焦磷酸测序法快速检测华法林代谢酶基因多态性的试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种焦磷酸测序法快速检测华法林代谢酶基因多态性的试剂盒，该试剂盒中包含了3对特异扩增引物及3条测序引物，3对特异扩增引物为CYP2C9基因、VKORC1基因两种基因，其中CYP2C9基因含2对引物，3条测序引物具体涉及3个单核苷酸多态性，即CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC1(?1693)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～9所示。本发明检测方法不仅灵敏度高，而且结果直观，判读更加简单、准确、快速，可以实现准确、快捷、高通量华法林代谢酶基因的检测，在个性化医疗上有较大的推广应用价值。
【专利说明】
焦磷酸测序法快速检测华法林代谢酶基因多态性的试剂盒及 其应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种焦磷酸测序法快速检测华法林代谢 酶基因多态性的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 华法林是临床常用治疗血栓性疾病的一种香豆素类口服抗凝药，具有抗凝和溶栓 的双重作用。华法林的抗凝治疗指数范围狭窄，如果剂量不足则达不到治疗效果，剂量稍过 量则会引起出血，重者危及病人生命。然而，华法林血浆药物浓度和疗效存在明显的个体差 异和种族差异，有研究表明，不同患者使用抗凝血药物华法林的剂量可以相差20倍，亚洲人 的维持剂量比白种人要低30 %~40 %。因此，如何在临床上安全、合理使用华法林长期以来 是许多研究者关注的重点和难点。
[0003] 近年来，随着药物基因组学的发展和华法林药理作用分子机制的阐明，单核苷酸 基因多态性在华法林用量个体差异中的作用越来越受到人们的重视。目前，已知与华法林 的药效学和药动学相关的基因达30余种，其中细胞色素 P4502C9基因 （Cytochrome P4502C9，CYP2C9)和维生素 K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因 （vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VK0RC1)的基因多态性是影响华法林用量个体差异最主要 的两个遗传因素。CYP2C9即是华法林最主要的代谢酶。到目前为止，已发现的CYP2C9的等位 基因有30种，其中以*1(野生型）、*2(厶以144〇78,5即^1799853)、*3(1163591^11，5即 rsl057910)最为常见。携带有变异性等位基因的患者，其华法林代谢酶的活性明显低于野 生型，并且其出血的危险性增加2-3倍。维生素 K环氧化物还原酶(VK0R)是华法林作用的靶 蛋白。华法林通过抑制VK0R，使无活性的氧化型（还氧化物型)VK无法还原为有活性的还原 型(氢醌型)VK而起到抗凝作用。多个VK0RC1的SNP位点被发现与华法林用量个体差异相关， 该基因目前主要研究的位点是_1639G>A(SNP rs9923231)，携带-1639G的患者，其对华法林 的需求量较携带-1639AA的患者高。Geisen等研究表明，VK0RC1-1639G/A基因多态性存在民 族差异，其基因多态性是民族之间华法林剂量差异的主要原因。
[0004] 目前检测基因单核苷酸基因多态性的技术方法有限制性片段长度多态性分析 (Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱（Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)、等位基因特异性寡核苷酸（Allele-specif icoligonucleotide，AS0)杂交、寡核苷酸微阵列（Oligonucleotide microarrays)， 等位基因特异性焚光探针及Sanger测序等，其中以Sanger测序法最为普遍。然而，这些方法 耗时耗力或成本较高。
[0005] Pyrosequencing (焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因 型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。本试剂 盒借用焦磷酸测序技术，开发了一种焦磷酸测序技术检测华法林代谢酶基因多态性的试剂 盒及方法，该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符 合临床大样本检测要求;在个性化医疗上有较大的推广应用价值，也可以将该平台运用于 其他疾病相关基因多态性检测。
【发明内容】
[0006] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种操作简便、成本低廉、快捷、准确的检测 华法林代谢酶基因多态性的试剂盒。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的应用。
[0008] 为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009] 检测华法林代谢酶基因多态性的引物，包括3对特异扩增引物及3条测序引物，3对 特异扩增引物为CYP2C9基因、VK0RC1基因两种基因，其中CYP2C9基因含2对引物，3条测序引 物具体涉及3个单核苷酸多态性，即0￥?209*2、0￥?209*3、￥1(01^1(-1693)，具体的核苷酸序 列如下：
[0010] (1)扩增CYP2C9*2基因的引物:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
[0011] (2)扩增CYP2C9*3基因的引物:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0012] ⑶扩增VK0RC1基因的引物:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0013] 其中，下游引物SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的5'端分别用生物素标 记；
[0014] CYP2C9*2测序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；
[0015] CYP2C9*3测序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
[0016] VK0RC1(-1693)测序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0017] 上述检测华法林代谢酶基因多态性的引物在制备华法林代谢酶基因多态性检测 试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0018] -种检测华法林代谢酶基因突变的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
[0019] (1 )DNA提取试剂，购自QIAGEN公司；
[0020] (2)反应液:PCR Buffer，SEQ ID N0:1 ~6所示的PCR引物 10ymol/L，MgCl225mmol/ L，dNTPs 10mmol/L，Taq DNA聚合酶5U/yL，甘油；
[0021] (3)单链纯化试剂：体积分数为75%乙醇水溶液，(K2mol/L Na0H，10m mol/L pH7.6TriS-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
[0022] (4)测序试剂:DNA聚合酶，SEQ ID N0:7~9所示的测序引物10ymol/L，ATP硫酸化 酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。
[0023] 上述检测华法林代谢酶基因突变的试剂盒在利用焦磷酸测序技术检测华法林代 谢酶基因突变中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0024] -种焦磷酸测序法检测华法林代谢酶基因突变的方法，该方法包括如下步骤：
[0025] (1)提取标本组织中的基因组DNA;
[0026] (2)以步骤（1)中所得基因组DNA为模板，SEQ ID N0:1~6所示的核苷酸序列为引 物，分别 PCR 扩增 CYP2C9*2、CYP2C9*3、VK0RC1 基因片段；
[0027] (3)将步骤(2)得到的基因片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
[0028] (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
[0029] (5)测序结果分析。
[0030] 步骤(2)中，所述的PCR扩增，
[0031] PCR体系为50μ1，其中DNA模板2yL，10XPCR buffer 5yL，MgCl24yL，dNTP3yL，lT 游引物每对各取0.15yL混合于一管，Taq DNA聚合酶0.3yL，甘油2.5yL，加水补充至50yL;
[0032] PCR 条件为：94°C 5min; 94°C 30s，60 °C 30s，72 °C 30s，35 个循环；72 °C lOmin。
[0033] 有益效果:本发明提供了一种焦磷酸测序技术检测华法林药物代谢酶相关基因突 变试剂盒及其应用。应用焦磷酸测序技术可以快速准确检华法林药物代谢酶相关基因的多 态性，可广泛应用于临床上个体化医疗方案制定及预防。与现有技术相比，其应用焦磷酸测 序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程;具有高通量、低成 本等特点;PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需 样品量小。在个性化医疗上有较大的推广应用价值，也可以将该平台运用于其他疾病相关 基因多态性检测。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明CYP2C9*2、CYP2C9*3、VK0RC1 (-1639)三个目的基因片段单管PCR扩增 后焦磷酸测序的理论测序结果图。
[0035] 图2为本发明CYP2C9*2、CYP2C9*3、VK0RC1 (-1639)三个目的基因片段单管PCR扩增 后焦磷酸测序的野生型测序结果图。
【具体实施方式】
[0036]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0037]实施例1:试剂。
[0038] (l)DNA 提取试剂：
[0039] 购自 QIAGEN 公司。
[0040] (2)反应液：
[0041 ] PCR Buffer:购自美国Fermentas公司；
[0042]引物SEQ ID N0:1~6,由上海英俊生物科技有限公司合成；
[0043] MgCl2:购自美国Fermentas 公司；
[0044] 0·2mM dNTPs:购自美国Fermentas公司；
[0045] 2U/yL Taq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
[0046] (3)单链纯化试剂：
[0047] 75% (v/v)乙醇溶液:购于杭州长征化学试剂有限公司；
[0048] 0.2mol/L NaOH:购于上海试四赫维化工有限公司；
[0049] 10mmol/L Tris_Acetate(pH 7.6):Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于 杭州化学试剂有限公司；
[0050] 结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化 学试剂有限公司），2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司），lmM EDTA(购于杭州化学试 剂有限公司），〇· l%(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司）组成；
[0051 ]退火缓冲液：由20mM Tris_Acetate(pH 7.6) (Tris-base购于美国Sigma公司，无 水乙酸购于杭州化学试剂有限公司），2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；
[0052] 亲和素标记的磁珠（购于GE healthcare Bioscience AB)〇
[0053] (4)测序试剂：
[0054] 测序引物SEQ ID N0:7~9,由上海英俊生物科技有限公司合成；
[0055] DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶:购于QIAGEN公司；
[0056] 底物APS和荧光素:购于QIAGEN公司；
[0057] 四种dNTP(dATP S，dTTP，dCTP，dGTP):购于QIAGEN公司。
[0058] 实施例2:检测方法。
[0059] 仪器：Bio-Rad S1000 PCR仪，Beckman Microfuge 22R台式微量冷冻离心机， QIAGEN PyroMark Q96 ID测序仪。
[0060] (1)提取全血标本中的DNA:
[0061] 参考公开的文献，采用相应的商品化DNA抽提试剂盒，按照试剂盒说明书制备血液 中基因组DNA，作为PCR反应模板备用。
[0062] DNA溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ ul视为合格，保存核酸标本至4°C冰箱；
[0063] (2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；
[0064] 其中，PCR扩增采用50μ1 体系，其中DNA模板2yL，10XPCR buffer 5yL，MgCl2 (25mmo 1/L) 4yL，dNTP (1 Ommo 1/L) 3yL，1 Ομπιο 1/L浓度上下游引物（SEQ ID NO: 1-6)每对各取 0 · 15yL混合于一管，Taq酶（5U/yL) 0 · 3yL，甘油2 · 5yL，加水补充至50yL。反应条件94 °C 5min; 94。〇3〇8,6〇1€3〇8,721€3〇8,35个循环；72。(：1〇11^11。
[0065] (3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：
[0066] a.在使用前，保证所有溶液都达到室温；
[0067] b.在PSQ 96板中加入45μ1退火缓冲液，然后每孔加入测序引物SEQ ID N0:7-9 (10uM)luL；
[0068] c.使用漩涡震荡仪混匀亲和素标记的磁珠，将需要使用的磁珠总量(每样本3μυ 转移到一个Eppendorf管中，在磁珠中加入结合缓冲液，使得平均每个样品约有50yL的体 积，将混合物混匀；
[0069] d.将以上混合物加入PCR产物（50yL反应体积）中，每样本50yL，将PCR产物在常温 下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；
[0070] e.在真空准备工作站中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70%乙醇、洗涤液 和120ml变性缓冲液；
[0071] f.打开真空准备工作站的栗，将抽真空装置在高纯水中清洗30秒，移到PCR板中， 抓取磁珠，放入70%乙醇中5秒，然后移到变性缓冲液中5秒，再移到洗涤液中清洗10秒，把 吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉栗，将抽真空装置放入含有 测序引物的板中，摇动，释放磁珠；
[0072] g.使用高纯水清洗抽真空装置。
[0073] h.将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80°C2分钟，再冷却到室温后 放入测序仪中。
[0074] (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
[0075] (5)测序结果读取基因型多态性。
[0076]将本发明所述的试剂盒用于抽取40例临床患者血液样本的核酸，检测所述的华法 林代谢酶基因多态性，检测结果与基因芯片法结果进行比对，检测结果如下表：
[0080]对上述 40 例标本 0￥?209*2(：/1'、0￥?209*34/(：、￥1(01?(：1(-1639)私/6单管同时多个 SNP位点检测与分别进行的焦磷酸测序及Sanger测序结果比较，符合率为100%。我们在对 40例检测标本中，VK0RC1(-1639)*G>A中AA为34例，GA为6例，未出现GG，CYP2C9*2C>T及 CYP2C9*3A>G未发现突变。
[0081]综上所述，本发明可以于单管PCR产物中同时检测出三个不同的SNP位点，且三个 位点相互之间不存在着干扰。焦磷酸测序是一种准确、可靠及高通量的检测技术，15分钟可 检测96个样品，并可同时测定多态性位点附近的多个碱基。本试剂盒建立的单管PCR-Pyrosequencing同时检测CYP2C9*2、CYP2C9*3及VK0RC1(-1693)多态性，更具有节省操作时 间与成本的优势;根据基因分型指导华法林初始剂量的选择，将减少患者反复抽血检测、降 低抗凝出血的风险。这在个性化医疗上有较大的推广应用价值，也可以将该平台运用于其 他疾病相关基因多态性检测。
【主权项】
1. 检测华法林代谢酶基因多态性的引物，其特征在于，包括如下引物： (1) 扩增CYP2C9*2基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； (2) 扩增CYP2C9*3基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； (3) 扩增VKORCl基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； 其中，下游引物SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的5'端分别用生物素标记； CYP2C9*2测序引物的核苷酸序列如SEQIDN0:7所示； CYP2C9*3测序引物的核苷酸序列如SEQIDN0:8所示； VKORCl测序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。2. 权利要求所述的检测华法林代谢酶基因多态性的引物在制备华法林代谢酶基因多 态性检测试剂中的应用。3. -种检测华法林代谢酶基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂： (1) DNA提取试剂； (2) 反应液:PCR Buffer，SEQ ID N0:1 ~6所示的PCR引物 10ymol/L，MgCl2 25mmol/L， dNTPs 10mmol/L，Taq DNA聚合酶5U/yL，甘油； (3) 单链纯化试剂：体积分数为75%乙醇水溶液，0.2mol/L Na0H，10m mol/L pH 7.6 Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液； (4) 测序试剂:DNA聚合酶，SEQ ID NO: 7~9所示的测序引物1 Ομπιο I /L，ATP硫酸化酶，荧 光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。4. 权利要求3所述的检测华法林代谢酶基因突变的试剂盒在利用焦磷酸测序技术检测 华法林代谢酶基因突变中的应用。5. -种焦磷酸测序法检测华法林代谢酶基因突变的方法，其特征在于，该方法包括如 下步骤： (1) 提取标本组织中的基因组DNA; (2) 以步骤（1)中所得基因组DNA为模板，SEQ ID NO: 1~6所示的核苷酸序列为引物，分 另IjPCR 扩增 CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORCl 基因片段； (3) 将步骤(2)得到的基因片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化； (4) 将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序； (5) 测序结果分析。6. 根据权利要求5所述的一焦磷酸测序法检测华法林代谢酶基因突变的方法，其特征 在于，步骤(2)中，所述的PCR扩增， PCR体系为50μ1，其中DNA模板2yL，10XPCR buffer 5yL，MgCl2 4yL，dNTP 3yL，上下游 引物每对各取〇. 15yL混合于一管，Taq DNA聚合酶0.3yL，甘油2.5yL，加水补充至50yL; PCR 条件为：94 °C5min; 94 °C 30s，60 °C 30s，72 °C 30s，35 个循环；72 °C10min。
【文档编号】C12N15/11GK105886606SQ201510884985
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年12月4日
【发明人】任绪义, 虞闰六, 施宏
【申请人】长沙迪安医学检验所有限公司