建方法。本发明公开了一种生产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)，其命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SyBE_Sc0123Z020，简称SyBE_Sc0123Z020及其构建方法。本发明的重组酿酒酵母菌株相对于现有技术更为环保、成本低廉，为玉米黄质的生产提供了一种可行的方法。CGMCC No.1206820160119
【专利说明】
基因、表达载体、宿主细胞及其应用，高产玉米黄质的重组菌 株的构建方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及为微生物发酵领域，特别涉及基因、表达载体、宿主细胞及其应用，高 产玉米黄质的重组菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002] 类胡萝卜素是一类在众多生物中具有多种生理和营养功能的萜类色素。类胡萝卜素 具有多种生物功能，尤其在保护人类健康方面起着重要的作用，如它们是合成维生素 A的前 体，能够增强人体免疫力和具有防癌抗癌的功效。玉米黄质(Zeaxanthin，3，3 ' -二羟基-β-胡萝卜素，C40H5602，分子量为566.88)，亦称玉米黄素，是带有羟基的橘红色的类胡萝卜素， 具有极强的抗氧化能力，同时又是一种保健食品添加剂，并且对眼睛有保护作用，在预防白 内障、心血管疾病、癌症等方面具有重要的作用，作为天然功能性添加剂，逐渐被广大消费 者所熟知和青睐。
[0003] 玉米黄质的制备主要依赖植物提取、化学合成和微生物合成。玉米黄质虽然广泛 存在于绿色叶类蔬菜、花卉、水果、枸杞和黄玉米中，然而植物并不能最为提供玉米黄质的 主要来源，因为其高昂的生产方法造成较低的收益率。化学合成的玉米黄质虽然可以商业 化生产，但由于其较低的品质只能作为颜料而不能用作食品添加剂或药物。因此，微生物合 成则以低成本、高产量和产品安全性被认为是最有前途的生产方法。
[0004] 目前，在微生物合成玉米黄质的研究中，所采用的宿主主要集中于微藻、海洋细菌 和大肠杆菌。2013年，迪肯大学Dilip Singh等表征了一株从新西兰海洋水域新分离出的可 以生产玉米黄质的小球藻，通过优化发酵及提取条件，得到最高产量为11.32mg/g(细胞干 重）。2012年，朱拉隆功大学Patcharee Thawornwiriyanun等从泰国海湾的海绵中分离出一 株可以产玉米黄质的海洋细菌，通过优化发酵温度与pH得到玉米黄质最高产量为4.9mg/g。 2013年，￥6116口〇5^大学311(1113^11311?抑131111等从印度沿海沙滩分离出一株可以产玉米黄质 的海洋细菌，通过添加〇. 1M谷氨酸得到玉米黄质最高产量为1.47mg/g<32007年，庆应义塾大 学Tomoko Nishizaki等发现重排玉米黄质生物合成代谢路径中的关键基因的顺序会对玉 米黄质产量产生不同的影响，当基因顺序与代谢路径相同时，得到一株玉米黄质最高产量 为0.82mg/g(细胞干重）的大肠杆菌。2015年，中山大学刘建忠等通过整合成团泛菌来源的 轻化酶，得到一株11.95mg/g (细胞干重)玉米黄质的大肠杆菌。
[0005] 酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，遗传背景清楚、基因操作简单、可进行大规 模发酵生产。相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用药用和饲料酵母;相 比藻类，它的生长周期更短且更易培养。因此，实现玉米黄质在酿酒酵母中的高产将会在类 胡萝卜素产业化上展现极大的竞争力。然而，截止目前公开报道的利用酿酒酵母合成玉米黄 质的报道很少，2012年，赵慧民等通过整合木糖利用途径及玉米黄质的代谢路径，得到一株 可以直接利用木糖生产0.74mg±0.02mg/L玉米黄质的菌株。同年，赵慧民等通过将组成型 启动子换成诱导型启动子，虽然玉米黄质的产量相对于组成型启动子提高了 50倍，但是相 比于玉米黄质在大肠杆菌、微藻及海洋细菌中的产量，玉米黄质在酿酒酵母中的产量仍相 对较低。因此，亟待开发高产玉米黄质的重组酿酒酵母。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种生产玉米黄质的重 组酿酒酵母菌株的构建方法。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了基因，其具有：
[0009] (I)如SEQ ID No.l~SEQ ID Νο·9所示的核苷酸序列;或
[0010] (II)如SEQIDNo.l~SEQIDNo.9所示的核苷酸序列的互补序列；或
[0011] (III)与（I)或（II)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与 (I) 或（II)的核苷酸序列不同的序列;或
[0012] (IV)与（I)或（II)或（III)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0013] 在本发明的一些具体提实施方案中，所述基因具有与（I)或（II)或（III)或（IV)所 示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（I)或 (II) 或（III)或（IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0014] 在本发明的一些具体提实施方案中，所述基因的核苷酸序列经取代、缺失或添加 一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列中所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9 个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24 个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。
[0015]本发明还提供了所述的基因在高产玉米黄质中的应用。
[0016] 本发明还提供了 一种表达载体，包括所述的基因。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，所述的表达载体敲除了FPP的竞争路径基因。
[0018] 在本发明的一些具体实施方案中，所述的表达载体中所述FPP的竞争路径基因选 自Lppl或Dppl。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述的表达载体还包括调控功能基因 crtz表达 强度的表达盒。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述的表达载体中所述表达盒包括
[0021] (I)启动子;和/或 [0022] (II)所述的基因；和/或
[0023] (III)DRURADR营养标签、ty4左同源臂、ty4右同源臂;和/或
[0024] (IV)DRURADR营养标签、YPL062W左同源臂、YPL062W右同源臂和所述的基因。
[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，所述的表达载体整合的所述表达盒中所述启动 子选自GAL1启动子、GAL3启动子或GAL7启动子。
[0026] 本发明还提供了所述的表达载体转化获得的宿主细胞。
[0027] 在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞选自酵母、藻类、霉菌或细菌。
[0028] 在本发明的一些具体实施方案中，所述酵母选自酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维 属酵母;所述霉菌选自链霉菌;所述细菌选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
[0029]在本发明的一些具体实施方案中，所述酿酒酵母选自CEN.PK系列或BY系列。
[0030] 在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为重组酿酒酵母菌株，保藏编号 为CGMCC No.12068。
[0031] 本发明还提供了所述的表达载体或所述的宿主细胞在高产玉米黄质中的应用。 [0032]本发明还提供了一种高产玉米黄质的重组菌株的构建方法，整合所述的基因。 [0033]在本发明的一些具体实施方案中，所述构建方法还包括敲除FPP的竞争路径基因 的步骤。
[0034]在本发明的一些具体实施方案中，所述构建方法中所述FPP的竞争路径基因选自 Lppl或Dppl〇
[0035] 在本发明的一些具体实施方案中，所述构建方法还包括整合调控功能基因 crtz表 达强度的表达盒的步骤。
[0036] 在本发明的一些具体实施方案中，所述构建方法中整合的所述表达盒包括
[0037] (I)启动子;和/或 [0038] (11)所述的基因；和/或
[0039] (III)DRURADR营养标签、ty4左同源臂、ty4右同源臂;和/或
[0040] (IV)DRURADR营养标签、YPL062W左同源臂、YPL062W右同源臂和所述的基因。
[0041]在本发明的一些具体实施方案中，所述构建方法整合的所述表达盒中所述启动子 选自GAL1启动子、GAL3启动子或GAL7启动子。
[0042]本发明还提供了一种生产玉米黄质的发酵方法，以所述的宿主细胞或所述的构建 方法获得的重组菌株为发酵菌株。
[0043]本发明的利用重组酿酒酵母菌株生产玉米黄质的方法相对于植物提取、化学合成 成本更为低廉，且对环境友好，极显著提高了玉米黄质的产量，为玉米黄质的生产提供了一 种切实可行的方法，并为下游藏红花酸及藏红花素及虾青素的生物合成打下基础。
[0044] 生物保藏说明
[0045] 菌株SyBE_Sc0123Z020:分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae于2016年 01月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12068。
【附图说明】
[0046] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0047] 图1示利用重组酿酒酵母合成玉米黄质的路径图；
[0048]图2示整合质粒构建过程图；
[0049] 图3示基因表达盒构建过程图；
[0050] 图4示敲除盒构建过程图；
[0051 ]图5示重组菌株9个来源的玉米黄质摇瓶产量比较图；
[0052]图6示FPP旁路基因敲除摇瓶发酵玉米黄质产量曲线图；对照为SyBE_sC0123Z003;
[0053] 图7示增加基因拷贝数摇瓶发酵玉米黄质产量比较图；对照为SyBE_sC〇123Z014;
[0054] 图8示图5中对照的HPLC图；其中，①示产β-胡萝卜素的酿酒酵母;②示玉米黄质标 准品；③示整合EucrtZ的酿酒酵母；
[0055]图9示质粒酶切验证验证胶图；
[0056] 图10(a)示验证9种来源的羟化酶整合至ho位点，图10(b)示SyBE_Sc0123Z003的 URA标签已经敲除成功;对照是SyBE_Sc0014CY06;
[0057]图 11对照为 SyBE_Sc0123Z010,使用引物 Lppl-F，Lppl-R 和 Dppl-F，Dppl-R 验证 SyBE_Sc0123Z011、SyBE_Sc0123Z012分别敲除Lppl、Dppl;使用引物Lppl-F，Lppl-R和Dppl-F，Dppl-R 验证 SyBE_Sc0123Z013 在 SyBE_Sc0123Z011 基础上 URA 敲除成功；使用引物 Lppl-F， Lpp 1-R 和 Dpp 1-F，Dpp 1-R 验证SyBE_ScO 123Z014在SyBE_ScO 123Z013 基础上敲除Dpp 1;使用 引物 Lppl-F，Lppl-R 和 Dppl-F，Dppl-R 验证 SyBE_Sc0123Z015 在 SyBE_Sc0123Z014 基础上 URA 敲除成功；
[0058] 图12(a)分别验证GAL 1、GAL3、GAL7启动子羟化酶整合至ty4位点，对照是Syffi_ Sc0123Z015;图12(b)验证SyBE_Sc0123Z019在SyBE_Sc0123Z018基础上敲除URA，SyBE_ Sc0123Z020在SyBE_Sc0123Z019基础上整合羟化酶至YPL062W位点。
【具体实施方式】
[0059]本发明公开了基因、表达载体、宿主细胞及其应用，高产玉米黄质的重组菌株的构 建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应 用本发明技术。
[0060]本发明的目的是提供一株高产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株。
[0061 ]本发明的技术方案概述如下：
[0062] 一种生产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：（1)一株高产 胡萝卜素的重组酿酒酵母为底盘菌株，选取9种不同来源的且经酿酒酵母密码子优化的合 成玉米黄质的功能基因 crtz，经模块化设计整合至优化的酿酒酵母基因组上，通过摇瓶发 酵筛选合成玉米黄质最优的外源功能基因 crtz; (2)继续优化宿主细胞，敲除FPP的竞争路 径基因 Lppl和Dppl，实现玉米黄质的产量的提高；（3)调控功能基因 crtz的表达强度，实现 玉米黄质的高产。
[0063] -株高产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株，其命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) SyBE_ScO 123Z020，简称SyBE_ScO 123Z020，保藏号（CGMCC No · 12068) 〇 [0064]本发明所述菌株在生产玉米黄质中的应用。
[0065]本发明的优点:本发明的利用重组酿酒酵母菌株生产玉米黄质的方法相对于植物 提取、化学合成成本更为低廉，且对环境友好，为玉米黄质的生产提供了一种切实可行的方 法，并为下游藏红花酸及藏红花素及虾青素的生物合成打下基础。
[0066]本发明提供的基因、表达载体、宿主细胞及其应用，高产玉米黄质的重组菌株的构 建方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0067]下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0068]实施例1合成玉米黄质外源功能基因的来源筛选
[0069] 本发明的生产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株的初步构建方法如下：
[0070] 1、原始菌株的获得，
[0071] 2、外源功能基、因元件的获得
[0072]外源基因包括用于合成玉米黄质的β_胡萝卜素羟化酶基因 crtZ:选取9种不同来源 的功能基因筛选合成玉米黄质最优的基因来源，其中crtZ的来源包括水生副球菌 (Agrobacterium aurantiacum)、产喊杆菌（A1 caligenessp. strain PC-1)，欧文氏菌 (Erwiniauredovora)、成团泛菌（Pantoea agglomerans)、玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii )、硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus P2)、短波单胞菌（Brevundimonas sp · SD212)、短波单胞菌（Brevundimonasvesicularis DC263 )、雨生红球藻 (Haematococcuspluvialis)依次简写为Aa crtZ(核苷酸序列如SEQ ID No.l所不）、As crtZ(核苷酸序列如SEQIDNo.2所示）、EucrtZ(核苷酸序列如SEQIDNo.3所示）、PacrtZ (核苷酸序列如SEQIDNo·4所示）、PscrtZ(核苷酸序列如SEQIDNo·5所示）、SscrtZ(核 苷酸序列如SEQIDNo.6所示）、B.SD212crtZ(核苷酸序列如SEQIDNo.7所示）、B.DC263 crtZ(核苷酸序列如SEQIDNo.8所示）、HpcrtZ(核苷酸序列如SEQIDNo.9所示）。上述基 因均为经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因两端额外添加 5 ' 端gcggccgcggtctcca; 3 ' taaaggagaccgcggccgc通过人工合成得到 〇 [0073] 3、模块化整合质粒的构建
[0074]模块一的构建:将GAL1启动子、HIS5t终止子通过0E-PCR方法拼接起来，得到两端 包含Xbal和Smal酶切位点，且在GAL1启动子和HIS5t终止子之间包含两个BsmBI酶切位点的 片段PGALi-T HIS5t;同时，构建含DRURADR营养标签的ho左、右同源臂的ho整合质粒，PCR扩增ho 左同源臂、DRURADR、ho右同源臂，并通过0E-PCR的方法顺次拼接，得到两端包含Pmel酶切位 点、且在ho左同源臂与DRURADR、ho右同源臂之间包含Xba I和Sma頂每切位点的片段，然后与 平末端载体pJETl · 2连接得到ho整合质粒pJETl · 2_ho leftarm-DRURADR-ho rightarm。之 后将片段PGALl-THIS5t通过Xbal和Smal酶切位点进行连接，得到整合质粒pJET1.2-ho leftarm-PGALi-THis5t-DRURADR_ho rightarm。然后将9种不同来源的人工合成的crtz与整合 质粒pJETl. 2-h〇-PGALi-THis5t-DRURADR通过BsmBI酶切位点进行连接，得到9种整合质粒，统 计为pJETl.2_ho leftarm-PGALi-CrtZ-THis5fDRURADR-ho rightarm。
[0075]上述构建的模块一整合质粒分别转化入大肠杆菌感受态DH5a中，菌落PCR筛选，提 质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。 [0076] 4、模块化整合构建生产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株
[0077]首先，将9种模块一整合质粒用Pmel酶切位点切割，获得9种模块一整合片段ho leftarm-PGALi-crtz-THis5t-DRURADR-ho rightarm，采用醋酸锂法将9种片段单独转化高产 胡萝卜素酵母菌株SyBE_Sc0014C012,通过ho左、右同源序列与酵母基因组上ho位点发生 重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/ L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2 %的琼脂粉） 进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的 重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0123Z001、SyBE_Sc0123Z002、SyBE_ Sc0123Z003、SyBE_Sc0123Z004、SyBE_Sc0123Z005、SyBE_Sc0123Z006、SyBE_Sc0123Z007、 SyBE_Sc0123Z008和SyBE_Sc0123Z009。其中，SyBE_Sc0123Z001:SyBE_Sc0014C012，ho :: PcALi-Aa CrtZ-THis5t-DRURADR、SyBE_ScO 123Z002: SyBE_ScOO 14C012，ho : : PcALi-AsCrtZ-THis5t-DRURADR、SyBE_ScO 123Z003: SyBE_ScOO 14C012，ho: : PGALi-EuCrtZ-THisst-DRURADR、 SyBE_Sc0123Z004：SyBE_Sc0014C012,ho： ：PGALi-PaCrtZ-THis5t-DRURADR^SyBE_Sc0123Z005： SyBE_Sc0014C012，ho: :PGALi-PsCrtZ-THis5t-DRURADR、SyBE_Sc0123Z006:SyBE_Sc0014C012， ho： ：PGALi-SsCrtZ-THis5t-DRURADR^SyBE_Sc0123Z007：SyBE_Sc0014C012,ho： ：Pgali-B.SD212CrtZ-THis5t-DRURADR、SyBE_Sc0123Z008:SyBE_Sc0014C012，ho ::PGALi-B.DC263CrtZ-THis5t-DRURADR、SyBE_Sc0123Z009:SyBE_Sc0014C012，ho: :PGALi-HpCrtZ-THisst-DRURADR、
[0078] 5、比较菌株SyBE_Sc0123Z001-SyBE_Sc0123Z009的玉米黄质摇瓶产量
[0079] 试验材料：菌株 SyBE_ScO 123Z001 -SyBE_ScO 123Z009。
[0080] 试验方法：
[0081 ]种子培养基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、1 Og/L酵母浸粉；
[0082]发酵培养基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
[0083] 将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30°C、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓 度0D6QQ = 0.1分别接种于50mL发酵培养基中，于30°C、250rpm条件下培养，监测发酵过程中 的菌体密度(0D600)及玉米黄质产量。
[0084]玉米黄质定量方法:取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将 其中一份菌体置于80°C烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方 法为：用3 N H C1重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2 m i η，然后立即冰浴3 m i η ;将破碎的细胞 12000rpm、4°C离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并祸旋5min;最后离心收集丙酮相，用 2μηι滤膜过滤后上紫外液相检测，玉米黄质检测波长为4 5 Onm。
[0085]试验结果：发酵培养基中D-半乳糖为诱导剂，负责开启GAL1和GAL10启动子的转 录。初始培养基中因有葡萄糖存在，GAL启动子的转录受到葡萄糖抑制;随着发酵的进行，葡 萄糖迅速被消耗，发酵13h左右葡萄糖耗尽，葡萄糖抑制效应解除，D-半乳糖开启GAL启动子 的转录，从而逐渐积累番茄红素。
[0086] 结果见表1。
[0087] 表1试验结果
[0089] 由图5及表1显示，菌株SyBE_Sc0123Z001-SyBE_Sc0123Z009的玉米黄质产量来看， 发酵72h，EucrtZ的产量最高，达到29.5mg/L。由此可知，寻求最优的基因来源，对于高效转 化β-胡萝卜素至玉米黄质有着积极的意义。
[0090]实施例2敲除FPP旁路基因的重组酿酒酵母的优化构建 [0091 ] 1、单敲酿酒酵母菌株的构建
[0092]以酿酒酵母SyBE_Sc0123Z003为出发菌株，构建单基因敲除菌株
[0093] SyBE_Sc0123Z003, ALPP1: :DRURADR，SyBE_Sc0123Z003, ADPP1: :DRURADR。具体 过程如下：首先构建Δ LPP1: :DRURADR敲除盒，以酵母SyBE_Sc0123Z003基因组为模板，设计 上、下游引物PCR扩增带LPP1上、下游300bp同源臂，以质粒LDL01为模板，设计上、下游引物 PCR扩增带DRURADR营养标签片段，之后将LPP1上游片段、DRURADR、LPP1下游片段通过0E-PCR连接起来，得到两端包含Notl酶切位点的片段，然后与pRS415K通过Notl酶切位点连接， 得到Δ LPP1:: DRURADR敲除盒。同时构建Δ DPP1::DRURADR敲除盒，以酵母SyBE_Sc0123Z003 基因组为模板，设计上、下游引物PCR扩增带DPP1上、下游300bp同源臂，以质粒LDL01为模 板，设计上、下游引物PCR扩增带DRURADR营养标签片段，之后将DPP1上游片段、DRURADR、 DPP1下游片段通过0E-PCR连接起来，得到两端包含Notl酶切位点的片段，然后与pRS415K通 过Notl酶切位点连接，得到 ADPP1: :DRURADR敲除盒。将 ALPP1: :DRURADR、ADPP1:: DRURADR敲除盒分别用Notl酶切位点切割，得到敲除片段Δ LPP1: : DRURADR和Δ DPP1:: DRURADR，之后利用酵母自身的同源重组机制将这两个片段通过醋酸锂法酵母转化整合到 酵母基因组上，转化后酵母采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡 萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2 %的琼脂粉)进行 筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组 菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0123Z011、SyBE_Sc0123Z012。
[0094] 2、双敲酿酒酵母菌株的构建
[0095]以酿酒酵母SyBE_Sc0123Z011为出发菌株，用YH)液体培养基培养后取少许菌液涂 布5-氟乳清酸(5-F0A)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR 序列间自发重组而删除URA基因的正确菌株，将该正确菌株命名为SyBE_Sc0123Z013。将Δ DPP1::DRURADR敲除盒用Notl酶切位点切害Μ导到敲除片段ADPP1 ::DRURADR，之后利用酵 母自身的同源重组机制将这个片段通过醋酸锂法酵母转化整合到酵母基因组上，转化后酵 母采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮 氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2 %的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行 划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别 命名为 SyBE_Sc0123Z014
[0096] 3、比较菌株 SyBE_Sc0123Z011、SyBE_Sc0123Z012 和 SyBE_Sc0123Z014 的玉米黄质 摇瓶产量
[0097] 试验材料：菌株SyBE_Sc0123Z003、SyBE_Sc0123Z011、SyBE_Sc0123Z012和 SyBE_ Sc0123Z014
[0098] 试验方法:与实施例1完全相同。
[0099] 试验结果：发酵培养基中D-半乳糖为诱导剂，负责开启GAL1和GAL10启动子的转 录。初始培养基中因有葡萄糖存在，GAL启动子的转录受到葡萄糖抑制;随着发酵的进行，葡 萄糖迅速被消耗，发酵13h左右葡萄糖耗尽，葡萄糖抑制效应解除，D-半乳糖开启GAL启动子 的转录，从而逐渐积累玉米黄质。
[0100] 结果见表2。
[0101] 表2试验结果
[0103] 由图 6及表 2 显示，菌株SyBE_Sc0123Z003、SyBE_Sc0123Z011、SyBE_Sc0123Z012 和 SyBE_Sc0123Z014的玉米黄质产量来看，发酵72h，双敲的产量最高，达到36.8mg/L。由此可 知，敲除玉米黄质生物合成代谢路径中的旁路基因，对于高效转化β-胡萝卜素至玉米黄质有 着积极的意义。
[0104] 实施例3调控β-胡萝卜素羟化酶的表达强度的重组酿酒酵母的优化构建
[0105] 1、模块化整合质粒的优化构建
[0106] 模块二的构建:将GAL1启动子、HIS5t终止子通过0E-PCR方法拼接起来，得到两端 包含Xbal和Smal酶切位点，且在GAL1启动子和HIS5t终止子之间包含两个BsmBI酶切位点的 片段P GAL1-THIS5t;同时，构建含DRURADR营养标签的ty4左、右同源臂的ty4整合质粒，PCR扩增 ty4左同源臂、DRURADR、ty4右同源臂，并通过0E-PCR的方法顺次拼接，得到两端包含Pmel酶 切位点、且在ty4左同源臂与DRURADR、ty4右同源臂之间包含Xba I和Sma I酶切位点的片段， 然后与平末端载体PJET1.2连接得到ty4整合质粒pJETl. 2-ty4 lef tarm-DRURADR-ty4 1481^31'1]1。之后将片段？(^1-1'[11551;通过乂&31和311^1酶切位点进行连接，得到整合质粒 p JET 1 · 2_ty4 1 ef tarm-PGALi-THis5t_DRURADR-ty4r i ghtarm。然后将欧文氏菌来源的人工合 成的EuCrtZ与整合质粒
[0107] pJETl · 2-ty41eftarm-PGALi-THis5fDRURADR-ty4rightarm通过BsmBI酶切位点进行 连接，得到整合质粒pJETl · 2-ty41eftarm_PGALi-Eu CrtZ_THis5f DRURADR-ty4rightarm〇
[0108] 模块三的构建:将GAL3启动子、HIS5t终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端 包含Xbal和Smal酶切位点，且在GAL3启动子和HIS5t终止子之间包含两个BsmBI酶切位点的 片段P GAL3-THIS5t;同时，构建含DRURADR营养标签的ty4左、右同源臂的ty4整合质粒，PCR扩增 ty4左同源臂、DRURADR、ty4右同源臂，并通过0E-PCR的方法顺次拼接，得到两端包含Pmel酶 切位点、且在ty4左同源臂与DRURADR、ty4右同源臂之间包含Xba I和Sma I酶切位点的片段， 然后与平末端载体PJET1 · 2连接得到ty4整合质粒pJETl · 2-ty41ef tarm-DRURADR-ty4rightarm。之后将片段Pgal3-This5i；通过Xbal和Smal酶切位点进行连接，得到整合质粒 p JET 1 · 2_ty4 1 ef tarm-PGAL3-THis5t_DRURADR-ty4r i ghtarm。然后将欧文氏菌来源的人工合 成的EuCrtZ与整合质粒pJETl · 2-ty41eftarm-PGALi-THis5fDRURADR-ty4rightarm通过BsmBI 酶切位点进行连接，得到整合质粒pJETl · 2_ty41ef tarm-PGAL3_Eu CrtZ-THis5t_DRURADR-ty4rightarm〇
[0109] 模块四的构建:将GAL7启动子、HI S5t终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端 包含Xbal和Smal酶切位点，且在GAL7启动子和HIS5t终止子之间包含两个BsmBI酶切位点的 片段PGAL7-THIS5t;同时，构建含DRURADR营养标签的ty4左、右同源臂的ty4整合质粒，PCR扩增 ty4左同源臂、DRURADR、ty4右同源臂，并通过OE-PCR的方法顺次拼接，得到两端包含Pmel酶 切位点、且在ty4左同源臂与DRURADR、ty4右同源臂之间包含Xba I和Sma I酶切位点的片段， 然后与平末端载体PJET1 · 2连接得到ty4整合质粒pJETl · 2-ty41ef tarm-DRURADR-ty4rightarm。之后将片段PGAL7_THis5t通过Xbal和Smal酶切位点进行连接，得到整合质粒 p JET 1 · 2_ty4 1 ef tarm-PGAL7-THis5t_DRURADR-ty4r i ghtarm。然后将欧文氏菌来源的人工合 成的EuCrtZ与整合质粒pJETl · 2_ty41ef tarm-PGALi-THis5f DRURADR_ty4rightarm通过BsmBI 酶切位点进行连接，得到整合质粒pJETl · 2_ty41ef tarm-PGAL7_Eu CrtZ-THis5t_DRURADR-ty4rightarm〇
[0110] 模块五的构建:将GAL1启动子、HIS5t终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端 包含Xbal和Smal酶切位点，且在GAL1启动子和HIS5t终止子之间包含两个BsmBI酶切位点的 片段Pgali-Thisr;同时，构建含DRURADR营养标签的YPL062W左、右同源臂的YPL062W整合质 粒，PCR扩增YPL062W左同源臂、DRURADR、YPL062W右同源臂，并通过0E-PCR的方法顺次拼接， 得到两端包含Pme I酶切位点、且在YPL062W左同源臂与DRURADR、YPL062W右同源臂之间包含 Xbal和Smal酶切位点的片段，然后与平末端载体pJETl. 2连接得到YPL062W整合质粒 pJETl .2-YPL062W leftarm-DRURADR-YPL062W rightarm。之后将片段PGALi-THis5t通过Xbal 和Smal酶切位点进行连接，得到整合质粒pJETl. 2-YPL062W leftarm-PGALi-THis5t-DRURADR-YPL062Wrightarm。然后将欧文氏菌来源的人工合成的EuCrtZ与整合质粒pJETl. 2-YPL062W leftarm-PGALi-THis5fDRURADR-YPL062W rightarm通过BsmBI酶切位点进行连接，得到整合 质粒pJETl .2-YPL062W leftarm-PGALi-Eu CrtZ-THis5t-DRURADR-YPL062W rightarm。
[0111] 上述构建的模块整合质粒分别转化入大肠杆菌感受态DH5a中，菌落PCR筛选，提质 粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。2、 模块化整合优化构建高产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株
[0112] 首先，将重组菌株SyBE_Sc0123Z014用YH)液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟 乳清酸(5-F0A)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间 自发重组而删除URA基因的正确菌株，将该正确菌株命名为SyBE_Sc0123Z015。然后，将模块 二、三和四整合质粒用Pme頂每切位点切割，分别获得模块的整合片段ty41eftarm-P GAL1-Eu CrtZ-THis5t-DRURADR-ty4rightarm, ty41 ef tarm-PGAL3-Eu CrtZ-THisst-DRURADR-ty4rightarm，ty41eftarm_PGAL7-Eu CrtZ-THis5fDRURADR_ty4rightarm。米用醋酸裡法将上 述三个片段分别转化重组酵母菌株SyBE_Sc0123Z015,通过ty4左、右同源序列发生重组而 插入到基因组上ty4位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固 体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合 氨基酸粉末2g/L，2%的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基 因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0123Z016、 SyBE_Sc0123Z017 和 SyBE_Sc0123Z018。同时对验证正确的重组菌株 SyBE_Sc0123Z016 用 YPD 液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-F0A)固体板，挑取单菌落分纯培养后提 取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA基因的正确菌株，将该正确菌 株命名为 SyBE_Sc0123Z019。
[0113] 然后，将模块五整合质粒用Pmel酶切位点切割，获得片段YPL062W leftarm-PGAL1- Eu CrtZ-THis5t-DRURADR-YPL062W rightarm，采用醋酸锂法将该片段转化上述重组酵母菌 株SyBE_ScO 123Z019，通过YPL062W左、右同源序列与酵母基因组上YPL062W位点发生重组而 整合到基因组上。转化后酵母采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L， 葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2%的琼脂粉)进 行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重 组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc0123Z020,保藏编号为CGMCC No.12068。
[0114] 模块酶切验证信息：
[0115] 表3本专利所涉及的质粒及酶切验证方法
[0116]
[0117]
[0118] 质粒酶切验证胶图见图9。
[0119] 重组酿酒酵母的PCR验证：
[0120] 表4本专利所涉及的菌株及PCR验证所用引物
[0121]
[0122] 图10(a)验证9种来源的羟化酶整合至ho位点，对照是SyBE_Sc0014CY06;图10(b) 验证SyBE_Sc0123Z003的URA敲除成功，及羟化酶存在。
[0123] 图 11对照为 SyBE_Sc0123Z010,使用引物 Lppl-F，Lppl-R 和 Dppl-F，Dppl-R 验证 SyBE_Sc0123Z011、SyBE_Sc0123Z012分别敲除Lppl、Dppl;使用引物Lppl-F，Lppl-R和Dppl-F，Dppl-R 验证 SyBE_Sc0123Z013 在 SyBE_Sc0123Z011 基础上 URA 敲除成功；使用引物 Lppl-F， Lpp 1-R 和 Dpp 1-F，Dpp 1-R 验证SyBE_ScO 123Z014在SyBE_ScO 123Z013 基础上敲除Dpp 1;使用 引物 Lppl-F，Lppl-R 和 Dppl-F，Dppl-R 验证 SyBE_Sc0123Z015 在 SyBE_Sc0123Z014 基础上 URA 敲除成功。
[0124] 图12(a)分别验证GAL 1、GAL3、GAL7启动子羟化酶整合至ty4位点，对照是Syffi_ Sc0123Z015;图12(b)验证SyBE_Sc0123Z019在SyBE_Sc0123Z018基础上敲除URA，SyBE_ Sc0123Z020在SyBE_Sc0123Z019基础上整合羟化酶至YPL062W位点。
[0125] 3、比较菌株SyBE_Sc0123Z014、SyBE_Sc0123Z016、SyBE_Sc0123Z017、SyBE_ Sc0123Z018和SyBE_Sc0123Z020的玉米黄质摇瓶产量
[0126] 试验材料：菌株 SyBE_Sc0123Z014、SyBE_Sc0123Z016、SyBE_Sc0123Z017、SyBE_ Sc0123Z018和SyBE_Sc0123Z020。
[0127] 试验方法:与实施例1完全相同。
[0128] 试验结果：发酵培养基中D-半乳糖为诱导剂，负责开启GAL1和GAL10启动子的转 录。初始培养基中因有葡萄糖存在，GAL启动子的转录受到葡萄糖抑制;随着发酵的进行，葡 萄糖迅速被消耗，发酵13h左右葡萄糖耗尽，葡萄糖抑制效应解除，D-半乳糖开启GAL启动子 的转录，从而逐渐积累玉米黄质。
[0129] 结果见表5。
[0130] 表5实验结果
[0132] 由图7及表5显示，菌株SyBE_Sc0123Z014、SyBE_Sc0123Z016、SyBE_Sc0123Z017、 SyBE_Sc0123Z018和SyBE_Sc0123Z020的玉米黄质产量来看，发酵72h，0-胡萝卜素羟化酶三 个拷贝的产量最高，达到96.2mg/L。由此可知，通过增强功能基因 crtZ的表达强度，对于高 效转化β-胡萝卜素至玉米黄质有着积极的意义。
[0133] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 基因，其特征在于，其具有： (I) 如SEQ ID No.l~SEQ ID Νο·9所示的核苷酸序列；或 (II) 如SEQ ID No.1~SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的互补序列；或 (III) 与（I)或（II)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（I)或 (I I)的核苷酸序列不同的序列;或 (IV) 与（I)或(II)或(III)所述序列至少有80%同源性的序列。2. 根据权利要求1所述的基因，其特征在于，具有与（I)或（II)或（III)或（IV)所示的核 苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（I)或（II)或 (III)或（IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8 个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23 个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。4. 权利要求1至3任一项所述的基因在高产玉米黄质中的应用。5. -种表达载体，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的基因。6. 根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，敲除FPP的竞争路径基因。7. 根据权利要求5或6所述的表达载体，其特征在于，所述FPP的竞争路径基因选自Lppl 或Dppl〇8. 根据权利要求5至7任一项所述的表达载体，其特征在于，还包括调控功能基因 crtz 表达强度的表达盒。9. 根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达盒包括 (I) 启动子;和/或 (II) 如权利要求1至3任一项所述的基因；和/或 (I II )DRURADR营养标签、ty4左同源臂、ty4右同源臂;和/或 (IV)DRURADR营养标签、YPL062W左同源臂、YPL062W右同源臂和如权利要求1至3任一项 所述的基因。10. 根据权利要求8或9所述的表达载体，其特征在于，所述表达盒中所述启动子选自 GALl启动子、GAL3启动子或GAL7启动子。11. 根据权利要求5至10任一项所述的表达载体转化获得的宿主细胞。12. 根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自酵母、藻类、霉菌 或细菌。13. 根据权利要求10至12任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述酵母选自酿酒酵 母、解脂属酵母或克鲁维属酵母;所述霉菌选自链霉菌;所述细菌选自大肠杆菌、枯草芽孢 杆菌。14. 根据权利要求10至13任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述酿酒酵母选自 CEN. PK系列或BY系列。15. 根据权利要求10至14任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为重组酿 酒酵母菌株，保藏编号为CGMCC No. 12068。16. 根据利要5至10任一项所述的表达载体或权利要求10至15任一项所述的宿主细胞 在高产玉米黄质中的应用。17. -种高产玉米黄质的重组菌株的构建方法，其特征在于，整合如权利要求1至3任一 项所述的基因。18. 根据权利要求17所述的构建方法，其特征在于，还包括敲除FPP的竞争路径基因的 步骤。19. 根据权利要求18所述的构建方法，其特征在于，所述FPP的竞争路径基因选自Lppl 或Dppl〇20. 根据权利要求17至19任一项所述的构建方法，其特征在于，还包括整合调控功能基 因 crtz表达强度的表达盒的步骤。21. 根据权利要求20所述的构建方法，其特征在于，所述表达盒包括 (I) 启动子;和/或 (II) 如权利要求1至3任一项所述的基因；和/或 (I II )DRURADR营养标签、ty4左同源臂、ty4右同源臂;和/或 (IV)DRURADR营养标签、YPL062W左同源臂、YPL062W右同源臂和如权利要求1至3任一项 所述的基因。22. 根据权利要求20或21所述的构建方法，其特征在于，所述表达盒中所述启动子选自 GALl启动子、GAL3启动子或GAL7启动子。23. -种生产玉米黄质的发酵方法，其特征在于，以如权利要求10至15任一项所述的宿 主细胞或如权利要求17至22任一项所述的构建方法获得的重组菌株为发酵菌株。
【文档编号】C12N15/81GK105886518SQ201610307158
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】肖文海, 梅雪昂, 陈艳, 王颖, 李霞, 元英进
【申请人】天津大学