Pkd2基因突变检测的扩增引物及检测方法
【专利摘要】本发明属于医学体外诊断技术，具体涉及常染色体显性多囊肾病致病基因PKD2突变检测的扩增引物及检测方法。所述扩增引物利用PKD2基因的序列信息设计4对PCR引物，通过长链PCR对PKD2进行靶向扩增，扩增区域包括全部外显子和大部分内含子序列，及部分5’非翻译区序列和3’非翻译区序列。所述方法将长链PCR靶向扩增结合最新发展的下一代测序技术，简化了靶向测序流程，提高了PKD2基因突变的检测范围和通量，缩短了检测周期，降低了成本。
【专利说明】
PKD2基因突变检测的扩增引物及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于医学体外诊断技术，具体涉及常染色体显性多囊肾病致病基因 PKD2 突变检测的扩增引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 成人多囊肾病（polycystic kidney disease，PKD)是最常见的遗传性肾病，人群 发病率约在1/400~1/1000,多为常染色体显性遗传，少部分为常染色体隐性遗传。常染 色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)主要表 现为双肾多发性进行性囊泡，引起肾脏结构和功能损害，是终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD)最常见的遗传病因，约占全部ESRD的10%，还可累及全身多个器官，如肝囊 月中、高血压、颅内动脉瘤等。
[0003] 遗传学研究表明六0?1?主要由？1(01和？1(02基因突变引起，大约80%~85%患者 的致病基因为PKD1，导致I型多囊肾病，10%~15%患者的致病基因为PKD2,导致II型多 囊肾病。由PKD2突变引起的II型多囊肾病患者与I型多囊肾病患者相比，症状出现晚，生 存时间长，发展为肾功能衰竭的危险率低，并发症少。对患者进行基因检测有助于明确诊 断、直系亲属预后判断，并为再次生育产前检测提供依据。
[0004] PKD2的基因标准参照序列为GeneBank ΝΜ_000297· 3, PKD2位于人4q21_23,基 因长68kb，含15个外显子，编码区长度2907bp。目前已报道应用于PKD2基因突变检测的 方法有PCR-单链构象多态性（简称PCR-SSCP)法、变性高效液相色谱（简称DHPLC)法和 Sanger测序法等，其中PCR-SSCP和DHPLC均属于突变筛查方法，可以提高检出突变的效率， 但两种方法存在的影响因素较多，结果不够稳定，准确性较低。Sanger测序是PKD2基因突 变检测的主要方法，常采用17对引物对PKD2的15个外显子进行扩增，其中外显子1因 GC 含量高，需要采用3对引物分段扩增，外显子2至15各需1对引物，虽然该方法是PKD2基 因突变检测的金标准，但Sanger测序工作量大、效率低、通量低，且对内含子内部的突变不 能进行检测。由于PKD2基因外显子数目较多，已鉴定出的PKD2基因突变散布于其基因的 各个区域，缺乏明显的突变热点，上述这些方法存在着突变检出率较低、耗时长等缺点。此 外，US7083915B2中也公开了 PKD2基因及其用途，CN1434130A中公开了一种常染色体显性 遗传型多囊肾病检测试剂盒，但是该试剂盒同样存在引物种类多、扩增序列较短，检测效率 低下的问题。上述现有技术中已经公开了的PKD2基因的相关信息均被本申请引用。
[0005] 下一代测序（next-generation sequencing，NGS)技术具有高通量、快速、准确和 成本低的优点，可实现多样本、多个基因、多外显子的同时检测，为临床单基因遗传病基因 诊断提供了新的手段。
[0006] Ion Torrent个体化基因组测序仪（PGM)是Life Technologies公司2010年底推 出的一款测序仪，Ion Torrent是基于半导体芯片的新一代革命性测序技术，该技术使用了 一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把4种 dNTP中的一种聚合到延伸中的DNA链上时，会释放一个氢离子，反应池中的pH值会发生变 化，位于池下的离子感受器感受到此信号，把化学信号直接转化为数字信号，从而读出DNA 序列。Ion Torrent测序平台原理不同于其它NGS技术，不属于核酸标记、荧光检测的生化 技术，相比其它测序技术，更灵活、简单、快速、经济和具有强大的扩展性。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及一种检测PKD2基因突变方法，所述方法利用PKD2基因的序列信息设 计4对PCR引物，应用长链PCR(Long-range PCR，LR-PCR)技术靶向扩增PKD2基因，扩增产 物片段化后建库，应用Ion Torrent个体化基因组测序仪进行高通量测序，通过生物信息学 分析获得PKD2基因突变信息。
[0008] 本发明提供了一种PKD2基因突变的检测方法，该方法包括下述步骤：1)采集受检 者标本，如外周血，提取基因组DNA ;2)应用基因组DNA作为模板，使用4对PCR引物，优选 的PCR引物如表1所示，采用LR-PCR技术对PKD2进行靶向扩增；3)对扩增的4个长片段 产物，进行纯化回收；4)将纯化的4个PCR产物进行混合，对得到的混合物进行DNA的片段 化处理；5)将打断的PCR产物混合物应用接头标签技术构建1个测序文库，对不同的受检 者基因组DNA样品可以通过添加不同的文库接头标签（Barcode Adapter)来区分各自的测 序文库；6)将得到的多个测序文库进行混合，利用下一代测序技术进行测序，优选的是Ion Torrent半导体测序技术，获得打断后的DNA序列；7)基于标签（Barcode)序列区分不同 的基因组DNA样品，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考 PKD2基因上，进行SNVs和Indels提取，排除多态性变异获得该标本PKD2基因突变信息。
[0009] 在本发明的检测方法中，所述PCR引物是用于特异性扩增PKD2的PCR引物，优选 的PCR引物如表1所示，即：SEQ ID N0 :1、SEQ ID N0 :2用于扩增PKD2基因外显子1至外 显子2基因序列，SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4用于扩增外显子3至外显子6基因序列，SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6用于扩增外显子7至外显子10基因序列，SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8用于扩增外显子11至外显子15基因序列，扩增片段1大小为12606bp，扩增片段2大 小为12297bp，扩增片段3大小为10573bp，扩增片段4大小为10559bp，4个片段总共扩增 46035bp的基因序列，覆盖PKD2基因67.6% (46kb/68kb)的区域。扩增区域包括全部外显 子，及部分5'非翻译区序列和3'非翻译区序列，扩增区域还包括内含子1、内含子3、内含 子4、内含子5、内含子7、内含子8、内含子9、内含子11、内含子12、内含子13和内含子14 序列，及部分内含子2、内含子6和内含子10序列。
[0010] 本发明的检测方法中，所述长链PCR (Long-range PCR，LR-PCR)又称长距离 PCR (Long-distance，LD-PCR)，由于4个LR-PCR扩增片段均大于10kb，且片段1包含高GC 区段，普通的PCR反应体系和条件很难成功，优选的PCR反应体系包含0. 5M甜菜碱，优选的 PCR反应条件采用2步法PCR。
[0011] 本发明的检测方法中，所述DNA片段化方法包括化学打断方法和物理打断方法， 其中所述化学方法包括传统酶切方法和新型转座酶法，所述物理打断方法包括超声打断方 法或机械打断方法。所述DNA打断后，获得长度150bp-300bp的片段。所述纯化回收方法 包括但不限于磁珠回收，也可以是电泳割胶回收。
[0012] 本发明的检测方法中，所述NGS技术包括但不限于Ion Torrent半导体测序技术， 也可以是双端测序（Paired end)技术，例如IlluminaMiseq测序仪和IlluminaHiseq 2000 测序仪，对不同的测序平台需采用不同的建库方法。
[0013] 本发明还提供了一组用于特异性扩增PKD2的PCR引物，该组PCR引物共4对，分 别如下：SEQ ID N0 :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID N0 :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID N0 :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8。
[0014] 本发明还提供了下述 4 对 PCR 引物：SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8 在检测 PKD2 基因突变中的用途。
[0015] 本发明还提供了一种用于检测PKD2基因突变的试剂盒，其中包括下述试剂：
[0016] (1)由 SEQ ID N0 :1、SEQ ID N0 :2、SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID勵：8分别编码的0嫩片段作为？〇?引物各1以1，引物 的浓度为l〇ymol/L;(2)10XGeneAmp High Fidelity PCR缓冲液5μ1 ;(3)10mmol/LdNTP 2 μ 1 ; (4) 5mol/L 甜菜碱 10 μ 1 ; (5) 5U/ μ 1 聚合酶混合物 1 μ 1 〇
[0017] 本发明还提供了一种靶基因突变的检测方法，其特征在于包括下述步骤：（1)从 受检标本中提取基因组DNA ; (2)应用基因组DNA作为模板，选取靶基因并设计4对PCR引 物，采用LR-PCR技术对靶基因进行靶向扩增，PCR反应体系包含0. 5M甜菜碱，PCR反应条 件采用2步法PCR ; (3)对扩增的4个长片段产物，进行纯化回收；(4)将纯化的4个PCR产 物进行混合，对得到的混合物进行DNA的片段化处理；其中所述DNA片段化方法包括化学 打断方法和物理打断方法，其中所述化学方法包括传统酶切方法和新型转座酶法，所述物 理打断方法包括超声打断方法或机械打断方法；（5)将打断的PCR产物混合物应用接头标 签技术构建1个测序文库，对不同的受检基因组DNA样品可以通过添加不同的文库接头标 签（Barcode Adapter)来区分各自的测序文库；(6)将得到的多个测序文库进行混合，利用 Ion Torrent半导体测序技术，获得打断后的DNA序列；（7)基于标签（Barcode)序列区分 不同的基因组DNA样品，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到 参考靶基因上，进行SNVs和Indels提取，排除多态性变异获得该标本的靶基因的突变信 息。
[0018] 发曰月的有益效果
[0019] 首先，本发明基于LR-PCR靶向扩增技术，利用PKD2基因的序列信息特异性地设计 了 4对PCR引物，并改良了扩增反应体系中的添加剂，新方法扩增所得到的序列的所有外显 子和所测内含子覆盖率达到100%，并显示高的测序深度，且测序深度均匀性好，达到了理 想的扩增效果；而按照常规方式设计的引物和扩增反应体系不能达到该方法下扩增长DNA 片段的理想的技术效果。
[0020] 其次，本发明在同一PCR反应体系和条件下，仅用4个PCR反应可以扩增获得PKD2 基因全部外显子和大部分内含子序列，与Ampliseq技术和其它目标区域捕获技术相比，操 作更为简单，成本较低，而且所检测的基因序列更长，有助于提高致病突变的检出率。
[0021] 最后，本发明还将LR-PCR靶向扩增技术结合最新发展的下一代测序技术，简化了 靶向测序的流程，提高了 PKD2基因突变检测的范围和通量，缩短了检测周期，降低了成本。
【附图说明】
[0022] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
[0023] 图1为LR-PCR扩增结果图，琼脂糖凝胶电泳显示4个PKD2基因扩增片段，PCR产 物为一系列片段大小l〇kb-13kb的单一条带，其中泳道Μ为分子量标记物（λ -EcoT14I/Bgl II digest，Takara公司），泳道1-4分别为LR-PCR扩增片段1-4的电泳结果。
[0024] 图2为Ion Torrent测序文库的Agilent BioAnalyzer 2100分析结果的示意图， 4个LR-PCR扩增产物片段化后进行文库制备，Agilent BioAnalyzer 2100分析显示文库片 段大小为150bp-300bp，平均大小为220bp。
[0025] 图3为PKD2基因 Ion Torrent测序的覆盖深度和覆盖率的示意图，图中显示所有 外显子平均覆盖深度达到300 X，所有外显子覆盖率为100%。
[0026] 图4为PKD2基因 Ion Torrent测序的IGV视图，图中显示PKD2外显子1至外显 子15间的区域，所有外显子和所测内含子覆盖率达到100%，并显示高的测序深度，且测序 深度均匀性好。
[0027] 图5为PKD2基因突变检测阳性结果的Ion Torrent测序的IGV视图，图中显示的 序列为PKD2基因正向序列，每个横条为一条测序结果，浅灰色横条代表正向读序，深灰色 横条代表反向读序，黑色短线代表该位点c. 2046_2049delTACT微小缺失突变。
【具体实施方式】
[0028] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本 发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0029] 在本发明的实施例中，采用了 LR-PCR靶向扩增联合Ion Torrent半导体测序的检 测方法，该方法以基因组DNA为模板，采用LR-PCR技术靶向扩增PKD2基因目标区域，PCR产 物片段化成短序列后进行Ion Torrent PGM文库制备和测序，对测序结果进行生物信息学 分析，获得PKD2基因突变信息。
[0030] 实施例1
[0031] 基因组DNA提取
[0032] 采集受检者外周血2ml，置于EDTA抗凝管中。取EDTA抗凝外周血标本0.2ml，按 全血DNA提取试剂盒说明书提取DNA。DNA浓度及纯度用Nanodrop 2000光度计进行分析， 提取的基因组DNA准备做下一步LR-PCR的模板用。
[0033] 实施例2
[0034] LR-PCR 扩增
[0035] 根据PKD2基因的序列信息设计4对PCR引物，采用GeneAmp High Fidelity PCR System进行LR-PCR，共扩增4个大片段序列，分别为片段1、片段2、片段3和片段4,引物序 列和扩增产物大小如表1所示。PCR反应总体积为50 μ 1，包括lOXGeneAmp High Fidelity PCR 缓冲液 5 μ 1，10mmol/LdNTP 2 μ 1，10 μ mol/L 上、下游引物各 1 μ 1，5mol/L 甜菜碱 10 μ 1，5U/ μ 1聚合酶混合物1 μ 1，20ng/ μ L DNA模板5 μ 1，超纯水补足至50 μ 1 〇 PCR循 环参数：95°C变性 2min ;94°C 20sec，68°C 14min，共 35 个循环；最后 72°C延伸 10min。PCR 反应在 Veriti 96-well Thermal Cycler PCR 仪（美国 ABI 公司）上完成。 表1，扩增PKD2基因的LR-PCR引物
注：F为上游引物，R为下游引物，表中的PCR引物序列依次为：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8〇
[0036] LR-PCR完成后，取5 μ 1 PCR产物经0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测。图1显示了 4 个扩增片段大小和理论值一致，并且目标条带很清晰，没有非特异性扩增。其它基因组DNA 样品的扩增结果与此类似。
[0037] 实施例3
[0038] PCR产物纯化和混合
[0039] 采用普通DNA产物纯化试剂盒（TIANGEN生物）对PCR产物进行纯化，纯化产物采 用Qubit 2. 0荧光光度计进行定量，将纯化后的4个PCR产物按等摩尔比进行混合，再次用 Qubit 2. 0荧光光度计进行定量。
[0040] 实施例4
[0041] PCR产物片段化处理
[0042] 对得到的1 μ g混合PCR产物采用NEBNextdsDNA片段化酶（Fragmentase)(美 国NEB公司）进行片段化，室温反应15~20min，并采用AgencourtAMPure XP磁珠（美国 Beckman Coulter 公司）纯化。
[0043] 实施例5
[0044] 文库构建
[0045] 米用 Ion Xpress Plus Fragment Library 试剂盒（美国 Life Technologies 公 司）和 Ion Xpress Barcode Adapters 试剂（美国 Life Technologies 公司）进行模板 制备，对片段化产物加上文库接头（Barcode Adapter)，具体操作流程详见试剂说明书，并 用 Agilent BioAnalyzer 2100(美国 Agilent 公司）分析制备质量。图 2 为 Ion Torrent 测序文库的Agilent BioAnalyzer 2100分析结果，4个LR-PCR扩增产物片段化后进行文 库制备，Agilent BioAnalyzer 2100分析显不文库片段大小为150bp_300bp，平均大小为 220bp〇
[0046] 实施例6
[0047] Ion Torrent PGM 测序
[0048] 乳液 PCR 和 ISPs 富集：采用 Ion PGM Xpress Template 200 Kit 在 Ion OneTouch (Life Technologies)上进行乳液PCR，对模板阳性磁珠颗粒（Ion SphereParticles，ISPs)在 Ion OneTouch ES(LifeTechnologies)上进行富集。米用 Ion PGM Sequencing 200 Kit 及 Ion Torrent316 芯片在 Ion Torrent PGM测序仪上进行测序， 共500次核酸流动注射（flows)。
[0049] 实施例7
[0050] 数据分析
[0051] 采用Ion Torrent Suite ν3· 0软件进行Ion Torrent数据提取、序列比对及SNVs 和Indels提取，得到的SNVs和Indels经dbSNP 138数据库过滤后，检索千人基因组数据 库，获得千人基因组最小等位基因频率，排除多态性变异，可疑致病突变经人类基因突变数 据库（The Human Gene Mutation Database，HGMD)、莱顿开放式变异数据库（Leiden Open Variation Database，L0VD)等数据库及美国国立医学图书馆Pubmed相关文献，匹配已报 道的致病位点，对原始BAM文件应用Integrative Genomics Viewer(IGV)软件进行比对 读序（reads)的可视化分析。图3和图4为1例典型的Ion Torrent测序检测结果。图3 显示PKD2基因 Ion Torrent测序的覆盖深度和覆盖率，显示所有外显子平均覆盖深度达到 300X，所有外显子覆盖率为100%。图4显示PKD2基因 Ion Torrent测序的IGV视图，显 示PKD2外显子1至外显子15间的区域，所有外显子和所测内含子覆盖率达到100%，并显 示高的测序深度，且测序深度均匀性好。
[0052] 通过本发明检测了 10例多囊肾患者，发现了 1例PKD2突变检测阳性患者，图5显 示这例PKD2突变检测阳性结果，该患者存在c. 2046_2049delTACT杂合突变，该突变为移 码突变，导致氨基酸序列发生P. Asp682AspfSX5突变，所患疾病为II型多囊肾病。得到的 PKD2基因突变结果与Sanger测序的结果是一致的，说明本发明的方法是可行的。
【主权项】
1. 一种PKD2基因突变的检测方法，其特征在于包括下述步骤： 1) 米集受检者标本，如外周血，提取基因组DNA 2) 应用基因组DNA作为模板，使用4对PCR引物：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8 ;采 用LR-PCR技术对PKD2进行靶向扩增； 3) 对扩增的4个长片段产物，进行纯化回收； 4) 将纯化的4个PCR产物进行混合，对得到的混合物进行DNA的片段化处理； 5) 将打断的PCR产物混合物应用接头标签技术构建1个测序文库，对不同的受检者基 因组DNA样品可以通过添加不同的文库接头标签来区分各自的测序文库； 6) 将得到的多个测序文库进行混合，利用下一代测序技术进行测序，优选的是Ion Torrent半导体测序技术，获得打断后的DNA序列； 7) 基于标签序列区分不同的基因组DNA样品，通过生物信息学分析将单个样品测序获 得的DNA序列片段比对到参考PKD2基因上，进行SNVs和Indels提取，排除多态性变异获 得该标本PKD2基因突变信息。2. 权利要求1所述的方法，其中所述PCR引物是用于特异性扩增PKD2的PCR引物，优 选的 PCR 引物为 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 ;其中： 片段1通过SEQ ID NO: 1作为上游引物、SEQ ID NO :2作为上游引物，扩增外显子1至 外显子2基因序列，产物长度12606bp ; 片段2通过SEQ ID NO :3作为上游引物、SEQ ID NO :4作为上游引物，扩增外显子3至 外显子6基因序列，产物长度12297bp ; 片段3通过SEQ ID NO :5作为上游引物、SEQ ID NO :6作为上游引物，扩增外显子7至 外显子10基因序列，产物长度10573bp ; 片段4通过SEQ ID NO :7作为上游引物、SEQ ID NO :8作为上游引物，扩增外显子11 至外显子15基因序列，产物长度10559bp ; 所述的外显子均是PKD2基因的外显子，4个片段总共扩增46035bp的基因序列，覆盖 PKD2 基因 67·6% (46kb/68kb)的区域。3. 权利要求1所述的方法，其中所述LR-PCR中，优选的PCR反应体系包含0. 5M甜菜 碱，优选的PCR反应条件采用2步法PCR。4. 权利要求1所述的方法，其中所述DNA片段化方法包括化学打断方法和物理打断方 法，其中所述化学方法包括传统酶切方法和新型转座酶法，所述物理打断方法包括超声打 断方法或机械打断方法。5. 权利要求1所述的方法，其中所述下一代测序技术包括但不限于Ion Torrent半 导体测序技术，也可以是双端测序（Paired end)技术，例如IlluminaMiseq测序仪和 IlluminaHiseq2000 测序仪。6. -组用于特异性扩增PKD2的PCR引物，该组PCR引物共4对，分别如下：SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID N0:2;SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8。7. 权利要求6所述的PCR引物在检测PKD2基因突变中的用途。8. -种用于检测PKD2基因突变的试剂盒，其中包括下述试剂： (1) 由 PCR 引物共 4 对，分别如下：SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8,每种 PCR 引物各 1 μ 1，引物的浓度为10 ym〇l/L ; (2) 10XGeneAmp High Fidelity PCR 缓冲液5μ1 ; (3) lOmmol/LdNTP 2 μ I ； (4) 5mol/L 甜菜碱 10 μ I ; (5) 5U/ μ 1聚合酶混合物1 μ 1。9. 一种靶基因突变的检测方法，其特征在于包括下述步骤： (1) 从受检标本中提取基因组DNA ; (2) 应用基因组DNA作为模板，选取靶基因并设计4对PCR引物，采用LR-PCR技术对靶 基因进行靶向扩增，PCR反应体系包含0. 5M甜菜碱，PCR反应条件采用2步法PCR ; (3) 对扩增的4个长片段产物，进行纯化回收； (4) 将纯化的4个PCR产物进行混合，对得到的混合物进行DNA的片段化处理；其中所 述DNA片段化方法包括化学打断方法和物理打断方法，其中所述化学方法包括传统酶切方 法和新型转座酶法，所述物理打断方法包括超声打断方法或机械打断方法； (5) 将打断的PCR产物混合物应用接头标签技术构建1个测序文库，对不同的受检基 因组DNA样品可以通过添加不同的文库接头标签（Barcode Adapter)来区分各自的测序文 库； (6) 将得到的多个测序文库进行混合，利用Ion Torrent半导体测序技术，获得打断后 的DNA序列： (7) 基于标签（Barcode)序列区分不同的基因组DNA样品，通过生物信息学分析将单个 样品测序获得的DNA序列片段比对到参考靶基因上，进行SNVs和Indels提取，排除多态性 变异获得该标本的靶基因的突变信息。
【文档编号】C12N15/11GK105886605SQ201510097221
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年3月5日
【发明人】许争峰, 马定远, 胡平, 蒋涛
【申请人】南京市妇幼保健院