表达猪传染性胃肠炎病毒s蛋白的重组枯草芽孢杆菌的制作方法

文档序号:10528735阅读:775来源:国知局
表达猪传染性胃肠炎病毒s蛋白的重组枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组枯草芽孢杆菌,属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白重组枯草芽孢杆菌整合表达质粒pIncotGSR,并成功电击转化入枯草芽孢杆菌WB800。经Western-blot验证猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在重组枯草芽孢杆菌内可以被成功表达。口服免疫可以刺激一月龄仔猪机体产生有效的TGEV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌有望开发成预防猪传染性胃肠炎的基因工程口服疫苗。
【专利说明】
表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组枯草芽孢杆菌 一、
技术领域
[0001] 本发明涉及表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组枯草芽孢杆菌,属于生物技术 基因工程领域。具体包括:猪传染性胃肠炎病毒S蛋白整合表达性质粒plncotGSR的构建, 猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的表达与鉴定以及重组枯草芽孢杆菌可以刺激一月龄仔猪机 体产生有效的TGEV特异性免疫应答水平。 二、
【背景技术】
[0002] 1.猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)主要结构蛋白之一-S蛋白(S)
[0003] 猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由猪传染 性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)引起的一种高度 接触性肠道传染病,以引起2周龄以内仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率(可达100% ) 为主要特征。TGEV属冠状病毒科冠状病毒属,是一种多形态有囊膜的病毒。病毒粒子呈圆 形、椭圆形或多边形,直径为90~200nm病毒囊膜由双层脂质组成,在脂质双层中穿插有 三种蛋白:纤突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、和小囊膜蛋白(sM蛋白)。S糖蛋白部分 突出于病毒粒子表面,形成典型的花瓣状突起,长20nm,使整个病毒粒子在电镜下观察像皇 冠状。编码S糖蛋白的基因长度为4344bp,最初合成的S蛋白前体由1447(Purder株)或 1449 (Miller株)个氨基酸残基组成。切除16个起分泌信号肤作用的疏水性氨基酸残基 后,多肤链还有1431个(Miller株为1433个)氨基酸残基,分子量约为158kD ;富含甘露糖 的碳水化合物侧链经修饰后,加到S蛋白的N糖基化位点上(共32-34个位点)上,形成胞 内EZ蛋白,分子量为175kD ;EZ蛋白在胞内高尔基复合体中再一次糖基化,成为成熟蛋白, 分子量为200kD。S糖蛋白可分为以下几个区域:膜外区、跨膜区、膜内区。其中膜外功能区 主要形成S蛋白的冠状突起的成分,在其羧基端1/5-1/4处形成8nm双股α螺旋结构。S 蛋白的膜外区上分布有该蛋白的主要抗原位点,宿主细胞氨肽酶受体(ΡΑΡΝ)的识别位点, 以及一段DRTRG序列(为退化的切割位点)。跨膜区及膜内区位于S蛋白C 一末端,其中有 大约20个氨基酸残基的疏水片段使S蛋白固定于脂膜中;由约35个氨基酸残基组成的中 间区域分为两个部分:半胱氨酸残基含量比率高(约50%)的部分可能是酯酰化位点,另 一较小的疏水区可能嵌入病毒粒子内部。S蛋白主要有以下5方面的作用:①携带主要的Β 淋巴细胞抗原决定簇,是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白;②含 有宿主细胞氨肽酶受体(ΡΑΡΝ)的识别位点,在决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用;③决 定TGEV的致病性;④具有细胞膜融合作用,使病毒核衣壳进入细胞浆;⑤决定TEGV的血凝 作用。
[0004] 早在1979年研究发现,S糖蛋白可提供免疫保护作用。Jimenez等通过放射免疫 分析进一步证实,S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇,是唯一能诱导产生中和抗 体和提供免疫保护作用的结构蛋白。Gebauer等通过单克隆抗体竞争试验确定了 S糖蛋白 存在3种层次的抗原结构,即抗原位点(sites)、抗原亚位点(subsities)和抗原决定簇 (epitoes),S蛋白共有11个抗原决定簇,其中5个是与中和抗体产生相关的重要抗原决定 簇。S蛋白的抗原位点包括A、B、C、D四个位点,A、D位点在诱导产生中和抗体中起着主要 作用,在S基因中若编码A、D位点的序列缺失,则其表达产物不能诱导机体产生中和抗体。 因此S基因成为TGEV基因工程疫苗研究的首选抗原基因,目前已在多种不同的表达系统中 对S蛋白进行了表达并对其免疫原性进行了研究。近年来,国内外大量学者,通过腺病毒、 杆状病毒、大肠杆菌等成功表达过TGEV的S蛋白,而且表达的蛋白具有良好的免疫原性,却 因为提纯蛋白方法过于繁琐或者表达基因的大小受到限制等大大限制了 S蛋白在疫苗中 应用。
[0005] 2.枯草芽孢杆菌对黏膜免疫的影响
[0006] 目前对黏膜抗原的细菌递送载体,尤其是能够入侵或者定植在黏膜上皮细胞的细 菌,已有广泛研究。活细菌载体的种类很多,应用比较广泛的包括两类:一类为弱毒病原体 能够诱导强而持久的免疫应答,如沙门氏菌和李斯特菌,但这些减毒细菌做为载体传递疫 苗存在潜在的危险性,甚至是致病性。另一类是目前较为关注的安全无致病性的共生物种, 如乳球菌、乳杆菌和枯草芽孢杆菌等益生菌。枯草芽孢杆菌作为一种安全的无致病性活细 菌载体,是广泛存在于土壤和植物中的优势生物种群,隶属于芽孢杆菌科、芽孢杆菌属,其 细胞呈直杆状,大小(0.8~1.2) μ mX (1.5~4.0) μ m,单个,革兰氏染色阳性,着色均匀, 无荚膜,能运动。枯草杆菌作为抗原的载体具有很多优点:①是人类和动物安全纪录的益生 菌和食品添加剂,②成本低廉、耐热、抗干燥、便于运输和使用,③其遗传性状和细菌学水平 都很容易操纵。因此,枯草芽孢杆菌非常适宜作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原递 送载体。同时枯草芽孢杆菌作为抗原递送载体可以诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答,这 引起了研究者们极大的兴趣。这对于开发新型口服疫苗,提供了广阔的空间。
[0007] 3. 口服黏膜免疫研究进展
[0008] 口服黏膜免疫方法简便、安全,不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答,还 可引起全身性体液免疫应答,多年来受到国内外免疫学家的密切关注。目前儿童广泛口服 的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰质炎口服疫苗的应用,使 全球小儿麻痹发病得到有效控制,为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用。但是在实践 中,口服疫苗经过消化道时常受到消化液的降解,疫苗很容易被破坏,影响免疫力的效果, 使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制。近年来疫苗递送系统成为研究传染病防御 领域新技术的热点之一。尤其是细菌活载体疫苗因具有培养方便,外源基因容量大,刺激细 胞免疫力强等优点具有巨大的应用潜力。细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向, 所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者 共生菌中,让其表达所编码的抗原,以期达到预防一种或多种疾病的目的。通过活菌载体递 送疫苗抗原不仅可刺激肠道局部免疫应答,又可针对特异性抗原产生特异性免疫应答,使 机体可以获得全面的保护力。
[0009] 以前的研究表明一些减毒细菌可作为疫苗抗原的载体,如沙门氏菌、弱毒李斯特 菌等。国外学者以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功表达了 lacZ基因、绿色荧光蛋 白(GFP)基因、HIV-gpl40基因、李斯特菌溶血素基因等。沙门氏菌为载体传递DNA疫苗还 能存在潜在危险性。首先,减毒细菌可能存在毒力返强的危险;其次,质粒DNA可能会整合 到宿主细胞基因组,从而引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、 体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。此外,减毒细菌对一些老弱病残个体可能有潜在致病 性。因此,选择理想的疫苗抗原载体是建立生物学新技术的关键。理想的输送抗原的载体 应该是能够在体内较长时间存在,本身对机体既安全又能产生持续免疫力的一些微生物。
[0010] 随着以益生菌为活载体传递抗原,刺激肠道黏膜免疫这一技术路线的提出,本发 明试图在益生菌枯草芽孢杆菌中表达TGEV的S蛋白进行活菌的口服免疫。对研制猪传染性 胃肠炎口服疫苗,为预防猪传染性胃肠炎开辟一条全新的黏膜免疫途径具有重要的意义。 三、
【发明内容】

[0011] 技术问题
[0012] 本发明成功构建了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白重组型枯草芽孢杆菌整合表达质 粒plncotGSR,并转化进入枯草芽孢杆菌WB800。猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在重组枯草 芽孢杆菌WB800内可以被成功表达,并通过口服免疫可以刺激一月龄仔猪机体产生有效的 TGEV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌WB800有望开发成预防猪传染性胃肠炎的基 因工程口服疫苗。
[0013] 技术方案
[0014] 本发明涉及表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白重组枯草芽孢杆菌,该重组枯草芽孢 杆菌WB800菌株,属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。检测一月龄仔猪口服免疫该重 组枯草芽孢杆菌WB800菌株机体产生有效的TGEV特异性免疫应答水平。
[0015] 1其整合表达载体质粒构建方法包括:
[0016] 1. 1枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆
[0017] 参照已发表的枯草芽孢杆菌的amyE序列(GenBank登陆号:NZ_CM000487. 1),设计 一对扩增amyE5的引物,并在上、下游引物5端分别引入Nhel、Hindlll酶切位点(下划线 为酶切位点),引物序列如下:
[0018] PI:GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT
[0019] P2 :AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG
[0020] 设-Η对扩增amyE 3的引物,并在上、下游引物5端分别引入Kpnl、Xhol酶切位 点(下划线为酶切位点),引物序列如下:
[0021] P3 :GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC
[0022] P4 :CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA
[0023] 以枯草芽孢杆菌WB800提取的基因组DNA为模板,用合成的Pl、P2引物PCR扩增 amyE 5及P3、P4引物扩增amyE 3序列,PCR反应体系均为50 μ L,amyE 5PCR反应条件: 95。(:预变性511^11,951€3〇86。,691€3〇86。,72。(:111^11,30。7。168,72。(:1〇11^11,4。(:1〇11^11 ; amyE 3PCR 反应条件为 95°C 预变性 5min;95°C 30sec,69°C 30sec,72°C lmin,30cycles, 72°C 10min,4。°C lOmin,将PCR产物连接到pMDT-19载体上,构建的载体分别命名为T-amyE 5和T-amyE 3。测序后获得具有枯草芽孢杆菌amyE 5端的DNA序列SEQ ID NO. 1和具有 枯草芽孢杆菌amyE 3端的DNA序列SEQ ID NO. 2。
[0024] 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆
[0025] 参照已发表的硫酸卡那霉素抗性基因序列(GenBank登陆号:EU549779. 1)设计一 对扩增Kaf的引物,并在上游引物5端引入Kpnl、Hindlll酶切位点,下游引物5端引入 ΚρηΙ酶切位点(下划线为酶切位点),引物序列如下:
[0026] P5 :GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT
[0027] P6 :GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA
[0028] 以pMK3质粒为模板进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L,PCR反应条件:95°C预 变性 5min,95°C 30sec,7rC 30sec,72°C IminJOcycles,?〗!: 10min,4°C lOmin ;将 PCR 产 物连接到PMD19-T载体上,构建的载体命名为T-Kan%测序后获得具有完整编码区的硫酸卡 那霉素抗性基因序列SEQ ID NO. 3。
[0029] 1. 3枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因的克隆
[0030] 参照已发表的枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因序列(GenBank登陆号:NZ_ CM000487. 1)设计一对扩增被膜蛋白G基因 cotG的引物,并在上游引物5端引入与枯草芽 孢杆菌amyE 5 3'末端15bp的同源臂序列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下划线为 酶切位点);下游引物5端引入与S蛋白基因5'末端10bp的同源臂序列,两序列之间引入 Nhel酶切位点(下划线为酶切位点),引物序列如下:
[0031] P7 :ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC
[0032] P8 :GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC
[0033] 以枯草芽孢杆菌提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L, PCR 反应条件:95°C 预变性 5min,95°C 30sec,71°C 30sec,72°C lmin 12sec,30cycles, 72°C 10min,4°C lOmin ;将PCR产物连接到pMD19-T载体上,构建的载体命名为T-cotG,测 序后获得具有完整编码区的枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因序列SEQ ID N0. 4。
[0034] 1. 4猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因的克隆
[0035] 参照已发表的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列(GenBank登陆号:KP202848) 设计一对扩增S蛋白基因 cDNA的引物,在上游引物引入与枯草芽孢杆菌cotG 3'末端12bp 的同源臂序列,两序列之间引入Nhel酶切位点(下划线为酶切位点);在下游引物引入与 红色荧光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下 划线为酶切位点),引物序列如下:
[0036] P9 :AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG
[0037] P10 :GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA
[0038] 以猪传染性胃肠炎病毒SHXB毒株(猪传染性胃肠炎病毒强毒株)提取的总RNA 为模板,经MLV-反转录酶合成cDNA第一链后进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L,PCR 反应条件:95°C 预变性 5min,95°C 30sec,67°C 30sec,72°C ^indOcyclesJSt: 10min, 4°C lOmin ;将PCR产物连接到pMD19-T载体上,构建的载体命名为T-S,测序后获得具有完 整编码区的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列SEQ ID N0. 5。
[0039] 1· 5红色灰光蛋白基因的克隆
[0040] 参照已发表的红色荧光蛋白基因序列(GenBank登陆号:ΑΒ166761. 1)设计一对扩 增红色荧光蛋白基因 RFP的引物,在上游引物引入与S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序 列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下划线为酶切位点);在下游引物引入与枯草芽孢 杆菌amyE 35'末端12bp的同源臂序列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下划线为酶 切位点),引物序列如下:
[0041] Pll:GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC
[0042] P12 :GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG
[0043] 以pDsRed-monomer-Nl质粒为模板进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L,PCR反 应条件:95。(:预变性5111丨11,951€3〇86。,721€3〇86。,72 1€48 86。,30。7。168,72。(:1〇11^11, 4°C lOmin ;将PCR产物连接到pMD19-T载体上,构建的载体命名为T-RFP,测序后获得具有 完整编码区的红色荧光蛋白基因序列SEQ ID N0. 6。
[0044] 1. 6整合表达载体骨架plnAmyE的构建
[0045] 利用酶切连接技术,分别将SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID N0. 3序列和SEQ ID N0. 2 序列克隆至载体p⑶NA3. 1上,获得整合表达骨架载体plnAmyE。采用限制性内切酶Nhel、 HindIII、KpnI和Xhol,分别用双酶切验证。
[0046] 1. 7整合表达载体plncotGSR的构建
[0047] 以SEQ ID N0. 4序列、SEQ ID N0. 5序列和SEQ ID N0. 6序列为模板,用引物P7、 P12进行重叠 PCR扩增,PCR反应体系为50 μ L,PCR反应条件:95°C预变性5min,95°C 30sec, 72°C 30sec,72°C 5min,30cycles,72°C 10min,4°C lOmin ;将 PCR 产物回收,并使用 One Step Cloning Kit定点克隆试剂盒克隆至载体骨架plnAmyE上,测序后获得整合表达载体 plncotGSR。
[0048] 2电转化枯草芽孢杆菌WB800菌株,属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
[0049] 将构建的整合表达质粒plncotGSR采用电击转化的方法,取60 μ L枯草芽孢杆菌 WB800电转化感受态细胞与1 μ L(50ng/ μ L)整合表达载体plncotGSR质粒混合加入电击杯 中冰浴5min后进行电击,电击条件:22KV/cm,25 μ F,200 Ω,电击一次。加入lmL电击恢复 液,37°C lOOrprn孵育3h,涂布于硫酸卡那霉素抗性固体基础培养基LB平板,14-18h可见阳 性菌落。将重组枯草芽孢杆菌WB800,进行PCR和Western-blot验证,并且进行共聚焦显微 镜观察。
[0050] 3检测口服免疫该重组枯草芽孢杆菌WB800菌株机体产生的TGEV特异性免疫应答 水平
[0051] 空枯草芽孢杆菌WB800菌株(基因组中未整合外源基因)和表达猪传染性胃 肠炎病毒S蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800菌株分别口服免疫一月龄仔猪,口服剂量为 1 X lO^fu/kg,首免一周后按相同剂量进行二免,每周进行血清和粪便的采集,饲养周期为 五周。采用间接ELISA的方法进行TGEV特异性IgG和特异性SIgA水平变化检测。检测方 法为:猪传染性胃肠炎抗原包被过夜,1% BSA(牛血清白蛋白)37°C封闭2h,洗涤后加待检 样品37°C作用lh,洗涤加适当稀释后的辣根过氧化物酶标兔抗猪IgG或IgA抗体,37°C lh, 含四甲基联苯胺和H202的TMB显色液显色后酶标仪检测0D450。
[0052] 有益效果
[0053] 1本试验构建的整合表达质粒plncotGSR是目前国内外第一个猪传染性胃肠炎病 毒S蛋白重组枯草芽孢杆菌表达质粒。
[0054] 2本发明成功构建了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白重组型枯草芽孢杆菌整合表达质 粒plncotGSR,并转化进入枯草芽孢杆菌WB800。经Western-blot验证猪传染性胃肠炎病 毒S蛋白在重组枯草芽孢杆菌WB800内可以被成功表达。并通过口服免疫可以刺激一月龄 仔猪机体产生有效的TGEV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌WB800有望开发成预 防猪传染性胃肠炎的基因工程口服疫苗。
[0055] 3本发明构建了枯草芽孢杆菌递送表达系统,可插入各种抗原、活性肽和药物等, 有利于开发各种重组枯草芽孢杆菌疫苗,为枯草芽孢杆菌在动物黏膜免疫以及口服基因工 程活疫苗等方面的研究奠定基础。下面结合附图及具体实施技术对本发明做进一步说明。 四、
【附图说明】:
[0056] 图1 :枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 5端基因 amyE 5、枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 3端基 因 amyE3和硫酸卡那霉素抗性基因 Kaf的PCR扩增结果凝胶电泳图
[0057] 图2 :枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因 cotG的PCR扩增结果凝胶电泳图
[0058] 图3 :猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因 S的PCR扩增结果凝胶电泳图
[0059] 图4 :红色荧光蛋白基因 RFP的PCR扩增结果凝胶电泳图
[0060] 图5 :构建的整合表达骨架质粒plnAmyE示意图
[0061] 图6 :构建的整合表达载体质粒plncotGSR示意图
[0062] 图7 :整合表达骨架质粒plnAmyE酶切验证电泳图
[0063] 图8 :整合表达载体质粒plncotGSR酶切验证电泳图
[0064] 图9 :重组枯草芽孢杆菌WB800基因组PCR验证电泳图
[0065] 图10 :重组枯草芽孢杆菌WB800表达产物Western-blot (免疫印迹图)
[0066] 图11 :重组枯草芽孢杆菌WB800共聚焦观察图
[0067] 图12 :重组枯草芽孢杆菌WB800对TGEV特异性IgG水平变化的影响图
[0068] 图13 :重组枯草芽孢杆菌WB800对TGEV特异性SIgA水平变化的影响图 五、
【具体实施方式】
[0069] 1整合表达质粒plncotGSR的构建
[0070] 下述实施例中所用方法如无特别说明,均为常规方法。具体涉及的材料和试剂 如下:枯草芽孢杆菌WB800菌株由南京农业大学植物保护学院高学文惠赠,文献见:Wu, Η·,Wang,S.,Qiao, J.,Liu,J.,Zhan,J.,Gao, X.,2009. Expression of HpaGxooc protein in Bacillus subtilis and its biological functions. Journal of microbiology and biotechnology 19,194-203;
[0071] 猪传染性胃肠炎病毒SHXB毒株由江苏省农科院兽医所何孔旺惠赠,文献 见:Weiwei,H.,Qinghua,Y.,Liqi,Z.,Haofei,L.,Shanshan,Z.,Qi,G.,Kongwang, H.,Qian,Y. 2014. Complete genomic sequence of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus SHXB isolated in China. Archives of virology 159, 2295-2302 ;
[0072] E. coli JM109、质粒 pDsRed-monomer-Nl (购自 Takara);质粒 pMK3、pCDNA3. 1 (购 自 Life Technologies);
[0073] 试剂:Q5 高保真酶购自 NEB 公司;pMD19_T 载体,Agarose Gel DNA Purification Kit,限制性内切酶,T4连接酶等均购自Takara公司;硫酸卡那霉素,氨苄青霉素,细菌基因 组提取试剂盒,病毒RNA提取试剂盒等均购自OMEGA公司;试剂MLV-反转录酶购自Promega 公司;One Step Cloning Kit定点克隆试剂盒购自Vazyme公司;辣根过氧化物酶标兔抗猪 IgG和IgA抗体购自BETHYL公司;含四甲基联苯胺和H202的TMB显色液购自TIANGEN公司。
[0074] 1. 1枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆
[0075] 参照已发表的枯草芽孢杆菌的amyE序列(GenBank登陆号:NZ_CM000487. 1),设计 一对扩增amyE 5的引物,并在上、下游引物5端分别引入NheI、HindIII酶切位点(下划线 为酶切位点),引物序列如下:
[0076] PI:GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT
[0077] P2 :AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG
[0078] 设-Η对扩增amyE 3的引物,并在上、下游引物5端分别引入Kpnl、Xhol酶切位 点(下划线为酶切位点),引物序列如下:
[0079] P3 :GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC
[0080] P4 :CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA
[0081] 以枯草芽孢杆菌WB800提取的DNA为模板,分别用合成的Pl、P2和P3、P4引物常 规PCR克隆枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 5端和3端。如图1可知:1为PCR成功克隆llOObp 的amyE 5 ;2为PCR成功克隆1170bp的amyE 3。切取目的条带,经DNA纯化试剂盒回收后, 连接到PMD19-T载体上,构建的载体分别命名为T-amyE 5和T-amyE 3,经菌落PCR及酶切 验证后测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与GenBank上已发表的序列比对。所克隆 的枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 5端和3端序列与已经在GenBank上发表的序列的同源性为 100%〇
[0082] 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆
[0083] 参照已发表的硫酸卡那霉素抗性基因序列(GenBank登陆号:EU549779. 1)设计一 对扩增Kaf的引物,并在上游引物5端引入Kpnl、Hindlll酶切位点,下游引物5端引入 ΚρηΙ酶切位点(下划线为酶切位点),引物序列如下:
[0084] Ρ5 :GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT
[0085] P6 : GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA
[0086] 以pMK3质粒为模板,用合成的P5、P6引物常规PCR克隆硫酸卡那霉素抗性基因。 如图1可知:3为PCR成功克隆193bp的Kaf。切取目的条带,经DNA纯化试剂盒回收后, 连接到PMD19-T载体上,构建的载体命名为T-Kan%经菌落PCR及酶切验证后测序。所获得 的序列经BLAST及DNAstar与GenBank上已发表的序列比对。所克隆的硫酸卡那霉素抗性 基因序列与已经在GenBank上发表的序列的同源性为100%。
[0087] 1. 3枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因的克隆
[0088] 参照已发表的枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因序列(GenBank登陆号:NZ_ CM000487. 1)设计一对扩增被膜蛋白G基因 cotG的引物,并在上游引物5端引入与枯草芽 孢杆菌amyE53'末端15bp的同源臂序列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下划线为 酶切位点);下游引物5端引入与S蛋白基因5'末端10bp的同源臂序列,两序列之间引入 Nhel酶切位点(下划线为酶切位点),引物序列如下:
[0089] P7 :ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC
[0090] P8 :GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC
[0091] 以枯草芽孢杆菌提取的DNA为模板,用合成的P7、P8引物常规PCR克隆枯草芽孢 杆菌被膜蛋白G基因。如图2:可知PCR成功克隆1218bp的cotG。切取目的条带,经DNA 纯化试剂盒回收后,连接到PMD19-T载体上,构建的载体命名为T-cotG,经菌落PCR及酶切 验证后测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与GenBank上已发表的序列比对。所克隆 的枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因序列与已经在GenBank上发表的序列的同源性为100%。
[0092] 1. 4猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因的克隆
[0093] 参照已发表的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列(GenBank登陆号:KP202848) 设计一对扩增S蛋白基因 cDNA的引物,在上游引物引入与枯草芽孢杆菌cotG 3'末端12bp 的同源臂序列,两序列之间引入Nhel酶切位点(下划线为酶切位点);在下游引物引入与 红色荧光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下 划线为酶切位点),引物序列如下:
[0094] P9 :AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG
[0095] P10 :GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA
[0096] 以猪传染性胃肠炎病毒SHXB毒株提取的总RNA为模板,经MLV-反转录酶合成 cDNA第一链;以cDNA为模板,用合成的P9、P10引物常规PCR克隆猪传染性胃肠炎病毒S 蛋白基因。如图3:可知PCR成功克隆4344bp的S。切取目的条带,经DNA纯化试剂盒回收 后,连接到PMD19-T载体上,构建的载体命名为T-S,经菌落PCR及酶切验证后测序。所获得 的序列经BLAST及DNAstar与GenBank上已发表的序列比对。所克隆的猪传染性胃肠炎 病毒S蛋白基因序列与已经在GenBank上发表的序列的同源性为100%
[0097] 1. 5红色灰光蛋白基因的克隆
[0098] 参照已发表的红色荧光蛋白基因序列(GenBank登陆号:AB166761. 1)设计一对扩 增红色荧光蛋白基因 RFP的引物,在上游引物引入与S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序 列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下划线为酶切位点);在下游引物引入与枯草芽孢 杆菌amyE 35'末端12bp的同源臂序列,两序列之间引入Hindlll酶切位点(下划线为酶 切位点),引物序列如下:
[0099] Pll:GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC
[0100] P12 :GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG
[0101] 以pDsRed-monomer-Nl质粒为模板,用合成的Pll、P12引物常规PCR克隆红色荧 光蛋白基因。如图4:可知PCR成功克隆678bp的RFP。切取目的条带,经DNA纯化试剂盒 回收后,连接到PMD19-T载体上,构建的载体命名为T-RFP,经菌落PCR及酶切验证后测序。 所获得的序列经BLAST及DNAstar与GenBank上已发表的序列比对。所克隆的红色荧光蛋 白基因序列与已经在GenBank上发表的序列的同源性为100%。
[0102] 1. 6重组表达载体骨架plnAmyE的构建
[0103] 将枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 5端、硫酸卡那霉素抗性基因和枯草芽孢杆菌解淀粉 酶E3端利用酶切连接技术依次克隆至载体p⑶NA3. 1上,获得整合表达载体骨架plnAmyE。
[0104] 1. 7重组表达载体plncotGSR的构建
[0105] 将plnAmyE用限制性核酸内切酶Hindlll进行单酶切,并回收;枯草芽孢杆菌被 膜蛋白G基因、猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因和红色荧光蛋白基因进行重叠 PCR后,使用 One Step Cloning Kit定点克隆试剂盒克隆至整合表达载体骨架plnAmyE上,获得整合表 达载体 plncotGSR。
[0106] 1. 8整合表达载体骨架plnAmyE的验证
[0107] 采用限制性核酸内切酶NheI、HindIII、KpnI和Xhol,分别用双酶切验证整合表达 载体骨架PlnAmyE。如图7可知:1为整合表达载体骨架plnAmyE,经Nhel和Hindlll双酶 切得到llOObp上游整合位点amyE 5 ;2为整合表达载体骨架plnAmyE,经Hindlll和ΚρηΙ 双酶切得到930bp筛选基因 Kan1^为整合表达载体骨架plnAmyE,经ΚρηΙ和Xhol双酶切 得到1170bp下游整合位点amyE 3。
[0108] 1. 9整合表达载体plncotGSR的验证
[0109] 采用限制性核酸内切酶Hindlll酶切验证整合表达载体plncotGSR。如图8可知: 1、2、3为整合表达载体plncotGSR经HindllI酶切得到6252bp枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基 因、猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因和红色荧光蛋白基因融合片段。
[0110] 2重组猪传染性胃肠炎病毒S蛋白枯草芽孢杆菌WB800的验证
[0111] 将构建的整合表达质粒PlncotGSR采用电击转化的方法,取60 μ L枯草芽孢杆菌 WB800电转化感受态细胞与1 μ L(50ng/μ L)整合表达载体plncotGSR质粒混合加入电击 杯中冰浴5min后进行电击(型号:BTX ECM630),电击条件:22KV/cm,25 μ F,200 Ω,电击一 次。加入lmL电击恢复液,37°C孵育3h,卡那抗性固体基础培养基LB平板筛选电击恢复液, 14-18h可见阳性菌落,培养阳性菌落并提取基因组,经PCR验证,重组猪传染性胃肠炎病毒 S蛋白枯草芽孢杆菌WB800内均含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点基因 (1050bp)。 PCR验证引物如下:
[0112] P13 :TCATTGAACACAACGGGTGGTGTC
[0113] P14 :TAAGCCACTAAGTAGCGTCCTGTTAG
[0114] 以上引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成;
[0115] 如图9可知:均为含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因的阳性重组猪传染性胃肠 炎病毒S蛋白枯草芽孢杆菌WB800菌株基因组。
[0116] 3重组猪传染性胃肠炎病毒S蛋白枯草芽孢杆菌WB800的Western-blot分析
[0117] 对重组枯草芽孢杆菌WB800溶菌酶处理,对表达产物进行Western-blot分析, 结果与鼠抗红色荧光蛋白单抗呈现阳性反应,如图10可知:2、3、4为重组枯草芽孢杆菌 WB800 (基因组中含cotG、S、RFP)与1为枯草芽孢杆菌WB800 (基因组中未整合外源基因) 相比,在209kD处有一条明显的蛋白印迹带,且无非特异性条带出现,证明猪传染性胃肠炎 病毒S蛋白在重组枯草芽孢杆菌WB800内可以被成功表达。
[0118] 4重组猪传染性胃肠炎病毒S蛋白枯草芽孢杆菌WB800的共聚焦显微镜观察
[0119] 将重组枯草芽孢杆菌WB800涂片,进行共聚焦显微镜(型号:ZISS LSM730)观察, 如图11可知:1为正常枯草芽孢杆菌WB800芽孢;2为重组枯草芽孢杆菌WB800芽孢,呈现 红色荧光;3为正常枯草芽孢杆菌WB800。
[0120] 5 口服免疫重组枯草芽孢杆菌WB800菌株机体免疫应答水平的检测
[0121] 空枯草芽孢杆菌WB800菌株(基因组中未整合外源基因)和表达猪传染性胃 肠炎病毒S蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800菌株分别口服免疫一月龄仔猪,口服剂量为 1 X lO^fu/kg,首免一周后按相同剂量进行二免,每周进行血清和粪便的采集,饲养周期为 五周。采用间接ELISA的方法进行TGEV特异性IgG和特异性SIgA抗体水平变化检测。检 测方法为:猪传染性胃肠炎抗原包被过夜,1% BSA(牛血清白蛋白)37°C封闭2h,洗涤后加 待检样品37°C作用1 h,洗涤加适当稀释后的辣根过氧化物酶标兔抗猪IgG或IgA抗体, 37°C lh,含四甲基联苯胺和H202的TMB显色液显色后酶标仪检测0D450。如图12可知:口服 重组枯草芽孢杆菌WB800菌株组仔猪血清中TGEV特异性IgG抗体与口服空枯草芽孢杆菌 WB800菌株组相比(首免后第0天除外)均显著提高(P<0. 01,P<0. 05)。如图13可知: 口服重组枯草芽孢杆菌WB800菌株组仔猪粪便中TGEV特异性SIgA抗体与口服空枯草芽孢 杆菌WB800菌株组相比在首免后第7天、14天和21天均显著提高(P < 0. 01,P < 0. 05)。
[0122] 应用
[0123] 本发明涉及表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800菌 株,有望成为一种猪传染性胃肠炎口服枯草芽孢杆菌基因工程疫苗;同时为开展枯草芽孢 杆菌黏膜免疫递送活载体的研究提供了技术方案。
【主权项】
1. 一种猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的整合表达质粒plncotGSR,是由以下方法构建而 成: I. 1枯草芽孢杆菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆 参照已发表的枯草芽孢杆菌的amyE序列(GenBank登陆号:NZ_CM000487. 1),设计一对 扩增amyE 5的引物,并在上、下游引物5端分别引入NheI、HindIII酶切位点(下划线为酶 切位点),引物序列如下: Pl :GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT P2 :AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG 设-Η对扩增amyE 3的引物,并在上、下游引物5端分别引入KpnI、XhoI酶切位点(下 划线为酶切位点),引物序列如下: P3 :GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC P4 :CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA 以枯草芽孢杆菌WB800提取的基因组DNA为模板,用合成的PUP2引物PCR扩增amyE 5及P3、P4引物扩增amyE 3序列,PCR反应体系均为50yL,amyE 5PCR反应条件:95°C预变 性 5min,95°C 30sec,69°C 30sec,72°C IminJOcycles,?〗。。10min,4°C IOmin ;amnyE 3PCR 反应条件为 95°C预变性 5min ;95°C 30sec,69°C 30sec,72°C lmin,30cycles,72°C lOmin, 4°C lOmin,将PCR产物连接到pMD19-T载体上,构建的载体分别命名为T-amyE 5和T-amyE 3。测序后获得具有枯草芽孢杆菌amyE 5的DNA序列SEQ ID NO. 1和具有枯草芽孢杆菌 amyE 3 的 DNA 序列 SEQ ID NO. 2。 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆 参照已发表的硫酸卡那霉素抗性基因序列(GenBank登陆号:EU549779. 1)设计一对扩 增Kaf的引物,并在上游引物5端引入KpnI、HindIII酶切位点,下游引物5端引入KpnI酶 切位点(下划线为酶切位点),引物序列如下: P5 :GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT P6 :GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA 以pMK3质粒为模板进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L,PCR反应条件:95°C预变性 5min,95°C 30sec,7rC 30sec,72°C IminjocyclesJScC 10min,4°C IOmin;将 PCR 产物连 接到PMD19-T载体上,构建的载体命名为T-Kan%测序后获得具有完整编码区的硫酸卡那霉 素抗性基因序列SEQ ID NO. 3。 1. 3枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因的克隆 参照已发表的枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因序列(GenBank登陆号:NZ_CM000487. 1) 设计一对扩增被膜蛋白G基因 cotG的引物,并在上游引物5端引入与枯草芽孢杆菌amyE 53'末端15bp的同源臂序列,两序列之间引入HindIII酶切位点(下划线为酶切位点);下 游引物5端引入与S蛋白基因5'末端IObp的同源臂序列,两序列之间引入NheI酶切位点 (下划线为酶切位点),引物序列如下: P7 :ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC P8 :GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC 以枯草芽孢杆菌WB800提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L, ?〇?反应条件:95。(:预变性5111丨11,951€3〇86(3,711€3〇86(3,72。(:1111丨111286(3,3(^7(3168, 72°C 10min,4°C IOmin ;将PCR产物连接到pMD19-T载体上,构建的载体命名为T-cotG,测 序后获得具有完整编码区的枯草芽孢杆菌被膜蛋白G基因序列SEQ ID NO. 4。 1. 4猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因的克隆 参照已发表的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列(GenBank登陆号:KP202848)设计 一对扩增S蛋白基因 cDNA的引物,在上游引物引入与枯草芽孢杆菌cotG 3'末端12bp的 同源臂序列,两序列之间引入NheI酶切位点(下划线为酶切位点);在下游引物引入与红 色荧光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列,两序列之间引入HindIII酶切位点(下 划线为酶切位点),引物序列如下: P9 :AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG PlO :GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA 以猪传染性胃肠炎病毒SHXB毒株(猪传染性胃肠炎病毒强毒株)提取的总RNA为模 板,经MLV-反转录酶合成cDNA第一链后进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L,PCR反应条 件:95Γ预变性 5min,95°C 30sec,67°C 30sec,72°C 4min,30cycles,72Γ lOmin,4Γ IOmin ; 将PCR产物连接到pMD19-T载体上,构建的载体命名为T-S,测序后获得具有完整编码区的 猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列SEQ ID NO. 5。 1. 5红色荧光蛋白基因的克隆 参照已发表的红色荧光蛋白基因序列(GenBank登陆号:AB166761. 1)设计一对扩增红 色荧光蛋白基因 RFP的引物,在上游引物引入与S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序列,两 序列之间引入HindIII酶切位点(下划线为酶切位点);在下游引物引入与枯草芽孢杆菌 amyE 35'末端12bp的同源臂序列,两序列之间引入HindIII酶切位点(下划线为酶切位 点),引物序列如下: PU :GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC PI2 :GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG 以pDsRed-monomer-Nl质粒为模板进行PCR扩增;PCR反应体系为50 μ L,PCR反 应条件:95 cC 预变性 5min,95 cC 30sec,72 cC 30sec,72 cC 48sec,30cycles,72 cC 10min, 4°C IOmin ;将PCR产物连接到pMD19-T载体上,构建的载体命名为T-RFP,测序后获得具有 完整编码区的红色荧光蛋白基因序列SEQ ID NO. 6。 1. 6整合表达载体骨架pInAmyE的构建 利用酶切连接技术,分别将SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID NO. 3序列和SEQ ID NO. 2序列克 隆至载体P⑶NA3. 1上,获得整合表达骨架载体pInAmyE。采用限制性内切酶NheI、HindIII、 KpnI和XhoI,分别用双酶切验证。 1. 7整合表达载体plncotGSR的构建 以SEQ ID NO. 4序列、SEQ ID NO. 5序列和SEQ ID NO. 6序列为模板,用引物P7、P12 进行重叠 PCR扩增,PCR反应体系为50yL,PCR反应条件:95°C预变性5min,95°C 30sec, 72°C 30sec,72°C 5min,30cycles,72°C 10min,4°C IOmin ;将 PCR 产物回收,并使用 One Step Cloning Kit定点克隆试剂盒克隆至载体骨架pInAmyE上,测序后获得整合表达载体 plncotGSR。2. -种用权利要求1所述整合表达质粒电转化获得的表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋 白的重组枯草芽孢杆菌。该重组枯草芽孢杆菌WB800菌株,属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。是由以下方法转化而成: 取60以1^枯草芽孢杆菌18800电转化感受态细胞与1以1^(50即/^1^)整合表达载 体plncotGSR质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击,电击条件:22KV/cm,25 μ F, 200 Ω,电击一次。加入ImL电击恢复液,37°C IOOrpm孵育3h,涂布于硫酸卡那霉素抗性固 体基础培养基LB平板,14-18h可见阳性菌落。3. -种用权利要求2所述表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800 菌株口服一月龄仔猪,可以刺激一月龄仔猪机体产生有效的TGEV特异性免疫应答水平的 生物学应用。动物试验以及免疫检测方法如下: 空枯草芽孢杆菌WB800菌株(基因组中未整合外源基因)和表达猪传染性胃肠炎病毒 S蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800菌株分别口服免疫一月龄仔猪,口服剂量为IX IO1Yfu/ kg,首免一周后按相同剂量进行二免,每周进行血清和粪便的采集,饲养周期为五周。采用 间接ELISA的方法进行TGEV特异性IgG和特异性SIgA水平变化检测,检测方法为:猪传染 性胃肠炎抗原包被过夜,1 % BSA (牛血清白蛋白)37 °C封闭2h,洗涤后加待检样品37 °C作用 lh,洗涤加适当稀释后的辣根过氧化物酶标兔抗猪IgG或IgA抗体,37°C lh,含四甲基联苯 胺和H2O2的TMB显色液显色后酶标仪检测0D450。结果发现表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋 白的重组枯草芽孢杆菌WB800菌株可以刺激一月龄仔猪机体产生有效的TGEV特异性免疫 应答水平。
【文档编号】C12N1/21GK105886523SQ201410833720
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月25日
【发明人】杨倩, 牟春晓, 朱立麒, 林 建
【申请人】南京农业大学
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1