用于检测甘草β-AS基因单核苷酸多态性的引物组合物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测甘草β-AS基因单核苷酸多态性的引物组合物、试剂盒及方法。该方法以包含β-AS基因的待测甘草全基因组DNA为模板，以特异引物对(共18对)为引物，PCR扩增甘草β-AS基因的15个外显子区和4个内含子区；再对扩增产物片段进行SSCP多态性检测并对产物进行测序分析。该发明是一种在DNA水平上筛查和检测与甘草酸合成密切相关的分子标记，检测方法简单、快速、成本低，检测结果可靠、直接，适用于β-AS基因SNPs的大规模筛查，对于发掘优良、筛除劣质的甘草种质资源，提高栽培甘草药材的质量有重要意义。
【专利说明】
用于检测甘草β-AS基因单核苷酸多态性的引物组合物、 试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及甘草的功能基因的单核苷酸多态性（SNP)的检 测，特别涉及一种检测甘草β -AS基因的单核苷酸多态性的引物组合物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch是我国常用的大宗药材。多年以来，商品甘 草一直依靠野生资源提供，然而由于多年掠夺性采挖，甘草野生资源日趋枯竭，栽培生产甘 草目前已经成为甘草药材商品的主要来源。甘草酸是甘草药材的重要药效成分，然而研究 表明，大部分栽培甘草中的甘草酸含量低于野生甘草，达不到2010版《中国药典》中2. 0% 的合格标准，严重影响了中医临床疗效和制药工业的原料质量。在相同栽培条件下生产的 甘草药材，不同单株间甘草酸含量存在显著的差异。结合目前栽培甘草种子来源于野生甘 草的现状，栽培甘草群体中单株之间甘草酸差异如此显著必定是由遗传变异导致。β -香树 脂醇合成酶（β-AS)基因作为甘草酸合成途径下游最为关键的功能基因，其编码的β-AS 能够催化2, 3-氧化鲨烯环化生成β -香树酯醇进而形成甘草酸，因此其结构和表达很可能 会直接影响到甘草酸的合成。
[0003] SNPs (single nucleotide polymorphisms)主要是指在基因组水平上由单个核苷 酸的变异所引起的DNA序列多态性。其为动植物可遗传的变异中最常见的一种。占所有已 知多态性的90%以上。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个 碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后 两种情况。根据分子生物学中心法则，SNPs会导致基因碱基序列的改变，理论上有可能影响 mRNA的表达及其结构，进而影响酶蛋白的结构，导致酶活性的改变，最终导致代谢途径终产 物含量的改变。
[0004] 目前SNP的检测技术有很多，有DNA序列测定法、SNaPshot法、Microarray芯片 法、引物延伸法、PCR-SSCP法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、高分辨率溶解曲线法等。本发明 米用的是DNA测序与-SSCP结合法。PCR-SSCP(Polymerase Chain Reaction-Single-Strand Conformation Polymorphism)的基本原理是将PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度 下进行高温处理并使之保持在单链状态下，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳时， 单链DNA的迀移率除与DNA链的长度有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在 非变性条件下，DNA单链可折叠成一定的空间构象，这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定 性靠分子内局部顺序的相互作用维持。相同长度DNA单链因其碱基序列不同，甚至单个碱 基不同导致形成的构象不同，而且单链DNA构象的变化很可能引起迀移率的改变。在凝胶 中，每条单链处于一定位置，靶DNA中若出现突变，就会出现泳动变位，通过显色或显影后， 在凝胶上就会显示出带型的差别，从而将变异DNA与正常DNA区分开。PCR-SSCP法检测灵 敏度高，能够检测出lbp的小缺失和突变，且操作步骤少、周期短，适用于对大量样本的突 变筛选。利用PCR-SSCP方法找到SNPs位点所存在的基因片段，再对该基因片段进行测序， 二者综合分析能够明确找到甘草β -AS基因的特化基因型，且使得实验结果更具可靠性。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的问题在于利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测甘草β -AS基因的 单核苷酸多态性，该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与甘草酸合成密切相关的分子标 记，能够准确、快速的检测出甘草β-AS基因的多态性位点，进而为发掘优良、筛除劣质的 甘草种质资源提供依据。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007] 甘草β -AS基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括：
[0008] 甘草β -AS基因第94bp为A、G、A/G的碱基多态性；在506bp为C或C/G的碱基 多态性；在512bp为C或C/G的碱基多态性。
[0009] 上述检测甘草β -AS基因的单核苷酸多态性的方法为：
[0010] 以甘草β-AS基因组DNA为模板，利用特异性引物PCR扩增甘草β-AS基因15个 外显子和4个内含子片段，然后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物单链构象并进行测 序分析，即可准确鉴定甘草β -AS基因的单核苷酸多态性。
[0011] 所述的引物对见表1 :
[0012] 表 1
[0013]
[0014] 所述的PCR扩增的条件是：
[0015] PCR 反应体系：PCR 反应体系共 20yL :基因组 DNA1 yL，10XPCR buffer3. 2yL， dNTP(2. 5mmol/L)1. 6 μ L, Forward Primer(5 μ mol/L)1. 0 μ L, Reverse Primer(5 μ mol/ L) 1. 0 μ L，rTaqO. 2 μ L，ddH20 12. 0 μ L。
[0016] 所述的PCR扩增反应程序为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，56°C退火lmin， 72°C延伸 lmin30s，34 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0017] 所述的琼脂糖凝胶电泳为1%琼脂糖凝胶电泳。
[0018] 所述的聚丙烯酰胺电泳为16%聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0019] 所述根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳带型及多态产物测序结果，可将甘草β -AS 基因可分为
[0020] 94A/G-506C-512C、94G-506C-512C、94A/G-506C/G-512C、94A-506C-512C、94A/ G-506C/G-512C/G、94G-506C-512C/G 和 94A/G-506C-512C/G7 种基因型。
[0021] 针对上述甘草β-AS基因核苷酸多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通 过PCR-SSCP与DNA测序结合法能够快速、精确、低成本的检测其SNPs位点。由于β -AS基 因是甘草酸合成途径中的关键酶基因，本发明提供的检测方法为β -AS基因的SNPs与甘草 酸合成关系的建立提供了依据，以便于推广应用于甘草优良种质资源的评价与筛选。
[0022] 本发明还涉及一种用于实施本发明所述方法的专用试剂盒，所述试剂盒内容包 括：
[0023] 一、试剂盒引物成分：
[0024] 1. 1特异引物，所述的特异引物包括内容见表1 ;
[0025] 1. 2生化试剂，所述生化试剂包括：
[0026] rTaq 聚合酶；ddH20 ;
[0027] 内含 Mg2+的 lOXBuffer ;dNTP ;
[0028] 2000bp 的 DNAMarker。
[0029] 二、试剂盒操作说明：
[0030] 2.1PCR操作说明
[0031] (l)PCR扩增反应体系
[0032] 基因组 DNA1 μ L，10XPCR buffer3. 2 μ L，dNTP(2. 5mmol/L) 1. 6 μ L，Forward Primer (5 μ mol/L)(序列见表 1) 1. 0 μ L，Reverse Primer (5 μ mol/L)(序列见表 1) 1. 0 μ L， rTaqO. 2 μ L, ddH2012. 0 μ L〇
[0033] (2) PCR扩增反应程序
[0034] 94°(：预变性5111丨11;94°(：变性3〇8,56°(：退火1111丨11，72°(：延伸1111丨113〇8,34个循环 ； 72°C 延伸 10min。
[0035] 2· 2电泳检测与基因型判断
[0036] (1) PCR产物的琼脂糖电泳检测
[0037] 扩增得到长度在100_350bp的PCR产物，经用1 %的琼脂糖电泳检测，条带清晰、明 壳、单一，见图1、2所不。
[0038] (2) PCR 产物的 SSCP 分析
[0039] 对每个个体扩增片段变性处理之后，进行16 %聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，其个体 会出现不同带型，见图3、5所示。
[0040] (3)根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳带型及多态产物测序结果，可将甘草β -AS 基因可成不同基因型，如图4、6所示。
【附图说明】
[0041] 图1 94bp位置SNP位点片段基因琼脂糖凝胶电泳图1 · DNA marker (DL2000); 2. 94bp位置SNP位点片段PCR产物；图2第二、三、四内含子基因琼脂糖凝胶电泳图a: l.DNA marker(DL2000)，2.第二内含子PCR产物；b :LDNA marker(DL2000)，2.第三内含子 PCR产物；c :1. DNA marker (DL2000)，2.第四内含子PCR产物；图3 11份甘草样品94bp位 置PCR产物SSCP结果；图494bp位置SNPs位点测序峰图及基因分型；图5. 12份甘草样品 第二内含子PCR产物SSCP结果；图6第二内含子SNPs位点测序峰图及基因分型。
[0042] 具体步骤
[0043] 1、甘草DNA提取
[0044] 提取甘草的全基因组DNA，保存于_20°C备用。
[0045] 2、引物设计
[0046] 根据已经获得的甘草β-AS基因全长序列，以提取的DNA作为模板，以表1中所列 引物分别PCR扩增β-AS基因15个外显子和4个内含子的基因片段。
[0047] 3、PCR反应体系
[0048] PCR 反应体系共 20 μ L :基因组 DNA1 μ L，10XPCR buffer3. 2 μ L，dNTP(2. 5mmol/ L) 1. 6 μ L，Forward Primer (5 μ mol/L)(序列见表 1) 1. 0 μ L，Reverse Primer (5 μ mol/L) (序列见表 1) 1. 〇 μ L，rTaqO. 2 μ L，ddH2012. 0 μ L。
[0049] 4、PCR反应条件：由于SSCP对于PCR产物纯度要求较高，PCR产物纯度越高，SSCP 分析中出现的杂带数量越少，越利于目标条带的判断；为取得良好的分辨效果，在不影响 PCR效率的前提下尽可能提高反应的退火温度，以降低非特异性扩增及引物二聚体对SSCP 带来的影响，设计的反应条件有以下3种：
[0050] (1)94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 个循 环；72°C延伸 lOmin ;
[0051] (2)94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 个循 环；72°C延伸 lOmin ;
[0052] (3)94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 个循 环；72°C延伸 lOmin ;
[0053] PCR反应完成后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物条带长度和特异性。
[0054] 5、SSCP 体系
[0055] (1)胶浓度：由于不同片段长度的PCR产物所适用的胶的浓度不同，为确定最适合 100-300bp长度范围PCR产物的胶浓度，共设置6种浓度梯度，见表2 :
[0056] 表2 6种浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶
[0057]
[0058] 在相同电泳条件及电泳时间下，使用如上表中所列6种不同浓度的聚丙烯酰胺凝 胶，对同一份长度范围在100_300bp的PCR产物进行PCR-SSCP分析，通过条带的位置及条 带的分离度以确定本实验中所适用的最佳胶浓度。
[0059] (2)上样量：根据所设计的甘草β-AS基因外显子片段引物，在合适的退火温度下 进行PCR扩增，扩增产物用1 %的琼脂糖凝胶进行水平电泳检测，上样量为5 μ L ;使用紫外 检测器检测PCR产物浓度。
[0060] (3)电泳条件：由于电泳电压以及电泳时间与SSCP谱带的位置及分离度密切相 关，故设计不同的电泳电压与电泳时间组合：A. 120V电压下电泳9小时；B. 140V电压电泳9 小时。
[0061] 结果分析：本发明设计的引物可完整扩增β -AS基因外显子和1-4内含子的全长， 运用的PCR-SSCP法可准确、快速的找到该段基因上所有的SNP位点，并可联合所有SNP位 点划分基因型。
[0062] 最终确定的PCR反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，56°C退火lmin， 72°C延伸 lmin30s，34 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0063] SSCP胶浓度：8-12%浓度的胶中各条带的分离度差，无法满足本实验要求，故不 允考虑（结果未列出）。
[0064] 14%胶浓度下SSCP分辨率低，无法分辨出目标条带的差异，18%胶浓度下，能够 分辨出目标条带的差异，但由于分辨率较高，极容易出现杂带，不利于对主带的判断和分 析，故该实验中选用16 %胶浓度。
[0065] SSCP上样量：分别使用1-3 μ L PCR产物，然后在PCR管底部加入变性缓冲液至 10 μ L，PCR产物上样量为3 μ L时，谱带清晰明显，达到SSCP分析要求，故将变性体系定为 3 μ L PCR扩增产物与7 μ L变性缓冲液相混合。
[0066] SSCP电泳条件：120V电压下电泳9小时，条带分离度较差；140V电压电泳9小时， 条带分离度良好。
[0067] 故本实验选用140V电压下电泳10小时。
[0068] 根据SSCP结果，发现15个外显子中仅有第一外显子94bp位置PCR产物的SSCP 条带具有明显差异，其他外显子PCR产物的SSCP条带未见明显差异；4个内含子中仅有第 二内含子PCR产物的SSCP条带具有明显差异，其他外显子PCR产物的SSCP条带未见明显 差异。
[0069] 将所获得的PCR产物交由上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果显示甘 草β -AS基因第一外显子上94bp位置存在SNPs，可分为94G型，94A型，94A/G杂交型3 种类型；第二内含子506bp位置和512bp位置存在两处SNPs，可分为506C-512C型，506C/ G-512C/G 型，506C-512C/G 型和 506C/G-512C 型 4 种类型。
[0070] 根据β AS外显子SNPs和1-4内含子上的SNPs，可分为94A/G-506C-512C、 94G-506C-512C、94A/G-506C/G-512C、94A-506C-512C、94A/G-506C/G-512C/G、 94G-506C-512C/G 和 94A/G-506C-512C/G 共 7 种基因型。
【主权项】
1. 一种检测甘草β -AS基因单核苷酸多态性的专用引物组，其特征在于，引物序列为2. -种检测甘草β -AS基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1 所述的引物。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其还包括：rTaq聚合酶；CldH2O ; 10XPCR Buffer ;dNTP。4. 如权利要求1所述的引物在检测或筛选β -AS基因单核苷酸多态性中的应用。5. 如权利要求2所述的试剂盒在检测或筛选β -AS基因单核苷酸多态性中的应用。6. -种检测甘草β -AS基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于， (1) 以甘草β -AS基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述引物，PCR扩增甘草β -AS 基因15个外显子和3个内含子片段； (2) 琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物质量； (3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物单链构象并进行测序分析。7. 如权利要求6所述的检测甘草β -AS基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤 (1)所述的PCR扩增的条件是基因组DNAl yL，10XPCR buffer3. 2yL，浓度为2. 5mmol/L 的 dNTP I. 6 μ L，浓度为 5 μ mol/L 的 Forward Primer 1.0 μ L，浓度为 5 μ mol/L 的 Reverse Primer I. 0 μ L，rTaq 0· 2 μ L，ddH2012. 0 μ L，共 20 μ I 〇8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（I)所述的PCR扩增的条件是：94°C预 变性 5min ;94°C变性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 个循环；72°C延伸 lOmin。9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述的琼脂糖凝胶电泳为1%的琼 脂糖凝胶电泳。10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3)所述的非变性聚丙烯酰胺电泳为 16非变性％聚丙烯酰胺凝胶电泳。
【文档编号】C12N15/11GK105886603SQ201510001163
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月5日
【发明人】刘春生, 臧艺玫, 乔晶, 李妍芃
【申请人】刘春生