牛乳酪蛋白降胆固醇肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛乳酪蛋白降胆固醇肽的制备方法，包括以下步骤：（1）将牛乳酪蛋白溶解；（2）加碱性蛋白酶水解；（3）灭活碱性蛋白酶；（4）沉淀酪蛋白；（5）离心除去酪蛋白；（6）超滤膜分离，除去大分子蛋白及多肽；（7）纳滤，除去小分子盐和氨基酸；（8）真空干燥。本发明的制备工艺简单，所得牛乳酪蛋白降胆固醇肽纯度高，降胆固醇活性最高可达74%，适合在医药领域中使用。
【专利说明】
牛乳酪蛋白降胆固醇肽的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛乳酪蛋白降胆固醇肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 由于血清中的高胆固醇是冠心病的多发因素之一，冠心病的发生是动脉粥样硬化 的结果，动脉粥样硬化主要是脂质(胆固醇及其酯)积蓄在动脉壁的内层。高血脂症指血中 脂肪物质如胆固醇、甘油三脂及脂蛋白代谢异常的疾病群，是由于血中脂肪物质过高所产 生的疾病，它是造成动脉硬化症和心脏病发生的一个重要危险因子。肽类降胆固醇的作用 主要是抑制胆固醇胶束的溶解度从而阻碍肠道内胆固醇的吸收，促使胆固醇排出体外，降 低血液中血脂和胆固醇的浓度，使血脂异常回复正常以降低动脉硬化及心脏血管疾病的发 生。目前已有很多的研究证明许多食物源蛋白质的蛋白酶水解产物对动物血清胆固醇水平 有较大影响。但是，一直以来研究食物源蛋白生物活性肽对动物或人类血清胆固醇水平的 影响更多的是采用大豆蛋白，而对于牛乳酪蛋白源生物活性肽对血液胆固醇水平的影响则 研究较少。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是利用牛乳中提取纯化的酪蛋白为原料，提供一种能有效抑制胆固 醇吸收的牛乳酪蛋白降胆固醇肽的制备方法，工艺简单，纯度高，适合在医药领域中使用。
[0004] 为了实现本发明的目的，采用如下技术方案： 一种牛乳酪蛋白降胆固醇肽的制备方法，包括以下步骤： (1) 将牛乳酪蛋白溶解在〇. 〇5mo 1/L三羟甲基氨基甲烷(Tri S)中，用NaOH调节溶液PH值 至8.0-8.5，酪蛋白溶液的最终质量浓度为40-50mg/ml; (2) 加碱性蛋白酶水解，维持反应温度55-65 °C，PH值8.5-9.5，反应时间90-180min; (3) 灭活碱性蛋白酶，升温至90 °C，维持10_20min; (4) 沉淀酪蛋白，用5mol/L的盐酸调节PH值到4.0-4.6，使酪蛋白在其等电点处析出； (5) 在10000r/min的条件下离心20min，除去酪蛋白沉淀，留上清液； (6) 将步骤(5)中所得上清液经截流量为5000Da的中空纤维超滤膜进行分离，除去大分 子蛋白及多肽，收集透过液； (7) 用截流量300Da的纳滤膜，纳滤步骤(6)中所得透过液，除去小分子盐和氨基酸，收 集回流液； (8) 对步骤(7)收集的回流液进行真空干燥，即得所述的牛乳酪蛋白降胆固醇肽粉末； 所述牛乳酪蛋白为食品级牛乳酪蛋白；所述盐酸为食用级盐酸;所述碱性蛋白酶为食 品级碱性蛋白酶;所述步骤(2)中碱性蛋白酶的量为酪蛋白溶液的3%-4%。
[0005] 对以上所述方法得到的牛乳酪蛋白降胆固醇肽进行降胆固醇活性的测定： 模拟胆汁胶束溶包含：10 mrnol/L牛磺胆酸钠，2 mmol/L胆固醇，5mmol/L油酸，132 mmol/L氯化钠 ，15 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH=7.4)，5 mg/mL牛乳酪蛋白降胆固醇肽粉 末，超声波乳化(功率400 W，频率20kHz，20min)，然后在37°C培养24 h，离心（16000r/min， 60min)后取上清液测定胆固醇含量。上清液中的胆固醇浓度即为胆固醇胶束溶解度(mmol/ L)，以不加牛乳酪蛋白降胆固醇肽的胶束溶液为空白，牛乳酪蛋白降胆固醇肽对胆固醇的 降解活性按下式测定：
本发明的有益效果为：该制备方法工艺简单，绿色环保，生产成本低，产品纯度高，降 胆固醇活性较高，适合在医药领域中使用。
【具体实施方式】
[0006] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述： 实施例1: (1) 称取牛乳酪蛋白20g，将其溶解在10ml 0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)中，用 NaOH调节溶液PH值至8.5，使得酪蛋白溶液的最终质量浓度为40mg/ml;所述牛乳酪蛋白购 自上海川和食品有限公司； (2) 加碱性蛋白酶水解，碱性蛋白酶添加量为1 g，维持反应温度60°C，PH值8.5，反应时 间120min;所述碱性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，酶活200units/mg; (3) 灭活碱性蛋白酶，升温至90°C，维持20min; (4) 沉淀酪蛋白，用5mol/L的盐酸调节PH值到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出； (5) 在10000r/min的条件下离心20min，除去酪蛋白沉淀，留上清液； (6) 将步骤(5)中所得上清液经截流量为5000Da的中空纤维超滤膜进行分离，除去大分 子蛋白及多肽，收集透过液； (7) 用截流量300Da的纳滤膜，纳滤步骤(6)中所得透过液，除去小分子盐和氨基酸，收 集回流液； (8) 对步骤(7)收集的回流液进行真空干燥，即得所述的牛乳酪蛋白降胆固醇肽粉末 13.7g，产率为 68.5%。
[0007] 对以上所得牛乳酪蛋白降胆固醇肽进行降胆固醇活性的测定： 模拟胆汁胶束溶包含：10 mrnol/L牛磺胆酸钠，2 mmol/L胆固醇，5mmol/L油酸，132 mmol/L氯化钠 ，15 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH=7.4)，5 mg/mL牛乳酪蛋白降胆固醇肽粉 末，超声波乳化(功率400 W，频率20kHz，20min)，然后在37°C培养24 h，离心（16000r/min， 60min)后取上清液测定胆固醇含量。上清液中的胆固醇浓度即为胆固醇胶束溶解度(mmol/ L)，以不加牛乳酪蛋白降胆固醇肽的胶束溶液为空白，牛乳酪蛋白降胆固醇肽对胆固醇的 降解活性按下式测定：
以100%乙醇洗脱降胆固醇活性为:74%。
[0008] 实施例2: (1)称取牛乳酪蛋白30g，将其溶解在15ml 0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)中，用 NaOH调节溶液PH值至8.3，使得酪蛋白溶液的最终质量浓度为50mg/ml; (2) 加碱性蛋白酶水解，碱性蛋白酶添加量为1.5g，维持反应温度55 °C，PH值9.0，反应 时间150min;所述碱性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，酶活200units/mg; (3) 灭活碱性蛋白酶，升温至90°C，维持20min; (4) 沉淀酪蛋白，用5mol/L的盐酸调节PH值到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出； (5) 在10000r/min的条件下离心20min，除去酪蛋白沉淀，留上清液； (6) 将步骤(5)中所得上清液经截流量为5000Da的中空纤维超滤膜进行分离，除去大分 子蛋白及多肽，收集透过液； (7) 用截流量300Da的纳滤膜，纳滤步骤(6)中所得透过液，除去小分子盐和氨基酸，收 集回流液； (8) 对步骤(7)收集的回流液进行真空干燥，即得所述的牛乳酪蛋白降胆固醇肽粉末 21.5g，产率为 71.7%。
[0009] (9)降胆固醇活性为72.3%。
【主权项】
1. 一种牛乳酪蛋白降胆固醇肽的制备方法，包括以下步骤： (1) 将牛乳酪蛋白溶解在O. O 5mo I /L三羟甲基氨基甲烷(Tr is)中，用NaOH调节溶液PH值 至8.0-8.5，酪蛋白溶液的最终质量浓度为40-50mg/ml; (2) 加碱性蛋白酶水解，维持反应温度55-65 °C，PH值8.5-9.5，反应时间90-180min; (3) 灭活碱性蛋白酶，升温至90 °C，维持10_20min; (4) 沉淀酪蛋白，用5mo 1/L的盐酸调节PH值到4.0-4.6，使酪蛋白在其等电点处析出； (5) 在10000r/min的条件下离心20min，除去酪蛋白沉淀，留上清液； (6) 将步骤(5)中所得上清液经截流量为5000Da的中空纤维超滤膜进行分离，除去大分 子蛋白及多肽，收集透过液； (7) 用截流量300Da的纳滤膜，纳滤步骤(6)中所得透过液，除去小分子盐和氨基酸，收 集回流液； (8) 对步骤(7)收集的回流液进行真空干燥，即得所述的牛乳酪蛋白降胆固醇肽粉末； 所述牛乳酪蛋白为食品级牛乳酪蛋白；所述盐酸为食用级盐酸;所述碱性蛋白酶为食 品级碱性蛋白酶;所述步骤(2)中碱性蛋白酶的量为酪蛋白溶液的3%-4%。
【文档编号】C07K1/34GK105886588SQ201610271132
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】李健
【申请人】李健