一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法。按照以下方法制得：1）集新鲜血液后，迅速置于4℃冷冻离心机中，转速为800~900rpm/min，离心时间为4~6min，去除血细胞及其它内容物，用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中；2）取1）获取的上清液，迅速置于4℃冷冻离心机中，转速为1800~2000rpm/min，离心时间为8~12min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中；3）取2）获取的上清液，迅速置于液氮保存。本发明通过优化鸡血清制备过程中的离心转速、温度和时间，获得了高质量的鸡血清，满足高通量测序要求，为鸡血清miRNA高通量测序等研究提供了前提。
【专利说明】
一种适于鸡m i RNA高通量测序的血清制备方法
技术领域
[0001]
本发明涉及一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002]
微小RNA(microRNA)是一类长度约为18nt?25nt的内源性非编码单链小分子RNAt3HiiRNA在转录后水平调控基因表达，广泛参与一系列生命发育事件的调节。随着研究的不断深入，还发现血清中也存在miRNA(称之为循环miRNA，Circulating miRNA)，是机体生物学和生理学状态的精细监测者。特异性的血清miRNA表达谱在人类及动物疾病早期监测、诊断和预后观察中具有较好的应用前景，展现出其作为一种新型生物标志物的巨大潜能。
[0003]研究发现血清miRNA可以作为鸡性成熟启动度量、禽病诊断等领域的潜在生物学标志物。新一代高通量测序是鉴定血清miRNA表达谱的重要手段，制备高质量的血清miRNA是其关键前提。然而，在研究过程中发现若采用常规方法制备鸡血清，血清中的循环miRNA易降解，不能用于后续的高通量测序及相关实验，已成为鸡血清miRNA研究的瓶颈。
【发明内容】
[0004]本发明针对上述缺陷，通过优化血清制备流程，获得了高质量的鸡血清，并通过荧光光度计检测和gga-let_7a RT-qPCR质检发现血清循环miRNA保存完好，满足高通量测序要求。
[0005]为此本发明采用的技术方案是:按照以下方法制得:
1)集新鲜血液后，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为800?900rpm/min，离心时间为4?6min，去除血细胞及其它内容物，用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中；
2)取I)获取的上清液，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为1800?2000rpm/min，离心时间为8?12min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中；
3)取2)获取的上清液，迅速置于液氮保存。
[0006]要求Ih内完成整个血清制备过程。
[0007]所述I)步骤中，转速为820rpm/min。
[0008]所述2)步骤中，转速为1860rpm/min。
[0009]所述I)步骤中，离心时间为5min。
[0010]所述2)步骤中，离心时间为lOmin。
[0011 ]本发明的优点是:本发明通过优化鸡血清制备过程中的离心转速、温度和时间，获得了高质量的鸡血清，并通过荧光光度计检测和gga-let-7a RT-qPCR质检发现血清中的循环miRNA保存完好，满足高通量测序要求，为鸡血清miRNA高通量测序等研究提供了前提。
【附图说明】
[0012]图1为实施例1的质检图。
[0013]图2为实施例2、3、4、5的质检图。
【具体实施方式】
[0014]本发明的目的制定一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法。本发明的技术方案是:通过优化鸡血清制备过程中的离心转速、温度和时间，获得了高质量的鸡血清，并通过荧光光度计检测和gga-let_7a RT-qPCR质检发现血清中的循环miRNA保存完好，满足高通量测序要求。所采用的技术方法以及所获得的结果如下所示:
1.1血液采集
无酶管收集鸡翅静脉血样2?2.5ml。
[0015]1.2血清制备实施实例1:
(I)采集新鲜血液后，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为800?900rpm/min，离心时间为5min，去除血细胞及其它内容物。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中。
[0016](2)取(I)获取的上清液，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为1800?2000rpm/min，离心时间为1min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中。
[0017](3)取(2)获取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih内完成整个血清制备过程。
[0018]实施实例2:
(I)采集新鲜血液后，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为700?800rpm/min，离心时间为5min，去除血细胞及其它内容物。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中。
[0019](2)取(I)获取的上清液，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为1800?2000rpm/min，离心时间为1min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中。
[0020](3)取(2)获取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih内完成整个血清制备过程。
[0021]实施实例3:
(I)采集新鲜血液后，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为900?1000rpm/min，离心时间为5min，去除血细胞及其它内容物。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中。
[0022](2)取(I)获取的上清液，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为1800?2000rpm/min，离心时间为1min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中。
[0023](3)取(2)获取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih内完成整个血清制备过程。
[0024]实施例4:
(I)采集新鲜血液后，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为800?900rpm/min，离心时间为5min，去除血细胞及其它内容物。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中。
[0025](2)取(I)获取的上清液，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为1600?1800rpm/min，离心时间为1min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中。
[0026](3)取(2)获取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih内完成整个血清制备过程。
[0027]实施例5:
(I)采集新鲜血液后，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为800?900rpm/min，离心时间为5min，去除血细胞及其它内容物。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中。
[0028](2)取(I)获取的上清液，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为2000?2200rpm/min，离心时间为1min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中。
[0029](3)取(2)获取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih内完成整个血清制备过程。
[0030]1.3质量检测
(I)取出液氮保存的血清，按照常规SmalI RNA提取试剂盒操作说明，提取血清小RNA。
[0031](2)分光光度计检测。采用B1analyzer 2100系统检测样品的RIN值和A260/A280值。
[0032](3)gga-let-7a RT-PCI^i"增检测。选用gga_let_7a作为质检引物，每个逆转录反应取样品量为5μ1，总反应体系为10μ1。以1.Ομ?/孔的cDNA为模板，进行Real-time PCR，反应体系为20μ1，复孔为两个，同时做引物NTC对照(模板以常规方法制备血清提取的小RNA逆转录产物代替)，进行RT-PCR检测。
[0033]结果:通过优化鸡血清制备过程中的离心转速、温度和时间，获得了高质量的鸡血清，分光光度计检测结果表明:
实施实例I样品的RIN > 8.0，A260/A280>2.1，gga-let_7a RT-qPCR质检显示结果良好(见附图1)。
[0034]实施实例2、3、4、5样品的RIN 值为 4.0?5.0，Α260/Α280 值为1.5~1.6，gga-let-7aRT-qPCR质检显示miRNA已降解(见附图2)。
[0035]基于上述结果，表明应用实施实例I方法制备的鸡血清，血清中循环miRNA保存完好，质量满足高通量测序要求，为从鸡血清中提取miRNA开展相关研究提供了必要的前提。
【主权项】
1.一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法，其特征在于，按照以下方法制得: 1)集新鲜血液后，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为800?900rpm/min，离心时间为4?6min，去除血细胞及其它内容物，用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中； 2)取I)获取的上清液，迅速置于4°C冷冻离心机中，转速为1800?2000rpm/min，离心时间为8?12min，去除残留的血细胞。2.用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中； 3 )取2 )获取的上清液，迅速置于液氮保存。3.根据权利要求1所述的一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法，其特征在于，要求Ih内完成整个血清制备过程。4.根据权利要求1所述的一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法，其特征在于，所述I)步骤中，转速为820 rpm/min。5.根据权利要求1所述的而一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法，其特征在于，所述2)步骤中，转速为1860 rpm/min。6.根据权利要求1所述的一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法，其特征在于，所述I)步骤中，离心时间为5min。7.根据权利要求2所述的一种适于鸡miRNA高通量测序的血清制备方法，其特征在于，所述2)步骤中，离心时间为lOmin。
【文档编号】C12Q1/68GK105886630SQ201610295800
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】朱云芬, 韩威, 李国辉, 王洪志, 张会永, 殷建玫, 盛中伟, 邹剑敏, 王克华, 苏军, 苏一军, 王国俊
【申请人】江苏省家禽科学研究所