一种基于食欲素受体1分子探针的药物活性成分筛选方法

文档序号:10528803
一种基于食欲素受体1分子探针的药物活性成分筛选方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域,公开了一种基于食欲素受体1分子探针的药物活性成分筛选方法,本发明采用荧光共振能量转移的方法建立了食欲素受体1分子探针,该分子探针具有高灵敏度,低噪音,高通量的特点,不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂,并且筛选过程不收下游信号的干扰;经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选,能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。
【专利说明】
一种基于食欲素受体1分子探针的药物活性成分筛选方法
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域,特别是一种基于食欲素受体I分子探针的药物活性成分筛选方法。
【背景技术】
[0002]常规的细胞水平、动物水平的药物筛选方法不仅费时、费力,而且容易受到多重因素的干扰,假阳性、假阴性率较高,也很难确定药物作用的靶点,并且需要大量的被筛选化合物进十年来,随着生物检测技术和计算机技术的快速发展,分子水平的药物筛选方法不断涌现,如:表面等离子体共振法、核磁共振法、下游信号分子检测法、荧光偏振法、虚拟筛选法等等,每种方法有自己的优缺点,都属于间接的筛选方法。至今还没有以受体空间构象变化为指针,可以直接、实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。

【发明内容】

[0003]本发明的目的在于提供一种基于食欲素受体I分子探针的药物活性成分筛选方法,根据受体空间构象变化为指针,可以直接、实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。
[0004]为实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明公开了一种基于食欲素受体I分子探针的药物活性成分筛选方法,筛选方法包括了以下步骤:
[0005]步骤1:构建的食欲素受体I分子探针:
[0006]A.采用PCR的方法将VSV-G tag及限制性内切酶位点分别引入人食欲素的cDNA的5’端,并用Over lapping PCR法将eCFP的cDNA连接到受体cDNA的3’端,将“受体-eCFP”连接至IJpcDNA5/FRT/T0 载体,从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受体-eCFP 质粒;
[0007]B.用突变法将质粒中受体第三内环中部的12个氨基酸置换为F IAsH片段:FLNCCPGCCMEP,从而得原始的分子探针质粒;
[0008]C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时,以表达受体分子探针,并用市售的受体激动剂激活探针,用高速荧光显微镜监测探针的灵敏度;
[0009]D.根据探针灵敏度的监测结果,对探针进行结构优化;
[0010]步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1n T-Rex HEK293细胞系:
[0011]A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1n T-Rex HEK293细胞,并用200ug/ml Hygromycin筛选阳性细胞克隆;
[0012]B.用lug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针,用VSV抗体检测探针蛋白的表达,用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位;
[0013]C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-Rex HEK293细胞,得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线,并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。
[0014]其中,步骤I中对探针进行结构优化具体如下:
[0015]调整受体C末端非a螺旋区的长度:将受体C末端有65个氨基酸截短为50个氨基酸;优化前探针的eCFP位于受体氨基酸的425位置,优化后探针的eCFP位于受体氨基酸的410位置;调整FLNCCPGCCMEP片段在受体第三内环的位置:将受体第三内环截短,将FLNCCPGCCMEP片段置于受体氨基酸的252-286之间的位置。
[0016]本发明具有以下有益效果:
[0017]1.本发明采用荧光共振能量转移的方法建立了食欲素受体I分子探针,该分子探针具有高灵敏度,低噪音,高通量的特点,不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂,并且筛选过程不受下游信号的干扰。
[0018]2.经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选,能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。
【附图说明】
[0019]图1为本发明分子探针的结构示意图。
[0020]图2为本发明实施例2的结果示意图。
【具体实施方式】
[0021]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。
[0022]实施例1
[0023]如图1所示,本发明公开了一种基于食欲素受体I分子探针的药物活性成分筛选方法,筛选方法包括了以下步骤:
[0024]步骤1:构建的食欲素受体I分子探针:
[0025]A.采用PCR的方法将VSV-G tag及限制性内切酶位点分别引入人食欲素的cDNA的5’端,并用Over lapping PCR法将eCFP的cDNA连接到受体cDNA的3’端,将“受体-eCFP”连接至IJpcDNA5/FRT/T0 载体,从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受体-eCFP 质粒;
[0026]B.用突变法将质粒中受体第三内环中部的12个氨基酸置换为FlAsH片段:FLNCCPGCCMEP,从而得原始的分子探针质粒;
[0027]C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时,以表达受体分子探针,并用市售的受体激动剂激活探针,用高速荧光显微镜监测探针的灵敏度;
[0028]D.根据探针灵敏度的监测结果,对探针进行结构优化,调整受体C末端非a螺旋区的长度:将受体C末端有65个氨基酸截短为50个氨基酸;优化前探针的eCFP位于受体氨基酸的425位置,优化后探针的eCFP位于受体氨基酸的410位置;调整FLNCCPGCCMEP片段在受体第三内环的位置:将受体第三内环截短,将FLNCCPGCCMEP片段置于受体氨基酸的252-286之间的位置;
[0029]步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1nT-Rex HEK293细胞系:
[0030]A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1n T-Rex HEK293细胞,并用200ug/ml Hygromycin筛选阳性细胞克隆;
[0031]B.用lug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针,用VSV抗体检测探针蛋白的表达,用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位;
[0032]C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-Rex HEK293细胞,得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线,并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。
[0033]实施例2
[0034]实验目的及方法:为了验证本发明制备分子探针的可行性和有效性,本实施例分别以生理盐水、阳性对照药物OXA和天麻粗提物分别研究三者对食欲素受体I分子探针荧光共振能量转移变化,具体的实验方法如实施例1所述,此处不再赘述。
[0035]实验结果:如图2所示,将表达食欲素受体I分子探针的细胞置于高速荧光显微镜下,分别用生理盐水、阳性对照药物和天麻粗提物处理细胞,监测食欲素受体I分子探针的荧光共振能量转移变化,实验证明食欲素受体I分子探针能对生理盐水并无明显反应、对阳性药物OXA发生高灵敏度的反应,对天麻粗提物也有与阳性药物OXA相似的反应,可以初步证明天麻粗提物含有激活食欲素受体I分子探针的活性成分。
[0036]以上所述,仅为本发明较佳的【具体实施方式】,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种基于食欲素受体I分子探针的药物活性成分筛选方法,其特征在于,所述的筛选方法包括了以下步骤: 步骤I:构建的食欲素受体I分子探针: A.采用PCR的方法将VSV-Gtag及限制性内切酶位点分别引入人食欲素的cDNA的5 ’端,并用Over lapping PCR法将eCFP的cDNA连接到受体cDNA的3 ’端,将“受体-eCFP”连接到pcDNA5/FRT/T0 载体,从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受体-eCFP 质粒; B.用突变法将质粒中受体第三内环中部的I2个氨基酸置换为F IAsH片段:FLNCCPGCCMEP,从而得原始的分子探针质粒; C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时,以表达受体分子探针,并用市售的受体激动剂激活探针,用高速荧光显微镜监测探针的灵敏度; D.根据探针灵敏度的监测结果,对探针进行结构优化; 步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1n T-Rex HEK293细胞系: A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1nT-Rex HEK293细胞,并用200ug/ml Hygromycin筛选阳性细胞克隆; B.用lug/mlDoxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针,用VSV抗体检测探针蛋白的表达,用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位; C.用受体激动剂处理的已经表达的受体分子探针Flp-1nT-RexHEK293细胞,得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线,并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。2.如权利要求1所述的一种基于食欲素受体I分子探针的药物活性成分筛选方法,其特征在于:所述的步骤I中对探针进行结构优化具体如下: 调整受体C末端非a螺旋区的长度:将受体C末端有65个氨基酸截短为50个氨基酸;优化前探针的eCFP位于受体氨基酸的425位置,优化后探针的eCFP位于受体氨基酸的410位置;调整FLNCCPGCCMEP片段在受体第三内环的位置:将受体第三内环截短,将FLNCCPGCCMEP片段置于受体氨基酸的252-286之间的位置。
【文档编号】C12N15/62GK105886592SQ201610117884
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月2日
【发明人】徐天瑞, 杨洋, 刘莹, 程德琴
【申请人】昆明理工大学
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