毛细管电泳和质谱联用的直接rna测序技术的制作方法

文档序号:10528809阅读:912来源:国知局
毛细管电泳和质谱联用的直接rna测序技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种直接对RNA的序列及其化学修饰同时进行测定的技术。和DNA相比,对RNA上化学修饰的研究相对滞后,其主要原因在于没有一种方便精准的方法检测这些化学修饰。本发明针对现行间接RNA测序技术的种种问题,直接对RNA进行序列测定。先将RNA降解成长短不一的梯坎RNA片段,再用毛细管电泳和质谱联用分析检测这些降解的RNAs。每一个降解的梯坎RNA片段都对应着不同的迁移时间和不同的质谱值。把这些长短不一的梯坎RNA片段从小到大排序,再用这些梯坎RNA片段之间质谱差值来计算原RNA从5`和3`的碱基序列。本技术不仅可以直接对常规的RNA测序,而且可以同时测定这些RNA上的化学修饰。
【专利说明】
毛细管电泳和质谱联用的直接RNA测序技术
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种直接对RNA的序列和RNA上的化学修饰同时进行测定的技术
【背景技术】
[0002] 化学修饰在生物学中有着举足轻重的作用。基因组DNA和组蛋白上都存在可逆的 表观遗传学修饰,这些修饰可调控基因的表达,并由此决定细胞的状态,影响细胞的分化和 发育。近年来人们发现,mRNA和其他RNA上也存在类似的调控机制。与基因组DNA上的化 学修饰相比,生物学中RNA上的化学修饰更多。讫今为止已发现一百多种化学修饰,但绝大 多数修饰的功能还不为人知。尽管人们对RNA上化学修饰的兴趣日增,但研究这些化学修 饰的工具却很有限。现行的RNA测序技术需要将RNA转变成其cDNA,通过测定cDNA序列再 反推出RNA序列。有关RNA上的化学修饰的信息在合成cDNA和测序过程中已经丢失,使现 行的RNA测序技术无法检测这些RNA上的化学修饰。最近报道一些针对RNA上甲基的分析 检测方法-例如m6A,但这些方法只实用于一种特定的RNA化学修饰,缺乏广普性。
[0003] 为了研究RNA上各种化学修饰对不同生物学过程的调控,我们必须首先有工具可 用来去探测在RNA上有哪些种类的化学修饰;其次,我们需要有工具可用来去检测这些种 化学修饰在RNA上的位置;还有,我们需要对RNA上的各种化学修饰进行定量分析。有了这 样的分析检测工具,研究人员们才可能去准确地探究这些RNA上化学修饰对各种生物学过 程调控机制,从而对致病机理有更全面的了解,最终找到有效的治疗方法。
[0004] 毛细管电泳和质谱(CE/MS)联用技术大大拓宽了毛细管电泳和质谱本身的应用 领域,其在蛋白质组学、化学药物研究、临床实验诊断以及法医学等领域均已显示了广阔的 前景,正成为分析工作者的重要工具之一。因此,该联用技术被引用到RNA序列测定,成为 了本发明技术的主要分析检测仪器。

【发明内容】

[0005] 本发明针对现行的RNA测序技术的上述种种问题提供一种直接对RNA进行序列测 定的方法。与现行的间接RNA测序技术不同,本发明不需要合成cDNA,也不需要合成其它任 何互补DNA/RNA,这样就可以直接分析检测这些RNA上的各种化学修饰。与此同时,本发明 技术也可同时测定正常RNA序列。
[0006] 本发明的提供一种操作简单,却快速准确的RNA测序方法,直接对RNA的序列和 RNA上的各种化学修饰同时进行测定。该发明说明书涵盖测序的全过程,包括RNA样品准 备,RNA样品的降解,毛细管电泳和质谱联用检测降解的RNA样品,数据分析和序列形成。其 技术方案是:第一步,将RNA样品用化学品或生物酶降解成长短不一的梯坎RNA片段,在此 过程中需要控制RNA的降解程度以达到(1):降解断链只发生在磷酸二脂键的3'-P和5'-0 之间,不在碱基上;(2):每条RNA链上的所有链磷酸二脂键都可能被降解,但实际上却只有 一个被降解;(3)此降解是随机,可发生在RNA链的任何一个链磷酸二脂键上。这样,这些 降解后长短不一的梯坎RNA片段之间质谱差值可用来计算出其3'或5'的末端碱基名称 (A/C/G/U);第二步,将降解的RNA样品进行毛细管电泳和质谱联用分析测试,每一个降解 的长短不一的梯坎RNA片段都对应着不同的迁移时间(Migration Time)和不同的质谱值 (Mass)第三步,把这些长短不一的梯坎RNA片段根据其独特的迁移时间和各自不同的质谱 值从小到大排序,再用这些梯坎RNAs之间质谱差值可用来计算原RNA从5'和从3'的碱基 序列。
[0007] 质谱差值可用来计算碱基序列实例:
[0008] 329. 0525 (A)
[0009] 345. 0474 (G)
[0010] 305.0413 (C)
[0011] 306.0253 (U)
[0012] 除最3'末端碱基外,如果质谱差值不同于上述4个正常RNA的碱基,这说明此处 核甘酸上有化学修饰。其化学修饰的类别可用其独特的Mass来推断。
[0013] 例如:
[0014] 319. 0554 (甲基化的 C)
[0015] 359.0512 (甲基化的 G)
[0016] 308.0543 (氢化的 U)
[0017] 因此,本发明不仅可对正常RNA进行序列测定,也可对有化学修饰的RNA进行序列 测定。而且此测序技术可以读解出关于RNA上各种化学修饰的许多详尽的信息,包括RNA 上有哪些种类的化学修饰,这些化学修饰在RNA的什么地方,各有几种这样的化学修饰。而 现有的RNA测序方法很难回答这些问题。
[0018] 具体实施办法:
[0019] 实施例1 :毛细管电泳和质谱联用的直接RNA测序技术测定
[0020] (一)降解 RNA
[0021] 在0·2-l·0mlEppendorf试管中先加于l-5μlRNA(l·0-100μM),然后加于酸性 物质-例如50%的甲酸或者1 %的三氟乙酸,將此混合物置于20-60°C,反应3. 0-60分钟。 在此过程需要控制RNA的降解条件以达到(1):降解断链只发生在磷酸二脂键的3'-P和 5'-0之间,不在碱基上;(2):每条RNA链上的所有链磷酸二脂键都可能被降解,但实际上却 只有一个被降解;(3)此降解是随机,可发生在RNA链的任何一个链磷酸二脂键上。此反应 混合物先在干冰中冷冻5-10分钟,待其完全凝固,然后將其放入冷冻干燥器抽干。一般对 25nt左右长的RNA降解不宜超过5分钟。
[0022] (二)毛细管电泳和质谱联用分析测试降解的RNA
[0023] 將冷冻干燥后的RNA溶于1. 0-5. 0 μ 1去离子水中,用0. 1-1. 0 μ 1溶液做毛细管 电泳和质谱(Agilent 7100CE-6520 Q-TOF MS)联用分析测试降解的RNA。在注入样品前,先 用淋洗液(30%甲醇,0. 5%甲酸的水溶液)冲洗硅胶填充的毛细管(90cm长,内径75 μ m) 3 分钟。RNA样品在lpsi的压力下注入,注射时间长约5-100秒。毛细管电泳的条件是:温度 40°C ;场强500V/cm。测试后先用0. 1M NaOH清洗毛细管5分钟,然后用水和淋洗液各洗5 分钟。毛细管电泳的洗脱物直接进入ESI (-)-QT0F,进行质谱分析。干燥氮气温度为325°C, 流速为8. OL/Min,雾化器压力为35psig,毛细管电压为3500V.
[0024](三)数据分析和产生序列
[0025] 每一个降解的长短不一的梯坎RNA都对应着不同的迁移时间(Time)和不同的质 谱值(Mass);把这些长短不一的梯坎RNA从小到大排序,再用这些梯坎RNAs之间质谱差值 可用来计算出原RNA从5'和从3'的碱基序列。
[0026] (四)含2' -0化学修饰组份的RNA的分析检测
[0027] 若数据分析过程中发现了上述质谱差值是两倍或多倍于单个核甘酸的质量,则可 將RNA降解时间延长至2小时,再对所得的长于单个核甘酸的RNA片段进行MS/MS分析以 解读出例如二核甘酸的5'端和3'端的碱基序列以及2'-0上的化学修饰组份。
[0028] (五)含假尿苷(Pseduouridine)的RNA的分析检测法
[0029] 因尿苷和假尿苷具备同一质量,所以对疑有假尿苷修饰的RNA先用30 μ 1的41 % 乙醇/1. 1Μ乙酸三乙銨和4μ 1的乙烯氰处理,在70°C反应2小时。所得RNA再用正常方法 进行测序分析。
【主权项】
1. 一种直接对RNA的序列和RNA上的化学修饰同时进行测定的技术,直接將RNA降 解成长短不一的梯坎RNA片段,再用化学方法进行分离和质谱联用分析来检测这降解的 RNAs。每一个降解的长短不一的梯坎RNA片段都对应着不同的分离时间和不同的质谱值。 把这些长短不一的梯坎RNA片段根据其独特的分离时间和各自不同的质谱值从小到大排 序,再用这些梯坎RNA片段之间质量差值可用来计算出原RNA从5'和从3'的碱基序列。因 为这些梯坎RNA片段之间质量差值也可反映出核苷酸上的化学修饰,因此可在测定RNA序 列的同时分析检测RNA上的各种化学修饰。2. 根据权利要求1所述的方法,其特征是:直接对RNA的序列和RNA上的化学修饰同 时进行测定,而无需合成cDNA或互补DNA/RNA。3. 根据权利要求1所述的方法,直接將RNA降解成长短不一的梯坎RNA片段的方法特 征为:以50%的甲酸或者1 %的三氟乙酸对RNA进行降解。RNA样本的长度由1至30核酸 不等,浓度要求由1.0-100 μ M不等。4. 根据权利要求1,2和3所述的方法,对梯坎RNA片段进行化学方法分离的特征是: 毛细管电泳5. 根据权利要求1,2, 3和4所述的方法,对已被分离的梯坎RNA片段进行分析检测的 特征是:质谱协同紫外光分析。6. 根据权利要求1,2, 3,4和5所述的方法,其特征是:本发明还需和MS/MS方法联用 来分析2' -O上有修饰化学组份。7. 根据权利要求1,2, 3,4, 5和6所述的方法,其特征是:本发明还需先用乙烯氰处理 RNA的方法来分析假尿苷(Pseduouridine)。
【文档编号】C12Q1/68GK105886598SQ201410421175
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年8月25日
【发明人】张盛龙
【申请人】张盛龙
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1