一种基于五羟色胺受体2a分子探针的药物活性成分筛选方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，公开了一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法，包括了构建五羟色胺受体2A分子探针和建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp?In T?Rex HEK293细胞系，采用荧光共振能量转移的方法建立了五羟色胺受体2A分子探针，该分子探针具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不受下游信号的干扰；经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选，能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。
【专利说明】
一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，特别是一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法。
【背景技术】
[0002]常规的细胞水平、动物水平的药物筛选方法不仅费时、费力，而且容易受到多重因素的干扰，假阳性、假阴性率较高，也很难确定药物作用的靶点，并且需要大量的被筛选化合物。近十年来，随着生物检测技术和计算机技术的快速发展，分子水平的药物筛选方法不断涌现，如:表面等离子体共振法、核磁共振法、下游信号分子检测法、荧光偏振法、虚拟筛选法等等，每种方法有自己的优缺点，都属于间接的筛选方法。至今还没有以受体空间构象变化为指针，可以直接、实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法，根据受体空间构象变化为指针，可以直接、实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。
[0004]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法，筛选方法包括了以下步骤:
[0005]步骤I:构建五羟色胺受体2A分子探针:
[0006]A.用PCR的方法将VSV-G tag及限制性内切酶位点分别引入人五羟色胺受体的cDNA的5 ’端，并用Over lapping PCR法将eCFP的cDNA连接到受体cDNA的3 ’端，将“受体-eCFP” 连接到 pcDNA5/FRT/T0 载体，从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受体-eCFP 质粒；
[0007]B.用突变法将质粒中受体第三内环中部的12个氨基酸置换为FlAsH片段:FLNCCPGCCMEP，从而得原始的分子探针质粒；
[0008]C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时，以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度；
[0009]D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化；
[0010]步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1n T-Rex HEK293细胞系:
[0011]A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1n T-Rex HEK293细胞，并用200ug/mlHygromycin筛选阳性细胞克隆；
[0012]B.用lug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位；
[0013]C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。
[0014]其中，步骤I中对探针进行结构优化具体如下:
[0015]将CFP荧光基团接于五羟色胺受体C端第471氨基酸之后，调整FLNCCPGCCMEP片段在受体上的位置:在五羟色胺受体第269氨基酸残基之后，用FLNCCPGCCMEP片段取代第270-309位氨基酸残基。
[0016]本发明具有以下有益效果:
[0017]1.本发明采用荧光共振能量转移的方法建立了五羟色胺受体2A分子探针，该分子探针具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体激动剂也能筛选措抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不受下游信号的干扰。
[0018]2.经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选，能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。
【附图说明】
[0019]图1为本发明分子探针的结构示意图。
[0020]图2为本发明实施例2的结果示意图。
【具体实施方式】
[0021]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
[0022]实施例1
[0023]如图1所示，本发明公开了一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法，筛选方法包括了以下步骤:
[0024]步骤I:构建五羟色胺受体2A分子探针:
[0025]A.用PCR的方法将VSV-G tag及限制性内切酶位点分别引入人五羟色胺受体的cDNA的5 ’端，并用Over lapping PCR法将eCFP的cDNA连接到受体cDNA的3 ’端，将“受体-eCFP” 连接到 pcDNA5/FRT/T0 载体，从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受体-eCFP 质粒；
[0026]B.用突变法将质粒中受体第三内环中部的12个氨基酸置换为FlAsH片段:FLNCCPGCCMEP，从而得原始的分子探针质粒；
[0027]C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时，以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度；
[0028]D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化;将CFP荧光基团接于五羟色胺受体C端第471氨基酸之后，调整FLNCCPGCCMEP片段在受体上的位置:在五羟色胺受体第269氨基酸残基之后，用FLNCCPGCCMEP片段取代第270-309位氨基酸残基。
[0029]步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1n T-Rex HEK293细胞系:
[0030]A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1n T-Rex HEK293细胞，并用200ug/mlHygromycin筛选阳性细胞克隆；
[0031]B.用lug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位；
[0032]C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。
[0033]实施例2
[0034]实验目的及方法:为了验证本发明制备分子探针的可行性和有效性，本实施例分别以生理盐水、阳性药物DOI和钩藤粗提物分别研究三者对五羟色胺受体2A分子探针荧光共振能量转移变化，具体的实验方法如实施例1所述，此处不再赘述。
[0035]实验结果:如图2所示，将表达五羟色胺受体2A分子探针的细胞置于高速荧光显微镜下，分别用生理盐水、阳性药物DOI和钩藤粗提物处理细胞，监测五羟色胺受体2A分子探针的荧光共振能量转移变化，实验证明五羟色胺受体2A分子探针能对生理盐水并无明显反应、阳性药物DOI发生高灵敏度的反应，对钩藤粗提物也有与阳性药物DOI相似的反应，可以初步证明钩藤粗提物含有作用于五羟色胺受体2A分子探针的活性成分。当阳性药物DOI作用于探针时(第15s开始)，FRET信号值升高(第15s至30s)，当撤去药物(31s后)FRET信号值恢复，说明激动剂DOI与五羟色胺受体2A分子探针的结合使探针的两个荧光基团空间距离缩小，增加了能量转移。当钩藤粗提物作用于探针时(第15s开始)，FRET信号值降低(第15s至30s)，当撤去药物(31s后)FRET信号值得到恢复，说明钩藤粗提物中的成分与五羟色胺受体2A分子探针的结合使探针的两个荧光基团空间距离增大，降低了能量转移。
[0036]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括了以下步骤: 步骤I:构建五羟色胺受体2A分子探针: A.用PCR的方法将VSV-Gtag及限制性内切酶位点分别引入人五羟色胺受体的cDNA的5 ’端，并用Over lapping PCR法将eCFP的cDNA连接到受体cDNA的3 ’端，将“受体-eCFP”连接至IJpcDNA5/FRT/TO 载体，从而得到 pcDNA5/FRT/TO_VSV-受体-eCFP 质粒； B.用突变法将质粒中受体第三内环中部的I2个氨基酸置换为F IAsH片段:FLNCCPGCCMEP，从而得原始的分子探针质粒； C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时，以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度； D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化； 步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1n T-Rex HEK293细胞系: A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1nT-Rex HEK293细胞，并用200ug/ml Hygromycin筛选阳性细胞克隆； B.用lug/mlDoxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位； C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-RexHEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。2.如权利要求1所述的一种基于五羟色胺受体2A分子探针的药物活性成分筛选方法，其特征在于:所述的步骤I中对探针进行结构优化具体如下: 将CFP荧光基团接于五羟色胺受体C端第471氨基酸之后，调整FLNCCPGCCMEP片段在受体上的位置:在五羟色胺受体第269氨基酸残基之后，用FLNCCPGCCMEP片段取代第270-309位氨基酸残基。
【文档编号】C12N15/85GK105886593SQ201610117996
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月2日
【发明人】徐天瑞, 杨洋, 刘莹, 郭景明
【申请人】昆明理工大学