一种抑制肿瘤转移的方法
【专利摘要】本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种抑制肿瘤转移的方法；采用Crispr/cas9技术定点敲除肿瘤细胞的DP103基因；通过定点敲除肿瘤细胞的DP103基因，可以有效降低肿瘤转移能力。
【专利说明】
一种抑制肿瘤转移的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种抑制肿瘤转移的方法。
【背景技术】
[0002] 在过去的几十年里，抗肿瘤药的筛选主要是考察其对快速生长细胞的毒性作用。 随着肿瘤生物学研究的发展，人们认识到肿瘤细胞不仅具有旺盛的增殖能力，而且还具有 破坏自身组织、浸润相邻组织以及浸润血管或淋巴管并随着血液或淋巴液转移到其他组织 的能力。肿瘤和正常组织的相互作用与肿瘤的血管生成、侵袭和转移等特性有很大的关系。 肿瘤转移已成为近年来的研究热点之一。
[0003] 肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发部位扩散到机体其它部位的现象。统计表明，超过 90 %的肿瘤患者死亡源于肿瘤转移。肿瘤转移包括：1、肿瘤细胞迀移通过肿瘤组织基底膜； 2、进入循环系统，在其中存活并转运;3、在肿瘤继发部位滞留；4、从循环系统渗出；5、浸入 肿瘤继发部位并增殖形成新的肿瘤等过程。由于其复杂性，尽管已对其进行了广泛的研究， 肿瘤转移仍然是迄今了解得最少的肿瘤生物学过程。肿瘤转移这一复杂过程是由多种基因 调节的。其中有些基因促进肿瘤转移的发生，叫做肿瘤转移促进基因。多年来，利用各种基 因过表达手段，人们找到了一些肿瘤转移促进基因，例如，AmfHgf/sfJGF-lMMPdPAj-catenin 等。
[0004] 另一类基因抑制肿瘤转移的发生，叫做肿瘤转移抑制基因。通常，肿瘤转移抑制基 因能抑制肿瘤转移而对原发肿瘤生长无影响，在转移病灶中常通过甲基化或转录翻译后修 饰等一系列机制表现为表达下调。为了更好地了解肿瘤转移，人们试图进一步揭示肿瘤转 移抑制基因在肿瘤转移发生过程中的作用。显而易见，寻找肿瘤转移抑制基因需要通过降 低肿瘤转移抑制基因表达来实现。但是，由于没有可靠的降低表达手段，长期以来只确定了 非常有限的肿瘤转移抑制基因，目前只有匪23、謂11、1(1331、11(1(4、8-31、6 &81等有限的基 因符合肿瘤转移抑制基因的定义标准，其中最为明确的是匪23和KNI1。从而使得对肿瘤转 移抑制基因的研究、开发、利用无法进行，极大地限制了对肿瘤转移的了解、诊断和治疗。
[0005] Crispr/cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过喊基配对与 tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造 形成具有引导作用的sgRNA( Singleguide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。
[0006] 作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子 (unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核 酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可革E定任何dsDNA序列，而 sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来 任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
【发明内容】
[0007]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于Crispr/cas9技术、通过定点 切割肿瘤转移促进基因、以降低肿瘤转移能力的抑制肿瘤转移的方法。
[0008]本发明提供一种抑制肿瘤转移的方法，采用Crispr/cas9技术定点敲除肿瘤细胞 的DP103基因。DP103基因又称为DDX20或GEMIN3,其NCBI数据库（National Center for Biotechnology Inf ormation，http : //www .ncbi.nlm.nih. gov/)上记载的Gene ID 为 11218〇
[0009] DP103是DEAD-box家族蛋白成员之一，命名来源于其中Asp-Glu-Ala-Asp在解旋酶 中的位置，DEAD-box家族蛋白，是一个ATP依赖的RNA解旋酶家族，参与RNA的各种代谢过程 如RNA二级结构变换、转录起始、线粒体RNA剪接、核糖体和剪接体装配、mRNA降解以及维持 mRNA的稳定性等，参与胚胎发育、精子发生以及细胞的生长和分裂等过程。近期研究发现该 家族成员之一的DP103基因在转移性肿瘤细胞中高表达。
[00?0] 应当说明的是，Crispr/cas9技术，是通过人工设计成具有引导作用的gRNA(guide RNA)靶向于目的基因，引导核酸酶Cas9蛋白对DNA定点切割，致使目的基因不能正常表达。 在使用该技术时需要先对目的基因的基因组进行分析，在该基因的外显子区域寻找CAS9酶 的作用识别位点NGG，其中N可以是A、T、C、G中的任意一种，实验中根据作用位点前20个碱基 设计合成gRNA的序列正义链和反义链，即基因敲除引物。两条单链退火成双链后构建至 gRNA-cas9克隆载体，进行质粒转染细胞或者包装成病毒，随后感染细胞，在细胞内靶向目 的基因对其进行切割，使得该基因失活，从而达到基因敲除的目的。
[0011]进一步的，包括以下步骤：
[0012] S1、设计并合成靶向于DP103基因的一组基因敲除引物；
[0013] S2、将步骤S1中的一组基因敲除引物退火成双链DNA;
[0014] S3、慢病毒载体酶切；
[0015] S4、将步骤S2获得的双链DNA与慢病毒载体连接，得到质粒；
[0016] S5、将步骤S4获得的质粒与慢病毒包装辅助质粒共同转染细胞，包装成慢病毒颗 粒，浓缩纯化后感染肿瘤细胞。
[0017] 应当说明的是，DP103基因共有11个外显子构成，本发明中步骤S1中设计并合成的 基因敲除引物靶向于DP103基因的第一外显子。与其他部分的外显子相比，第一外显子为转 录的起始部分，选择其作为靶点，可以最大程度上提高对DP103基因的敲除效率，使得该基 因完全失活。
[0018]其中，DP103基因的第一外显子的基因序列为：
[0020] 基因敲除引物靶向DP103基因的序列为前述序列中下划线的部分，即：
[0021] ggacccgcacggggg(SEQ ID N0：2)
[0022] 具体而言，该方法中所采用的基因敲除引物如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。 具体序列为：DP103-sgRNA-lF: CACCGCATCCCCCGTGCGGGTCCG(SEQ ID NO: 3)和DP103-sgRNA-1R：AAACCGGACCCGCACGGGGGATGC(SEQ ID N0：4)〇
[0023]应当说明的是，虽然CAS9普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具 有效率低、作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢 病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒如addgene(lentiCRISPR v2、lentiGuide_Puro、 lentiCaS9-Blast)，慢病毒载体介导的基因表达作用持续且稳定，原因是目的基因整合到 宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到 非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整 合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有很大的优势。现今， 慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细 胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。
[0024]具体而言，该方法步骤S3中所述的慢病毒载体为Lenti-crispr V2。
[0025] 具体而言，步骤S5中质粒与慢病毒包装辅助质粒共同转染至293T或293FT细胞。
[0026] 本发明提供一种重组慢病毒载体制剂，包括有效剂量的前述慢病毒颗粒。
[0027] 进一步的，还包括维持所述制剂的pH值范围的缓冲液以及糖类。所述糖类选自单 糖和非还原性二糖中的至少一种。更优选所述糖类选自葡萄糖、果糖、海藻糖和鹿糖中的至 少一种。以重组慢病毒载体制剂为基准，所述糖类含量的质量体积百分比范围为2-10% (w/ v) 〇
[0028] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：通过定点切割肿瘤转移促进基因 DP103，可以有效降低肿瘤转移能力。
[0029] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明中不同细胞中DP103基因表达检测结果图；
[0031 ]图2是本发明中不同细胞划痕实验48小时后细胞的迀移面积结果图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0033] 实施例1
[0034] 本发明一较佳实施例提供一种抑制肿瘤转移的方法，具体包括以下步骤：
[0035] S1、在肿瘤细胞中检测DP103基因的表达
[0036] 提取常见肿瘤细胞和非肿瘤细胞的总RNA，并反转录成cDNA，用QPCR的方法检测 DP103基因在各细胞系中的表达量。以非肿瘤细胞HEK293细胞做为对照细胞。检测结果如图 1所示，可见各肿瘤细胞内DP103基因存在不同程度的高表达，其中尤以恶性黑素瘤细胞系 A375中DP103基因的表达值最高。
[0038] S2、设计并合成针对DP103基因的靶向序列
[0039] 根据crispr/cas9祀点设计原则，设计并合成革E1向于DP103基因的单链核苷酸 (oligo)：
[0042] DP103基因的核苷酸序列为：
gtaaccagtga(SEQ ID NO：7)
[0044]其中，前述序列中下划线的位置为单链核苷酸的靶向区域。
[0045] DP103基因的氨基酸序列为：
[0047] S3、单链核苷酸退火成双链DNA
[0048]将合成的两条单链核苷酸，用超纯水溶解成20uM/ml的溶液，各取3ul与14ul超纯 水配制成20ul反应体系于200ul PCR管中，置于PCR仪中按照95°C:10分钟，90°C:5分钟，85 °C : 5分钟，80°C : 5分钟，75°C : 5分钟，70°C : 5分钟，65°C : 5分钟，60°C : 5分钟，55°C : 5分钟，50 。(：：5分钟，45 °C : 5分钟，40 °C : 5分钟，35 °C : 5分钟，30 °C : 5分钟，25 °C : 5分钟，20 °C : 5分钟。将 两条单链退火成双链DNA。
[0049] S4、慢病毒载体酶切
[0050] 将Lenti-crispr V2载体用BsmBI(NEB，R0580S)酶切，体系如下：
[0051 ] BsmBI(NEB,R0580S)lul；
[0052] Lenti-crispr V2载体质粒3ug;
[0053] NEBuffer3 2ul；
[0054] 补水至 20ul。
[0055] 55°C水浴反应lh，用浓度1%琼脂糖凝胶电泳回收目的载体约12Kb。
[0056] S5、含靶点序列的双链DNA和慢病毒载体连接
[0057] 将退火双链DNA 8ul、Lenti-crispr V2用BsmBI酶切胶回产物6ul、5X T4 DNA Ligase buffer(invitrogen)4ul、T4 DNA Ligase(invitrogen)2ul，配制为总体积20ul的 反应体系，置于1.5mlEP管中，25°C水浴反应1小时。
[0058] 取10ul转化100ul DH5a感受态细胞，涂板(AMP+)，37°C恒温培养过夜。
[0059] S6、慢病毒包装及感染肿瘤细胞
[0060] 将步骤S5获得的DH5a细胞，提取质粒后，与慢病毒包装辅助质粒helperl和质粒 helper2共同转染293FT细胞，将其包装成慢病毒颗粒，并进行浓缩纯化。随后感染三株高表 达DP103基因的肿瘤细胞（MB231，A375和BT549)和三株低表达DP103基因的肿瘤细胞 (SGC7901、MCF7，A549)。
[0061 ] S7、细胞基因组提取
[0062]提取步骤S6中慢病毒感染后的肿瘤细胞基因组，进行基因组PCR。其引物为：
[0065] 扩增产物为485bp，PCR扩增产物纯化回收。
[0066] S8、错配法检测基因敲除结果
[0067] 将步骤S7中获得的PCR纯化产物，用步骤S2中的引物进行PCR测序，退火后用T7E1 酶（NEB)进行酶切，2%琼脂糖凝胶电泳检测基因敲除结果，可以检测出484bp、137bp和 344bp三条DNA条带。
[0068] S9、划痕实验检测DP103基因敲除后对细胞转移的影响
[0069] 将等密度的DP103基因敲除的肿瘤细胞和未进行基因敲除的肿瘤细胞传于细胞培 养皿中，传代后24小时后细胞密度约90%，进行划痕实验。48小时后计算细胞迀移的面积， 并进行对比。
[0070] 如图2所示，高表达DP103基因的肿瘤细胞在将该基因敲除后转移速度明显低于未 敲除该基因的肿瘤细胞。而非高表达DP103基因的肿瘤细胞在将该基因敲除后，细胞转移速 度也有不同程度的降低。
[0071] 实施例2
[0072] 本发明一较佳实施例提供一种重组慢病毒载体制剂，包括有效剂量的前述慢病毒 颗粒。
[0073] 还包括维持制剂的pH值范围的缓冲液以及作为稳定剂的糖类。糖类选自单糖和非 还原性二糖中的至少一种。更优选糖类选自葡萄糖、果糖、海藻糖和鹿糖中的至少一种。以 重组慢病毒载体制剂为基准，糖类含量的质量体积百分比范围为2-10%(w/v)。
[0074] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种抑制肿瘤转移的方法，其特征在于:采用Crispr/cas9技术定点敲除肿瘤细胞的 DP103基因。2. 根据权利要求1所述的抑制肿瘤转移的方法，其特征在于:包括以下步骤： 51、 设计并合成靶向于DP103基因的一组基因敲除引物； 52、 将步骤Sl中的一组基因敲除引物退火成双链DNA; 53、 慢病毒载体酶切； 54、 将步骤S2获得的双链DNA与慢病毒载体连接，得到质粒； 55、 将步骤S4获得的质粒与慢病毒包装辅助质粒共同转染细胞，包装成慢病毒颗粒，浓 缩纯化后感染肿瘤细胞。3. 根据权利要求2所述的抑制肿瘤转移的方法，其特征在于:步骤Sl中设计并合成的基 因敲除引物靶向于DP103基因的第一外显子。4. 根据权利要求3所述的抑制肿瘤转移的方法，其特征在于:步骤Sl中设计并合成的基 因敲除引物靶向于如SEQ ID N0:2所示的序列。5. 根据权利要求4所述的抑制肿瘤转移的方法，其特征在于:所采用的基因敲除引物如 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。6. 根据权利要求2所述的抑制肿瘤转移的方法，其特征在于:步骤S3中所述的慢病毒载 体为Lenti-crispr V2〇7. 根据权利要求2所述的抑制肿瘤转移的方法，其特征在于:步骤S5中质粒与慢病毒包 装辅助质粒共同转染至293T或293FT细胞。8. -种重组慢病毒载体制剂，其特征在于:包括有效剂量的根据权利要求2所述的抑制 肿瘤转移的方法得到的慢病毒颗粒。9. 根据权利要求8所述的重组慢病毒载体制剂，其特征在于:还包括维持所述制剂的pH 值范围的缓冲液以及糖类。
【文档编号】C12N15/867GK105886534SQ201610280023
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】刘骏, 王满平
【申请人】苏州溯源精微生物科技有限公司