一种环境水样维甲酸激素干扰化合物快速测试方法
【专利摘要】本发明提供一种环境水样维甲酸激素干扰化合物快速测试方法，建立一种环境水样维甲酸激素干扰化合物的前处理方法，并利用重组基因酵母开展检测，以形成完整的环境水样维甲酸激素干扰化合物的快速测试体系。本发明提供的一种环境水样维甲酸激素干扰化合物的快速测试方法，基于重组基因酵母，包括如下步骤：(1)培养重组基因酵母细胞；(2)待测样品与重组基因酵母共孵育；(3)重组基因酵母细胞酶活性测定。本发明方法无需对样品进行复杂的前处理，通过改进了酶活性的反应底物、优化测试体系等，降低了检测方法的检测限，提高测试体系的灵敏度。
【专利说明】
一种环境水样维甲酸激素干扰化合物快速测试方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种维甲酸激素干扰化合物快速测试方法，具体涉及一种基于重组基 因酵母的适用于环境水样如地表水、地下水、水源水、污水中维甲酸激素干扰化合物的快速 生物测试方法。
【背景技术】
[0002] 环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指一些释放到环境中的污染物，它 们能够干扰人类和动物激素调节的生理过程，改变内分泌与生殖系统的正常功能，对人类 生存和繁衍构成巨大威胁（参见，李剑，饶凯峰，马梅，王子健，核受体超家族及其酵母双杂 交检测技术，生态毒理学报，2008, 3 (6)，521-532)。环境激素按其来源可分为天然激素和人 工激素两大类；根据其干扰作用类型的不同又可细分为：环境雌激素干扰化合物、环境雄 激素干扰化合物、环境甲状腺激素干扰化合物，环境维甲酸激素干扰化合物等。目前对维甲 酸干扰化合物的研究还相对较少，已经发现的具有类维甲酸化合物种类包括天然维甲酸化 合物、有机锡化合物、酚类化合物或其代谢后具有酚类结构的化合物、邻苯二甲酸酯类化合 物、有机氯农药类化合物中的一种或几种，抗维甲酸化合物选自酚类化合物或其代谢后具 有酚类结构的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药类化合物中的一种或几种。
[0003] 研究发现，由于工业生产、人类活动等可导致维甲酸激素干扰化合物进入环境水 体，在我国的饮用水、地表水、地下水等多种水体中均有检出上述具有维甲酸激素干扰活 性的化合物。虽然该类维甲酸激素干扰化合物在环境水体中检出的浓度水平较低，但已 对水生生物和人类健康构成威胁。例如，已经发现一些持久性有毒有机污染物（POPs)具 有维甲酸激素干扰活性，环境中该类POPs的暴露已证实与生物体内维甲酸平衡的破坏 相关。生活在加拿大造纸厂排污口下游河流中的鱼类肝脏中维甲酸的水平显著降低，这 主要是由于排污口排放的污染物中含有维甲酸激素干扰化合物（参见，Alsop D，Hewitt M, Kohli M, Brown S and Van Der Kraak G. Constituents within pulp mill effluent deplete retinoid stores in white sucker and bind to rainbow trout retinoic acid receptors and retinoid x receptors. Environ. Toxicol. Chem. ,2003,22(12):2969 -2976)。尽管这类具有维甲酸干扰活性的化合物在环境中浓度极小，但是其一旦进入人体和 动物体内，可以与特定的维甲酸受体结合形成复合物，启动/抑制下游基因的表达，干扰内 分泌系统的正常功能。由此可见，开展环境水体中维甲酸激素干扰化合物的监测，对于保障 水质安全，保护人类健康，维护水生态系统平衡具有重要的意义。
[0004] 由于环境水样具有被测浓度低、组分复杂、干扰物质多、易受环境影响而变化等特 点，通常都要经过复杂的前处理后才能进行分析测定。因此，现阶段环境水样中环境维甲酸 激素干扰化合物的检测都包含样品前处理和分析测定两个主要步骤。环境水样维甲酸激 素干扰化合物检测时通常采用的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、微波萃取等（参见， 王晓峰，环境水样前处理技术的探讨，黑龙江环境通报，2011，35 (3)，49-51)。上述前处理方 法需要消耗大量有机溶剂，危害环境，且操作时间较长；更重要的是，前处理方法在富集、浓 缩的过程中也可能造成样品中维甲酸激素干扰化合物的损失，因此测试结果不能反映环境 水样维甲酸激素干扰化合物的真实水平。现阶段的分析测定主要包括化学分析和生物测试 方法；化学分析需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员 素质有相当严格的要求，而生物测试方法具有稳定、经济、高效的特点，能够弥补化学分析 方法的不足。快速测试方法由于摒弃了复杂的样品前处理，去除了富集、净化等步骤，提高 了目标化合物的回收率，但是也影响到方法的检测限。如中国发明专利ZL200710308511. X 中公开的一种环境中类/抗维甲酸化合物的生物测试方法。由于没有对待测样品的富集步 骤，快速测试方法的检测限通常高于含有前处理的生物测试方法；以及使用有机溶剂提取 待测样品，容易造成待测样品的二次污染。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种环境水样维甲酸激素干扰化合物快速测试方法，建立一种环境水 样维甲酸激素干扰化合物的前处理方法，并利用重组基因酵母开展检测，以形成完整的环 境水样维甲酸激素干扰化合物的快速测试体系。无需对样品进行复杂的前处理，通过改进 了酶活性的反应底物、优化测试体系等，降低了检测方法的检测限，提高测试体系的灵敏 度。
[0006] 本发明提供一种环境水样维甲酸激素干扰化合物的快速测试方法，基于重组基因 酵母，包括如下步骤：
[0007] (1)培养重组基因酵母细胞；
[0008] (2)待测样品与重组基因酵母共孵育；
[0009] (3)重组基因酵母细胞酶活性测定；
[0010] 优选地，在所述步骤（1)中，测定酵母细胞密度，重组基因酵母细胞菌液十倍稀释 后600nm处的吸光度值0D6。。在0. 35-0. 40之间；
[0011] 优选地，所述步骤（2)中待测样品与重组基因酵母共孵育振荡培养2-4h ;
[0012] 优选地，所述步骤（3)包括在孵育好的重组基因酵母细胞中加入4-甲基伞形 酮-β-D葡萄糖醛酸苷（MUG)进行反应生成荧光产物，测其荧光值，当重组基因酵母细胞的 测试体积为20-100 μ L时，加入的MUG的测试浓度为10 4-10 5mol/L ;
[0013] 优选地，在所述步骤（2)之前对待测样品进行过滤，去除待测样品中的悬浮颗粒 物；
[0014] 优选地，所述步骤（2)中加入溶液A，所述溶液A包括：0. 2g/L腺嘌呤半硫酸盐， 0. 2g/L盐酸精氨酸，0. 2g/L -水合盐酸组氨酸，0. 3g/L异亮氨酸，0. 3g/L盐酸赖氨酸， 0. 2g/L甲硫氨酸，0. 5g/L苯丙氨酸，2g/L苏氨酸，0. 3g/L酪氨酸，0. 2g/L尿啼啶，1. 5g/L缴 氨酸，67g/L无氨基酸酵母氮源；
[0015] 优选地，所述步骤（2)中重组基因酵母细胞、待测样品、溶液A的体积比为2~3 : 9:1;
[0016] 优选地，所述步骤（2)中还加入葡萄糖，其终浓度为15~20g/L ;
[0017] 优选地，在所述步骤（3)中检测反应终止后上清液的荧光值，绘制标准曲线，计算 待测样品中类维甲酸化合物的含量；
[0018] 优选地在，所述步骤（2)中还加入9-顺维甲酸（9-cis RA)，所述9-顺维甲酸的终 浓度为1X10 6mol/L，所述步骤（3)中检测反应终止后上清液的荧光值，绘制标准曲线，计 算待测样品中抗维甲酸化合物的含量。
[0019] 本发明的目的在于克服已有技术在检测环境水样中维甲酸激素干扰化合物时需 要复杂的样品前处理流程，此过程不仅操作时间长、费用高、使用有机溶剂容易造成二次污 染，而且前处理过程极容易丢失目标化合物或引入新的干扰化合物，产生假阴性或是假阳 性的结果，构建基于重组基因酵母的，无需复杂前处理的环境水样维甲酸激素干扰化合物 检测方法。该检测方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少，能够反映 环境水样（包括污水、地表水、水源水等）中维甲酸激素受体的诱导/抑制效应，并且通过 标准曲线计算得到样品中维甲酸激素干扰化合物的毒性当量浓度值，表征水样中维甲酸激 素干扰化合物的浓度水平。
[0020] 本发明提供的基于重组基因酵母环境水样维甲酸激素干扰化合物快速测试方法 的有益之处在于：1)摒弃了传统方法检测环境水样维甲酸激素干扰化合物时需要复杂的 样品前处理技术，如固相萃取、液液萃取、微波萃取等，不仅需要消耗大量有机溶剂，危害 环境，且操作时间较长；新方法缩短了近70%的操作时间，减少了近90%的有机溶剂消 耗。2)提高了方法的回收率，减少假阳性/阴性结果的发生；通常情况下，前处理在富集、 浓缩的过程中极容易造成样品中维甲酸激素干扰化合物的损失，或由于实验操作引入新的 污染物，产生假阳性/阴性结果，因此测试结果不能反映环境水样维甲酸激素干扰化合物 的真实水平。3)便于开展环境水样的野外快速检测；传统的分析测试方法无论是化学分 析还是生物测试，由于需要结合复杂的样品前处理流程，很难直接开展环境水样维甲酸激 素干扰化合物的野外检测，新方法提供了一种野外快速检测的新思路；4)利用该方法快速 检测环境水样维甲酸激素干扰化合物时，操作简便，省时省力，所需样品量少，成本低廉； 且具有稳定、经济、高效的优点；5)选用MUG作为反应底物，替代了常规的反应底物邻硝基 苯-β -D-吡喃半乳糖苷（0NPG)，反应产物也由荧光产物替代了原有的显色产物，提高了方 法的灵敏度，降低了测试体系的检测限，新方法报道的9-cis RA的EC5。值为1. 6Χ 10 9mol/ L，而Sohoni等（1998)报道为>10smol/L。6)本发明采用重组基因酵母，除能直接检测环 境水样中的维甲酸激素干扰化合物外，还能够同时反映维甲酸激素干扰化合物可能对人体 产生的影响，预警化合物对人体内分泌系统可能存在的风险。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明不同暴露时间9-cis RA对重组基因酵母酶活性的诱导结果示意图；
[0022] 图2为本发明9-cis RA对重组基因酵母酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线 示意图；
[0023] 图3为本发明测试方法检测环境水样维甲酸激素干扰化合物的测试结果示意图。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合附图对本发明的技术方案作进一步描述。
[0025] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业渠道获得；本发明实施例中使用重组基因酵母由中国科学院 生态环境研究中心提供。
[0026] 本发明方法中所述溶液A包含：0. 2g/L腺嘌呤半硫酸盐，0.2g/L盐酸精氨酸， 0. 2g/L -水合盐酸组氨酸，0. 3g/L异亮氨酸，0. 3g/L盐酸赖氨酸，0. 2g/L甲硫氨酸，0. 5g/ L苯丙氨酸，2g/L苏氨酸，0. 3g/L酪氨酸，0. 2g/L尿啼啶，1. 5g/L缴氨酸，67g/L无氨基酸酵 母氮源。
[0027] 本发明方法中所述MUG反应液包括：2L 51g/L Na2HP04 · 12Η20,6· 22g/L NaH2P04 · 2Η20,0· 75g/L KC1，0. 25g/L MgS04 · 7Η20,0· 00338g/L 的 MUG。此外，MUG 溶解液 也可以用DMSO来溶解。
[0028] 本发明提供一种基于重组基因酵母用于检测环境水样类维甲酸激素干扰化合物 的前处理及重组基因酵母共孵育法。其中，所述重组基因酵母为包含维甲酸激素受体基因 片段，并正确表达维甲酸激素受体的重组基因酵母。所述类维甲酸激素干扰化合物选自天 然维甲酸化合物、有机锡化合物、酚类化合物或其代谢后具有酚类结构的化合物、邻苯二甲 酸酯类化合物、有机氯农药类化合物中的一种或几种。
[0029] 包括如下步骤：
[0030] 1. 1培养重组基因酵母细胞：将酵母细胞接种到营养缺陷型SD/-Trp/-LeU培养基 中，培养12-36h，测定酵母细胞密度，要求十倍稀释后600nm处酵母菌液的吸光度值0D 6。。在 0· 35-0. 40 之间；
[0031] 1. 2环境水样采集及过滤：用洗净的玻璃瓶采集环境水样1-5L，低温4°C保存；采 用0. 7 μπι玻璃纤维滤膜过滤水样，去除水体中的悬浮颗粒物；
[0032] 1. 3水样与重组基因酵母共孵育：准确量取重组基因酵母细胞1-1. 5mL，离心，室 温下1000g离心5min，弃去上清液，将重组基因酵母细胞添加到含4. 5mL环境水样的三角瓶 中，加入0. 5mL溶液A和100mg葡萄糖。三角瓶经半透膜封口后置于150rpm，30°C全温振荡 培养箱中暴露培养，测定〇D6。。的值；
[0033] 在步骤1. 3中测定暴露培养时间，如图1所示，检测不同暴露时间1X10 6mol/ L9-cis RA对重组基因酵母酶活性的诱导，其中横坐标是不同暴露时间，纵坐标是百分诱导 酶活性值P ;分别测定出暴露〇h_24h后的酶活性值，优选暴露培养时间为2-4h。
[0034] 本发明提供一种基于重组基因酵母用于检测环境水样抗维甲酸激素干扰化合物 的前处理及酵母共孵育方法。其中，所述重组基因酵母为包含维甲酸激素受体基因片段，并 正确表达维甲酸激素受体的重组基因酵母。所述抗维甲酸激素干扰化合物选自酚类化合物 或其代谢后具有酚类结构的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药类化合物中的一 种或几种。
[0035] 包括如下步骤：
[0036] 2. 1培养重组基因酵母细胞：将酵母细胞接种到营养缺陷型SD/-Trp/-LeU培养基 中，培养12-36h，测定酵母细胞密度，要求十倍稀释后600nm处酵母菌液的吸光度值0D 6。。在 0· 35-0. 40 之间；
[0037] 2. 2环境水样采集及过滤：用洗净的玻璃瓶采集环境水样1-5L，低温4°C保存；采 用0. 7 μπι玻璃纤维滤膜过滤水样，去除水体中的悬浮颗粒物。
[0038] 2. 3水样与重组基因酵母共孵育：准确量取重组基因酵母细胞1-1. 5mL，离心，室 温下1000g离心5min，弃去上清液，将重组基因酵母细胞添加到含4. 5mL环境水样的三角瓶 中，加入0. 5mL溶液A和100mg葡萄糖以及添加9-顺维甲酸（9-cis RA);三角瓶经半透膜 封口后置于150rpm，30°C全温振荡培养箱中暴露培养2-4h后，测定0D_的值；
[0039] 在步骤2. 3中测定9-cis RA的暴露浓度，如图2所示，为9-cis RA对重组基因酵 母酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线，其中横坐标是9-cis RA浓度，纵坐标是百分诱 导酶活性值P ;9-cis RA的暴露浓度为1 X 10 13mol/L~1 X 10 6mol/L，优选9-cis RA的最 大效应浓度1X10 6mol/L为环境水样抗维甲酸激素干扰化合物检测的投加浓度；即体系中 9-cis RA的终浓度即为1 X 10 6mol/L，测试体系中添加25 μ L浓度为2 X 10 4mol/L的9-cis RA〇
[0040] 本发明还提供一种重组基因酵母酶活性检测方法，包括：孵育后的酵母细胞加入 含4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷（MUG)的反应液进行反应，反应生成荧光产物，终止 反应后检测上清液的荧光值来计算类/抗维甲酸激素化合物的浓度。
[0041] 具体步骤如下：
[0042] 3. 1荧光标记：取20-100 μ L孵育的重组基因酵母细胞，加入120 μ L测试缓冲液 (每100ml基础缓冲液中加入3. 33ml浓度为0· 1 %的SDS溶液和270 μ L β -巯基乙醇）和 20 μ L氯仿，在30°C的恒温摇床上1300rpm预培养lOmin ;再加入40 μ L 10 5mol/L MUG启 动酶反应，30°C，800rpm，0· 5-1小时后，加入100 μ L Na2C03 (lmol/L)溶液终止反应，终止反 应lOmin中后取出40ul至酶标板中用酶标仪测定其荧光值；
[0043] 如下表1所示，检测不同测试体积的重组基因酵母与系列MUG测试浓度反应后菌 液荧光强度值，优选重组基因酵母细胞的测试体积为20-100 μ L，对应MUG的测试浓度为 10 4-10 5mol/L ;反应产物也由荧光产物替代了传统0NPG显色产物，提高了方法的灵敏度， 降低了测试体系的检测限，见表1检测率；
[0044] 表1不同MUG反应浓度不同菌液体积检测到的荧光强度值，其中9-cis RA的暴露 终浓度为1X10 6mol/L。
[0045]
[0046] 注：当检出率〈100%时，不表征荧光强度值，标记为
[0047] 3. 2绘制诱导标准曲线：首先将上述重组基因酵母细胞分别与已知系列浓度 9-cis RA共培养，加入MUG反应液进行反应，终止反应后检测上清液的荧光值，并以此作为 表示β-半乳糖苷酶活性的参数，绘制系列9-cisRA浓度相对酵母细胞的β-半乳糖苷酶 活性诱导的剂量一效应关系标准曲线。
[0048] 具体步骤如下：
[0049] 将9-cis RA溶解到去离子水中，制备一系列的9-cis RA标准浓度反应液（浓度 范围1\1011~1父105111〇1/1)，取4.511〇-(^狀标准浓度反应液，加入离心后的酵母细 胞，0. 5mL溶液A和lOOmg葡萄糖，置于150rpm，30°C全温振荡培养箱中暴露培养2-4h后， 将孵育液接种至96孔板中（200 μ L/孔）测定0D_的值。取20-100 μ L孵育液至96孔 板，加入120 μ L测试缓冲液和20 μ L氯仿，30°C的恒温摇床1300rpm预培养lOmin ;加入 40以1^]\11^启动酶反应，30°(：，800印111，0.5-1小时后，加入10(^1^似20)3(1111〇1/1)溶液终止 反应，酶标仪测定荧光值，其中MUG的激发波长为360nm，吸收波长为450nm。并以此作为表 示β -半乳糖苷酶的参数，绘制9-cis RA对重组基因酵母细胞β -半乳糖苷酶活性诱导的 剂量一效应关系标准曲线。
[0050] 半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u = (As- ABV(t · V · D · 0DS)，式中，u 为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间（min) ;V为测试体积（mL) ;D为稀释因子；0DS为测 试样品在600nm处的吸光度值;AS为测试样品的荧光值;AB为空白对照的荧光值。百分诱 导酶活性P的计算公式如下：P = u/umaxX100%，式中，U为β-半乳糖苷酶活性，umax为最 大β -半乳糖苷酶活性，本文为IX 10 6mol/L9-cis RA(9-cis RA终浓度为IX 10 6mol/L) 诱导的酶活性。
[0051 ] 如图2所示，系列9-cis RA浓度相对重组基因酵母细胞的β -半乳糖苷酶活性诱 导的剂量一效应关系，当9-cis RA浓度为1 X 10 6mol/L时，酶活性值最高。
[0052] 实施例1
[0053] 利用基于重组基因酵母的环境水样维甲酸激素干扰化合物快速测试方法测定 9-cis RA的效应来绘制标准曲线。
[0054] 酵母细胞培养：将制备的重组基因酵母细胞接种到SD/-Trp/-LeU液体培养基中， 30°C空气浴摇床中培养12-36h，检测十倍稀释菌液在600nm处的吸光度值（以培养基为空 白）为 0· 35-0. 40。
[0055] 绘制标准曲线：将9-cis RA溶解到去离子水中，制备一系列的9-cis RA标准浓 度反应液1\1013~1\106111〇1/1。准确量取重组基因酵母细胞1-1.51^，室温，100(^离 心5min，弃去上清液，将重组基因酵母细胞添加到含4. 5mL9-cis RA标准浓度反应液中， 加入0. 5mL溶液A和lOOmg葡萄糖。三角瓶经半透膜封口后置于150rpm，30°C全温振荡培 养箱中暴露培养2-4h后，将孵育液接种至96孔板中，加入量为200 μ L/孔，测定0D6。。的 值。取20-100 μ L孵育液至96孔板，加入120 μ L测试缓冲液和20 μ L氯仿，30°C的恒温 摇床1300rpm预培养lOmin ;加入40 μ L MUG启动酶反应，30°C，800rpm，0· 5-1小时后，加入 100 μ L Na2C03 (lmol/L)溶液终止反应，酶标仪测定荧光值（MUG的激发波长为360nm，吸收 波长为450nm)。并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制9-cis RA对重组基因酵母细 胞β -半乳糖苷酶活性诱导的剂量一效应关系标准曲线，如图2。
[0056] β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u = (As- ABV(t · V · D · 0DS)，式中，u 为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间（min) ;V为测试体积（mL) ;D为稀释因子；0DS为测 试样品在600nm处的吸光度值;AS为测试样品的荧光值;A B为空白对照的荧光值。百分诱 导酶活性P的计算公式如下：P = u/umaxX100%，式中，U为β-半乳糖苷酶活性，umax为最 大β-半乳糖苷酶活性，本发明中为10 6m〇l/L9-Cis RA诱导的酶活性。
[0057] 由图2可知，9-cis RA对重组基因酵母细胞β -半乳糖苷酶活性诱导的剂量一 效应关系标准曲线的EC5。值为l·6X109mol/L，在lX10 12~lX106mol/L范围内存在剂 量-效应关系；优于国际报道的9-cis RA在重组酵母系统中EC5。大于10 smol/L的结果， 说明本发明建立的快速测试方法适用于环境水样中类维甲酸激素干扰化合物的检测，且与 报道的其它方法相比，本方法具有较高的灵敏度，初步表明该快速测试方法可以作为环境 水样维甲酸激素干扰化合物的定量检测方法。
[0058] 实施例2
[0059] 利用快速测试方法检测实际环境水样中的维甲酸激素干扰化合物。
[0060] 采集某市饮用水源地水样作为测试样品。采用快速测试方法对开展水样中维甲酸 激素干扰化合物的检测。利用实施例1中所述的快速测试方法检测环境水样中的维甲酸激 素干扰化合物，测定结果见图3。
[0061] 如图3所示，横坐标分别表示水样的诱导效应和水样的抑制效应，纵坐标表示酶 活性值，以去离子水作为空白对照，经计算，水样的抑制效应组与空白对照组P〈〇. 05,※表 明存在显著差异（P〈〇. 05)，由此可知，基于重组基因酵母的快速测试方法，在水体中未检测 出类维甲酸激素干扰化合物，检出抗维甲酸激素干扰化合物，与文献报道一致；与国际上基 于样品前处理的水样检测结果之间有很好的可比性，国际上对于样品前处理通常为固相萃 取方法，鲜有文献对水样中的抗维甲酸激素干扰化合物进行定量表征，因此，本文与国际报 道的定性结果进行比较。
[0062] 在以上的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是以上描述仅是 本发明的较佳实施例而已，本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，因此本 发明不受上面公开的具体实施的限制。同时任何熟悉本领域技术人员在不脱离本发明技术 方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的 变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本 发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技 术方案保护的范围内。
【主权项】
1. 一种环境水样维甲酸激素干扰化合物的快速测试方法，其特征在于，所述测试方法 基于重组基因酵母，包括如下步骤： (1) 培养重组基因酵母细胞； (2) 待测样品与重组基因酵母共孵育； (3) 重组基因酵母细胞酶活性测定。2. 根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（1)中，测定酵母细胞 密度，重组基因酵母细胞菌液十倍稀释后600nm处的吸光度值OD 6。。在0. 35-0. 40之间。3. 根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（2)中待测样品与重组 基因酵母共孵育振荡培养2-4h。4. 根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（2)中加入溶液A，所 述溶液A包括：0. 2g/L腺嘌呤半硫酸盐，0. 2g/L盐酸精氨酸，0. 2g/L -水合盐酸组氨酸， 0. 3g/L异亮氨酸，0. 3g/L盐酸赖氨酸，0. 2g/L甲硫氨酸，0. 5g/L苯丙氨酸，2g/L苏氨酸， 0. 3g/L酪氨酸，0. 2g/L尿啼啶，I. 5g/L缴氨酸，67g/L无氨基酸酵母氮源。5. 根据权利要求4所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（2)中还加入葡萄糖， 其终浓度为15~20g/L。6. 根据权利要求4所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（2)中重组基因酵母细 胞、待测样品、溶液A的体积比为2~3 :9 :1。7. 根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（2)之前对待测样品进 行过滤，去除待测样品中的悬浮颗粒物。8. 根据权利要求1-7任一所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（3)包括在孵育 好的重组基因酵母细胞中加入4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷（MUG)进行反应生成荧 光产物，测其荧光值，当重组基因酵母细胞的测试体积为20-100 μ L时，加入的MUG的测试 浓度为 10 4_1〇 5mol/L。9. 根据权利要求8所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（3)中检测反应终止后 上清液的荧光值，绘制标准曲线，计算待测样品中类维甲酸化合物的含量。10. 根据权利要求8任一所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤（2)中还加入 9-顺维甲酸（9-cis RA)，所述9-顺维甲酸的终浓度为lX106mol/L，所述步骤（3)中检测 反应终止后上清液的荧光值，绘制标准曲线，计算待测样品中抗维甲酸化合物的含量。
【文档编号】C12Q1/02GK105886591SQ201510038120
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】李剑, 王亚飞, 滕彦国, 王金生, 艾扬
【申请人】北京师范大学